苍术炭疽病病原学及其致病机制研究.docx

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1、湾饯宠卡大斗硕士考佐卷攵苍术炭疽病病原学及其致病机制研究目录第一章植物炭疽病及其致病机制研究进展第二章苍术炭疽病发生调查及病原苜鉴定第三章苍术炭疽病苗生物学特性第四章苍术炭疽病首附着胞特性及其与环境因素关系4.1 苍术炭疽病菌附若胞的诱导及形成条件4.2 环境因子对苍术炭疽病菌致病性影响第五章苍术炭疽病菌细鹿壁降解器活性分析及其致病作用4.1 活体外细胞里降解唧的提取、纯化与活性分析（细胞壁降解前产陶条件测定）4.2 细胞壁降解前致病作用4.3 活体内细胞壁降解的的提取,纯化与活性分析（CwDES在苍术炭疽病致病过程中的含址变化）第五章细胞壁降解酹在致病过程中的作用及其调控机制5.1 苍术炭疽

2、病菌总RNA提取5.2 CDNA5.3 PG,P1.基因在苍术炭疽病致病过程中的差异表达分析第一章植物炭疽病菌及其致病因子研究进展炭疽菌(CoUetotrichum)是由TOde(1790)首次报道,属丛剌盘胞属(Vermicu1.aria)。随后由Corda(1831)介绍,属“腔抱纲”,有性态为小丛壳属(.G1.omere1.1.a)U1.炭疽菌包含内寄生性、附生性、腐生的、植物致病性的生活方式匕白，同时还可侵染人类。该的是一类世界范围的重要真菌，己报道的有700余种，其寄主范围广泛，对经济作物、观赏植物、药用植物等造成严重损失U1.atunde-Dada(2(X)1)根据1981年至20

3、01年3月W,QfSCMg上的大量记录对炭疽菌属(CmIetOtriChUm)与循萄抱屈(及，)疝)、柄锈菌属sxrioi(1.esgroup2,C.g1.oeosxrioi(1.esgroup3和C.t11ncafumii*KWhitdaW-WCCkE等(2007)依据培养特性、形态学、RAPD-PCR以及rDNA-ITS和0-iUbU1.in部分序列，提出一个新分类群C.acutattmgroup.包括C.swnomfc涉S1.Than等(2(X)8)根据形态学特征、rDNA-1.TS和p-tubu1.in基因序列分析、致病性测定，鉴定泰国红辣锹炭疽病菌为3个种：CaC1.Ua1.Um,C

4、.capsici和C.g1.oeosWriOideSUzQ因此，通过多:基因序列分析和形态学特征结合的方法，能精确的将炭疸菌鉴定到种，其数据能够为有效的病害防控和后续研究提供理论依据。然而，随着鉴定种类的增多，GCnBank储存:的序列命名上有很多是错的通过多基因序列或条形码手段准确鉴定炭疽阂已成为一个问题。CgUCh等报道，由于GCnBank中rDNAITS相似，C加亚介种内的比较表明鉴定的错误较高，达86%UICai等（2009）分析了GenBankqC.s1.oeo.srioides的M3个rDNA-ITS序列发现，其中86%的序列与代表型具有相当大的进化分歧，很可能是代表其他种叫。I1

5、.前所使用的储存:在GenBank中的rDNA-S序列数据表明显著的高错误率，完成炭疽菌种的精确鉴定是不可能的。解决这种情况需要种的代表性菌株。为后续研究工作，已发表的新种需要有代表性菌株储存在菌种保藏中心。有时活化型的菌株被保留（例如C斯而e小e和C.ARmh）,然而在大多数情况下是没有的.表位型形成在某些特定情况下是必要的，例如在分类单元的模式标本已不存在或在不利条件下、或引起歧义情况、或变质的情况卜.引起很多重要特征在后续研究中无法使用，表位型形成能鲂解决很多分类的问题，稳定对种、属、族或顺序的认识I用。炭疽菌属的表位型形成始于2007年，现在当前使用的种有42个己有代表型或活化培养I1

