1.团体标准《六堡茶中花青素的测定 高效液相色谱法 三重四极杆液质联用法》（征求意见稿）.docx

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1、ICS6750CCSC53T/GXAS体标准T/GXASXXXXXXXX六堡茶中花青素的测定高效液相色谱法/三重四极杆液质联用法Determinationofanthocyanidinsin1.iupaoTea-HighperformanceIiquidchromatography/1.iquidchromatography-triplequadrupolemassspectrometry（征求意见稿）（本草案完成时间：2024年4月30日在提交反愦意见时，请将愚知道的相关专利连同支持性文件一并冠上.XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施广西标准化协会发布本文件参照GB/T1.I20

2、204标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则3的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由梢州市食用药品检验所提出并宣送.本文件由广西标准化协会归口.本文件起草单位：梧州市食品药品检蛤所、广西梧州圣源茶业有限公司、广西梧州关叶茶叶股份有限公司、梧州市天誉茶业有限公司、广西速溶六堡茶工程技术研究中心.本文件主要起以人：蒋德莉,文俊部、姚泳成、陈娜、李君、钟水桥、罗达龙、陈后钊、何斓珊、鹏氏、王华、李夷君、黄琳、卓海琳、黄金福、书燕娟、骆网、宋好、冯成.六堡茶中花青素的测定高效液相色谱法/三重四极杆液质联用法1葩围本文件描述了六堡茶中飞

3、燕草色素、矢车菊色泰、天竺葵色素、芍药泰、镐葵色素和矮牵牛色素共6种花声素的测定方法.本文件第一法为高效液相色谱法.本文件第二法为三重四极杆液质联用法.木文件适用于六堡茶中飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素、芍药素、锦薨色索和矮牵牛色素共6种花有素含m的测定。2规葩性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的停改单适用于本文件.GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有倦要界定的术沿和定义.4富效液相色谱法4.1 原理六堡茶中花再素主要以花色音

4、的形式存在。试样经乙静-水-盐酸溶液超声提取花色索背后，经沸水浴将花色素音水解成花声素.用高效液相色谱法测定,以保序时间定性.外标法定fit.4.2 试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一缎水的要求。4.2.1 试剂4.2.1.1无水乙醉(CH0H):色谱纯，4.2.1.2乙聃(CI1.O)：色谙炖.4. 2.1.3甲醉(CIlX)II)：色谱纯.4.2. 1.4甲酸(HCOOH)：色谱纯，4.3. 