6、.1.1.1 C.des“cy“，族蟀的分臭现状近几年，根据多战因进化分析，C.desiT汕被描述为复合种，包括C.Ji，sctn、C.higginsianum,C.tabacun,CIinicokhGa.Iruncata和CtanaCeH03。CdeWMC小.最早由O+Gara（5）报道,在美国引起三叶草炭疽病叫。该菌群的分生抱了大小10-22X4-6m,直或略弯，急剧锥形或钝形顶端，基部平截，而BaXICr等（1983）报道的分生刑子更窄，大小16-18X3m,通常直，有锥形末端1.该菌很容易和其他菌混淆，1.C.g1.oeos/wrioides.C.Iindemuihia,Hun和C.I

7、iwica。Cannon等（2012）发现，C.trifo1.ii有一半的提交到GenBank的ITS序列是基于错误的菌株,而这些菌株事实上属TCdesiruc1.ivum豆合群R叫很多依据最初的ITS种系发生被分配到C.Qsm“山豆合群的曲株以前被鉴定为C.CoCCodes、C.IindemuthiaiuimC.trifo1.iiC.truncatunC.Koeosporioides或GbmereHaciiiii1.atua随后，1.ehman和WoIf（1926）初次描述了大豆茎杆上的C.g/ycies的有性态为GaG1.ycinesf该有性态的出现加剧了这种混淘刈。很多的种和C.4esm

8、iIMn在形态学上相似，并被认为与其密切相关。日本炭疸病萌菌株依据ITS1.序列聚合到20群组，并与其形态学一一对应；菌株C.DestriiciivumC.Fuscum.C.蚀身加Sim和C/讥沁Ha属于同一个核甘酸簇，并被认为可能是同种的出）。1.2 炭”的类型及生活方式已报道的炭疽菌有内生的、体我寄生菌、腐生菌、植物病原菌甚至人类病原菌24。可引起严重植物病宙的炭疽菌属真菌也常常以内生菌存在于健康的植物中，以腐生菌存在于死的植物组织上IG1.在很多情况下，同种被记录为多种生活方式,尽管因存在模格不清的种的鉴定而不确定是否其明确为同种.分类单元从非致病到致病的生活方式的改变，且如何改变，仍需

9、要解决且是炭疽菌尿研究的一个址要的未解决的问题。为炭疸菌属种的精确分类学鉴定，详细的生活方式描述与分了数据相联系是需要探索、理解和发展的仃效控制战略。Prihastuti等（2009）在其研究中描述到，咖啡豆中分离的。./为“，应”及和。.$加，.”，同时是内生一菌、体表寄生菌和致病菌，这些菌已经被证明广泛分布在多种寄主上。C.心“山”J也同时作为内生菌、致病菌和腐生菌被发现M1.这些发现的意义是为炭疽前属的普遍存在和广泛分布据提供了重要证据。1.2.1 植物致篇*却也加加“是经济上岐全要的致病其菌之一，引起的炭疽病卷主范用广泛，尤其在热带和亚热带农作物以及果树上。活体植物地上部分在病害发展过

10、程中都能被侵染，包括在茎、叶、花和果,例如热带水果变黑，尤其是香蕉和芒果您1.Hyde等(2(X)9)讨论J目前己公认的由Ce菌引起的炭疽病，该病主要有两种形式，引起叶片病斑或收获后期果实黑化。柿子炭疽病菌(C”,力主要侵染果实和树枝，引起顶梢枯死，严重甚至整树枯死。旬。C.Cicutatum,C.capsid和C.oeospioi加S均可引起泰国的红辣锹炭疽病1叫然而，这三个菌应该定为Caa“仙群，其中包括3个最新命名的种271.CCaPSiCi被_定名C.(Ienui1.iuniz分自红辣椒的C.1.oeosporioides也应命名为C.(由“，”或C.Jhrk(d1.由于其在植物病理学

11、、植物育种和生物安全中的!区要性，该的需要被正确的鉴定，而这在前期缺乏分类信息特性时是不易的，很多都作为植物病原菌，依据广义的分类划分为Co1.1.etotrichun/71.1.2.2 植物内生*炭疸菌被发现以内生菌的形式在植物组织内02街，如：在泰国，从香花(Musaacuminata)、生姜(A1.piniaIa1.aCCenSiS)和杜衡(AmomumSianiense)的健康叶片和假茎上，以及从杜衡的根茎低频率分离得到的C.,WeoswriHdes和C.a”“福莉株。1.ue/R.(2004)从伊沃克拉马森林保护区的12个不同树种上分离到内生菌C&beosporiide$和C.6而鼠

12、到。内生曲能雄分解内生物，或作为潜伏性侵染源，在特定条件下引起植物病害。G1.oeosporimnmusa11tmea),番木瓜(CariCapapaya),草莓(Fragariagerie）、番荔枝（Annonasquamosa）新茄（1.yCoPerSiameSC1.uenIUCIM.均。迄今为止，CdeSwv油所超过30种寄主，在至少11种植物家族上有过报道，其中大多数为豆科（尤其是三叶草属、苜箱属、大豆腐），但也包括些禾本科（尤其是融草属、小麦属）,少数的菊科（菊花）、旋花科（灵丝子属）、木兰科（含笑花属）、防己科（防己属）、蓼科（酸模属、茄科（烟草属）、居形科（紫苏属）、玄参科（金鱼

13、草属）和兰科（白芨属），这些报道起源于18个国家，主要在北美洲、亚洲和非洲，以及极少的分布在欧洲、南美洲和大洋洲IW网.多种炭疽菌也能侵染单一寄主”，但对甘蔗（Saccharumoffidna1.e）具有寄主专一性四1.炭疽菌寄主范围的数据必须慎重对待o叫。近代的研究表明，普遍存在的Cg1.oe。SPo）ioides在热带地区并不像人们想象当中那么常见，在老挝和泰国没有发现Cgbe。SWri疝廉侵染木果.尽管近年来真菌和寄主的关系变得更清晰.但还是不精确且常常重,同时，有人认为炭疽菌能够适应新的环境，导致在种植业严重的交叉侵染o1.炭疸菌致病性变异的研究因此变得重要，明确特殊致病菌的寄主范围对

14、有效的病杏防控和管理有很大帮助。1.4 病害循环和流行传播在作物各种生长发育阶段，一些炭疸病的病害循环和流行已被充分研究4大多数炭疽病是在生长季湿度大时，分生.抱子通过水传播伴随着静止侵染大量发生B1.鳄梨、村橘、木瓜和芒果上的叶片是主要的病原教体，病叶上的分生抱了通过雨滴匕溅到未成熟的果上引起炭疸病：而在芒果和柑橘病害中，受害的花上的分生抱子为初始菌源闺刎。炭疸曲的侵染可发生在植物发育的各个阶段.在蓝蟀上，该菌被认为是以曲丝体在枯萎的细枝内和表面越冬,成为翌年春的初侵染来源，而新的研究表明，其主要的越冬菌源可能来自休眠的花膏卜，一项在美国新泽西州以“B1.uecrop”品种为研究对象的试瞪表

15、明，72%的越冬菌源来自花蕾四。在宏西根一项以感病品种“Jcnicy”为对象的筛选试验表明，表面健康的花蕾中57%是带菌的，被侵染的发病花储中82%是由CaC引起的，花偕打破休眠后，真菌长出禧澧并向周围茎组织蔓延，在被侵染的蒂着周因引起黑比闺1.这些病斑初期很小，逐渐扩大，约7天后花蕾死亡，在死亡的组织上形成穿孔。在春天田间潮湿阶段，该菌在发病组织上形成分生池子,通过雨水飞溅传播。如柑橘和草林，次生分生抱子的形成在早期侵染中起或要作用W1.炭疽菌以分牛.胞子盘和小菌核在土填中、质残体或杂草上存活，也可在转主寄主如茄科或豆科作物上越冬,再从带菌的移植体传入田间.川。在冬天或受阻条件下，炭疽菌自然

16、条件形成小菌核在土壤中休眠“然而，这种存活方式还未在所有种上验证。小菌核能够存活很多年，尽管菌源显著减少，但能遍及2或3年轮作。分生胞子盘和小菌核上形成的分生抱子随水滴飞溅，殛延至树叶和果实I刈。植物的表皮蜡层是真菌侵染过程中的首要障碍之%在发病组织内产生的新胞子随后分散到其他叶片和果实上，担任生存结构的附卷胞形成侵染钉穿透表以M叫C卬Sici是表皮下寄生菌，在角质层和表皮细胞临近的细胞壁内，其生长完全，引起细胞壁溶解，随即内部形成网状菌丝，迅速婺延至整个组织N1.2植物疏原炭疽的机械遗及其类型炭疽菌是研究真菌致病性的分子和细胞基础的极好材料|网。炭疽菌在我曲分化和其的一植物瓦作方面的研究已经

17、有很多年了，在植物宿主上定殖期间，炭疸菌发挥一系列代谢和扩展办法、形成系列的专业的侵染结构包括芽管、附着胞、胞内菌丝以及次生死体营养菌丝，为病原菌穿透进入寄主组织提供选要的机械动力。2.1 炭”的范子两发与用着胸初形成2.1.1 儿子船席寄主胞子成功拈附寄主对病害的初始反应是必不可少的，有效的影响了真菌-寄主间互作炭疽菌的分生抱子通过雨滴飞溅传播并迅速黏附到寄主植物地上部分I硼，其抱子盘嵌在水溶性粘液内，该粘液由而分子量糖蛋白或脯纪酸富集组成，包含萌发抑制剂如各种酹和能物保护胞子免受干燥和植物有毒代谢产物的影响。然而有的病菌，如Cf1.ra,ninico1.a的分生抱子盘粘液在抱子黏附时不起作

18、用I刈。芽管和附卷胞的粘附通常比例子粘附性强，通过观察声波降解残留的附着胞胞壁片段，可发现附着胞的粘附力更强，为渗透提供稳定的基础1.目前，粘合剂糖蛋白克隆在炭疽菌上未见报道，多转向候选分子的鉴定。炭疽菌的粘胶通常和其他植物致病菌样,分生例了最初时着在寄主角旗层，包含疏水层。研究表明这些真菌初期附着时需要在抱子表面形成蛋白如C.ZHMMe和CKra1加的抱子粘胶在蛋白的处理后受抑制，除能够提供迅速粘附寄主的被动输水作用外，C.Iindemuthianum.CmUSae和C.gmEcH的抱子粘附还需要代谢活跃，包括蛋白质合成倒1.表明这些活动进程与粘附的第二阶段仃关，仃助于巩固初始的疏水连接。在

19、些炭疽菌中，粘附的第二阶段与蛋白质分泌液的择放相关，该蛋白分泌液以薄膜形式从抱子向外扩散至底层或叶表面，但有的种，如C.Iindemuthianum,不释放蛋白分泌液，通过低温固定和冷冻替代法观察到其分生抱子表面覆盖毛刷状的纤维层，该纤维层垂直于细胞壁排列，斜剖面呈网状，60nm厚。Ca1.bicans细胞衣含有甘露聚做.表明存在甘露糖蛋白和控制该菌粘附力的细胞壁层.C1.mdemuthianum池子外被与碳水化合物，尤其是PA-TCH-SP染色剂起作用，且能被链卷蛋白醐移除，证明了他蛋白的存在，但其胞子外被缺少主要的细胞壁多加U1.质和伊1-3葡聚糖阳）。2.1.2 驰子发和府看胞给成的信号

20、系统炭疸菌胞了从植物表面检测物理信号和化学信号.是触动萌发和附若胞形成的主要剌激因素之一.如C.oe小WrioideS侵染鳄梨和C侵染香蕉的过程中产生化学诱导剂卬叫C西WMdes抱子萌发和附若胞形成是有选择的被鳄梨表面的蜡质触发，因该蜡质不能被其他植物上的取代，表明其信号的特殊性。促进水果成熟的激素乙烯,可诱导C.g1.。e。spori。ide$和C.H，sae胞子萌发和附若胞的形成，病菌侵染跃变型即成熟的果实，但其他侵染非跃变型果实的炭疽菌不受乙烯的影响.因此，泡子降落到发育中的果实表面，经蜡质信号触发，萌发并穿透寄主表皮潜伏侵染，直到果实成熟侵染才被发现网。CgSariHdeS与坚硬的表面

21、接触对化学信号（如寄主表面的蜡质层和乙烯）诱导时着胞形成是必要的，通过差异显示分离到该菌与硬表面接触时例子内的表达基因,其中的一个基因（chipI）编码泛素合陶，与SaCC/i.vcescereVRse的UBC4-UBC5曲具有高同源性僮1.该基因的表达能然调解与萌发和附若胞形成相关的泛素依赖蛋白的降解。在炭疽菌泡了萌发和附卷胞形成中,ECM蛋白（与细胞外基质有关的蛋白）作为初期信号感受器，在细胞与基物粘着、细胞分化和信号传递过程中起关键作用“如钙调蛋白（CaM）和蛋白激的，常采用抑制剂或通过检测编码假定信号组件的基因的友达研究细胞信号通路的运行B1.环腺甘酸(cAMP.cyc1.icaden

22、osinemonophosphate)作为附着胞形成的第二信使,其积素可促使蛋白璘酸化,从而进一步调节形成附着胞基因表达。对Cgbeospor沁ides的研究袋明，乙烯和鳄梨角质可诱导29kDa蛋白和43kDa蛋白磷酸化，诱导了分生抱子形成附着胞。蛋白激能抑制剂H7和染料木黄酮(genistein)可抑制受乙烯诱导的附若胞形成和蛋白质璘酸化，证明/后者可在附岩胞形成中起作用“CggwMMes的假定钙调蛋白激曲(CaMK)的CDNA已被克隆，研究表明，该醵受KN93抑制，降低了萌发率、附若胞形成率以及黑化率1他。关于C再川的抑制剂(KT572O)的研究表明，其抱子萌发和附者胞形成需要CAMP世代

23、和CAMP依赖性蛋白激版(PKA),在营养较差的非诱导表面条件下，CAMP可诱导附着胞的形成，确定cAMP和PKA是附若胞发育的先决条件刖。C.侬欣叩Hoides在与硬面接触时也形成钙调蛋白转录M1.总之，大量的研究结果表明，在炭疸菌侵染结构分化过程中，包括了CAMP、蛋白激酶和CaM等的信号通路运行，而精神的信号序列仍是未知的，因此，可进一步对其信号传导进行研究，了解附着胞形成的信号传递过程，为寻找封闭或阻断其传递过程的病害防治技术提供理论基础。2.1.3 部看Jfc分化/发育炭疽菌的附若胞在分生抱子芽管顶端生长停止、尖端膨胀受隔膜限制时开始在诱导面分化，随着细胞基部形成渗透孔隙、新壁层的沉

24、积、ECM物质的分泌，附看胞逐渐成熟，黑色素储存在与质膜很近的细胞壁层I有的种如C/讥心,渗透孔隙被漏斗形细化的内壁层圉绕，即形成附若胞锥，该结构不含几丁质或黑色素，与侵染钉外壁相连。其他种不存在附若胞推，但在渗透孔隙周用细胞壁形成增厚的环，该结构随若侵染灯穿透气孔和植物角质层而形成，顶端恢发生长，细胞壁受到高膨压和酶促降解的组合机械力。以上描述表明，成熟的附若胞高度不对称，极化细胞的上部圆球状、基底平整、含小孔，用MAbUB27鉴定C.而欣，间加5”的一个位于附着胞内的糖蛋白，其仅存在于半球形附着胞的痂膜内，而不存在于基底渗透孔周用的例形区域，表明附着胞质膜分化成两个结构域.在小孔区，质膜的

25、专化为随后的渗透和活性确立做好充足准备.UB27识别一个48kDa糖蛋白具有膜内在蛋白特性，表明与附着胞细胞壁或细胞骨架有联系，在限制蛋白质与附着胞半球形区域可能是重要的ft01.其他研究已鉴定了C.,gheos油des附着胞形成期间的基因开启，用未萌发的和形成附着胞的分生胞子提取的mRNA构成差减CDNA文库，来丰富CDNA文库与附着胞形成的联系，在附着胞形成过程中，差异筛选出4个CDNA克隆的代表转录组网JK1.其中2个克隆(.伊3和SP5)分别编码26-和27-宏基酸聚半胱显酸多肽，与金属结合蛋白化合物表现某些同源性。在胞子接触蜡层4h后附着胞形成，2个基因特异性表达：Cp22编码一个糖

26、基化的22-kDa蛋白质，从表达蛋白识别个43kDa的蛋白痂开始，其对Ea力的抗体提高：Cap20编码一个具有附着功能的2(1.kDa蛋白质，从破坏基因cap20得到的突变体控制正常形态的萌发和附若胞形成开始，但未能在鳄梨和番茄上形成病斑。对抗面20和即22蛋白的抗体通过免疫金标记表明，这些基因产物均位于附着胞壁上21。角质的在渗透寄主角质层时的作用己在几个炭疽菌上有研究.在未损伤或机械损伤的木瓜果实上，有的缺乏角质筋的C.g/oeosm加Od弊的突变体与其致病性相比较，当木瓜表面人工剌伤或用纯果胶前接种处理后，突变菌株表现高致病性，但表面有相对较厚的角质层的健康木瓜未发病.致病性可通过外源角

27、质的恢史，同时表明角质椀特异性抗体可保护木瓜免受病imi,2.2 用脑形成过程中的再因表达大量的方法已被用来研究炭疽菌侵染结构分化和与植物的互作，如差减杂交、差异筛选以及反转录的差异显示等PCR技术己用来鉴定附若胞形成过程中基因差异表达，其中最有效的方法是克隆差异基因和分离突变子。这些技术已充分应用在C.皿依，卬“油决S附着胞形成过程中克隆一些基因的表达网1.CDNA文库的差异筛选是从CRoeo卬碗决S氮饥饿纯培养到谷第酰胺合成旃基因的分离，在侵染柱花草过程中表达上调插入透变被用来鉴定纯氨酸/苏氨酸激的基因(.e1.k1.)的表达，这种方法是使菜豆致病的必要手段仲，该基因基本表达，但突变型侵染

28、时的渗透阶段受阻。综上所述，炭疽菌的分生池子在适宜的温度、湿度条件3不需要外缘物质，仅依靠自身的例子内源物质即可萌发，但其附着胞能否形成与外缘环境因子及自身调控关系紧密。表1致病过程中的基因及其功能菸因种名聪因表达产物表达或功能GencnaneCv1.1.eiofnchumspeciesGcneProduC1.exprcsscdfunc1.ionChiPIC.gU)eosporioides泛素结合fiUbiquitiivconjugatingenzyme胞子连接寄主Sporecontactwithsubstratumcap3C.f!(eospo11oides金属硫蛋白Mcta1.1.othio

29、nindikc一着胞形成.Apprcssoriumformationcap5C.E1.OCCspoHcides金属硫蛋白Mcta1.1.othionin-Iikc七成Apprcssoriumformationctein附着胞形成ApprcsoriumIbrma1.ionCaP22C.1.(ftoSHf11ou1.es附着胞细胞壁蛋白Appressoria1.ce1.1.wa1.1.protein附著胞形成/XppivssoriuinformationCUTIC.gUyeosporioides角而解Cutinasc附着胞形成ApprcssoriumformationSCDIC.Iaenarium

30、小柱他阴脱水醉Scvta1.oncdehydratase黑色集合成Me1.aninsynthesisPKS1.C.Iagcruinum聚酮合，Po1.vkc1.idesynthase黑色素合成Me1.aninsynthesisTHRIC.Iagenarittm1,30四氯票还原酣1.,3t8THN,educ(ase黑色素合成Me1.aninsynthesisCIHIC.Iindefnuthianimi活体营养相关蛋白活体营养Bio(rophy-rc1.a(cdPrOtCinRioIrOPhypn1.AC.1.oeosporioides果胶酸液裂解醉PcctinIvasc活体营养Biotroph

31、ype1.C.1.(wospc)11oides果股酸药解除Pcc1.ateIvasc活体营养BiotmphyC1.g1.C.Iindcmu1.humum内聚半乳糖醛酸梆Endo-po1.yga1.acnase活体营养BiotrophyCIPmC.1.indemnthi(iun内聚半乳糖醉酸陆活体营养Enda-Po1.yga1.actuinnascBio1.rophyC.Irifo1.ii丝翅酸/苏经酸潮醉信号传导ScrincjthrooninckinaseSigna1.1.ingcamC.g1.(feoxptf11oides钙调蛋白Ca1.mixJu1.in信号传导Signa1.1.ingCa

32、MKC.f1.feosporioides钙调生白激陆Ca1.modu1.inkinase信号传导Signa1.1.ingdk1.C.Iindemuthianum丝氨酸/苏飒酸激酷SerincX1.hreoninckinase3-磷酸11油繇脱班陶信号传导/致病Signa1.IingZpathogenici1.y管家法因HousekeepinggenesgpdC.IindcnuithianumG1.ycera1.dehyde-3-phosphatedchvdrtgcnascTUB1.C.E1.oCCspoHcides一微管白Rtubu1.in管家法因HousekeepinggenesTUB2C.

33、RkMC*w*沁ides。微管蛋白*(ubu1.in管家基因HousekeepinggenesgnC.g1.tyfospohoides谷刎酸胺合成院G1.utaminesynthetase营养阶段Nutrition3把物森原炭疸致病相关因子及其致病机制研究植物病原真菌的致病机制是由多种因子调控，包括细胞壁降解前、黑色素、毒素、信号传递途径、微量元来、活性氧、有性生殖等，它们在致病过程中起重要作用，分析致病因子及其作用是研尢病原菌致病机制的重要内容和基础。炭疸菌致病过程中展现了两种主要的营养方式：活体营养(从或者的寄主细胞内获得营养)和死体营养(从被真菌杀死的寄主细胞内获得所需营养)陷1.细胞壁

34、降解的等在死体营养过程中摄取营养和降解寄生组织起到重要作用。炭疽储在寄主细胞内不断扩展，产生大量次生菌丝，进而分泌出大量的细胞壁降解的等，使寄主植物组织发生降解，进一步生长发育获取营养。3.1 炭疸分泌细胞降解及其致病作用植物细胞壁一般由3部分组成，中胶U、初生壁和次生蜜，其主要组成成分为果胶、纤维素和半纤维素，这些成分构成了寄主植物的天然保护屏障，阻碍了致病菌的侵入，而这些贪杂的屏障需专化的院才能降解。病原菌与寄主组织接触后，逐渐形成识别植物细胞壁化学结构的适当的类，分解各种细胞壁的组分。植物病原真菌可形成并向外分泌多种能够降解植物细胞壁的檄类，统称为细胞壁降解的(CWDE),常见的有果股的

35、、纤维索施、半纤维素的、多酚氧化酌、蛋白树、磷酸酯的、淀粉拗等类型.其中，多聚半乳糖醛酸陶(PG).果胶裂解酹(P1.)等是炭疽菌产生的主要降解酹，其在致病过程中协谢作用，参与病害的扩展殛延,引起寄主植物组织降解，影响寄主组织超微结构1.早期的有关细胞嬖降解的在致病中作用的研究多桀中在病原菌产椀能力、趣活与致病性相关分析，间接地反映了细胞壁降解酌在致病过程中起到或要作用，表明其与致病性的关系。近年来，随着分子技术的广泛应用，有关细胞壁降解酹作为致病因子的研究已在基因水平上获得直接证据。3.1.1 果胶阵及其政戒作用果胶酶是病原菌侵染啬主植物后引起炭痕斑或腐烂过程中起关键作用的一组胞外随。豆类炭

36、疽病菌(C.1.indemuthiuun)在纯培养和致病过程中分泌多聚半乳糖酸酸的(PG)和果胶裂解的(P1.),口这些旃的表达量随病害的扩展明显增加WXM1.同时,研究证明/在C./加加，“汕,511”致病过程中P1.幅活表达与死体营养初期和随后的病斑扩展关系紧密。在含有果胶酸盐和豆类细胞壁的培养基中，该菌可分泌CndoPG、2种P1.、-和。半乳糖哦喃糖昔酸、a-阿拉伯味喃糖陶和1种蛋白酶。在CiindeMhianum接种大工4d后,检测到果胶裂解的活性，7dfi活达最大，随后的活降低网。以GC加Kwas(无性型C.g1.oe。SPOrMdeS)为材料，研究果敢裂解酹基因和果胶裂解酹编码基

37、因家族的特性，该家族第个基因PMA通过简并PCR获得克隆体，通过定点做除基因外抽，表现为不影响其致病性,表明Pn1.A陶可能不是唯一的致病酣，其由该基因家族内的多个基因共同决定71.另一个编码果胶裂解的的Pd基因，从侵染鳄梨的炭疽病菌Cgbe。SMriOideS上分国得到,是重要的毒力因子巩随后对C.历“在，“小山，的研究转向了内多聚半乳糖醛酸他(endo-PGs)4利用PG抑制蛋白处理，在在培养基中和染痛组织内仍检测到前的积累，证明了该菌在致病过程中可能分泌了这类醉住丸为进一步阐明对该菌致病过程中Cndo-PG表达的调控，基因Pfi1.和Cpr2)通过简并PCR克隆.得到的序列相互间61%致

38、，在培养过程中2个基因均能表达，其中CPg1.长时间表达，而。网2短暂性表达网.上述研究为寄主感病期间细胞壁降解的的差异表达提供了证据，也证明了在互作的死体营养阶段和显症初期细胞壁降解醒起主导作用。在致病过程中，受病原菌分泌的一些醉的剌激，使寄主植物细胞内的微环境发生变化，通过调节胞内pH,影响病菌的果胺酸盐裂解的等致病因子的基因表达和分泌，在引起油梨和芒果炭疽病的C.g/ewrMes中克隆基因p“c/,其能够引起pH应答转录调控B1.而对该基因所调控的下游基因尚未清楚，有待于进一步明确，3.1.2 阡学素薛及其致嘉作用大多数酶与基质的互作与其可溶性有关，由于纤维素不溶于水,降解相对困难。纤维

39、素梅是一组复合的IM1.如I,2书-D葡聚糖胸(EG),I.4-0-D前聚糖纤维二糖水解酸(CBH)和葡尊就伊卿(-G)均参与纤维素的降解。纤维素酸可由病原的自身产生，也受寄主植物诱导和抑制，如底物或植物表面的角质层除可诱导产生角质陶、果胶醉等，还可诱导产生纤维素随，当底物浓度过高时，纤维素陶活受抑制。3.2 其他数翕因子在病原致病过程中的作用3.2.1 毒素在致痛过程中作用大量的特异性和非特异性毒素可由植物病原菌产生，在病害显症过程中起重要角色61，但其作用机理非常复杂，通过对寄主组织识别、参与寄主植物牛.理生化过程的调控、影响寄主植物的超微结构、最终使整个寄主植株生理生化和形态结构变异。D

40、asGupta(1986)发现，引起萎叶炭疽病的C.卬.Mci真菌分泌的毒素可影响己萌芽了的水稻种子的根部延伸，也可影响辣椒种子的萌发，使杼苗在盆栽中徒长叫Mathur(1995)也对C.caps油的毒素进行研究，其培养滤液可抑制种子萌发，使籽苗要擒、果实腐烂旧1.Anand等的研究表明，C.caps汕和人Rrem“心的混合毒素对种了萌发的抑制作用更强,且种子腐烂程度较单个毒素的影响强毒素的作用机制有物理作用、破坏膜透性、抑制超活性等类型67)。3.2.2 黑色素在致痛过程中作用黑色素的化学本质为多酚类聚合物，可增强真菌在逆境中的存活和竞争力，同时与病原菌的致病力关系密切。病原菌的附着胞含黑色

41、素，其参与病菌的侵染，是重要的致病因素1.itCC.IagenariumC.Iindemtahi(num1.,黑化被认为参与了附若、膨胀的过程，且是机械透透所必须的I网。黑色素生物合成开始于耐内酯的合成和他了,形成。编码PKS1.的聚酮介的存在于黑色素合成早期，随后通过2次脱水和1次还原：经SC7)/编码的小柱抱酗脱水前脱水成138三蔡酚（I.3.8-THN）和1&二羟蔡,经THR1.编码的1,3.8-THN还原曲还原，随后1.8二羟蔡聚合、氧化形成黑色素。通过M甲基-N8-硝基W-亚硝基I孤和抑制基因的同系物处理分生抱子，形成黑色素缺陷型突变体，从而3个黑色素生物合成基因完成克隆和分析（PK

42、S/、SCDI和77R）1791.这3个基因是黑色素合成所必须的，缺失菌株不能有效的渗透或侵染植物。在附着胞分化期间，分生抱子潜伏初期这3个基因重转录累枳1-2h.6h后转录量:减少网。附着胞形成受夏令营养的抑制，如酵母膏提取物和蛋白豚，在这种条件下，未能检测到这3个基因的表达。海历在基因表达上有相似的研究，诱导条件下2-6h.7H/?/和5C7”在附着胞形成前期和形成期均有表达网1.4总结与展望炭疽菌是全球性的重要的植物病原真菌,本文对该种的鉴定、分类以及不同致病阶段功能基因和蛋白的致病机制进行综述.在炭疸菌不同的生活阶段，一些特异性表达的基因和蛋白已被签定，并明确其功能，但可被定义为致病因子的基因相对较少，迄今为止，有2个基因表现在致病力和毒力上有一定作用，为UH和cap20,分别编码C.加刖”丝氨酸/苏氨酸激酰和CQoeosp”/切泌，附着胞壁糖蛋白向）。因此，应进步研究参与致病性和产生突变体的相关基因。尽管不同种的炭疸菌的渗透前期相似，但在范1子粘附机制、黑化作用以及附若胞渗透角质层时分泌角质酹方面，不同种的炭疽菌是不同的。因此很难在分子水平上概括不同种间的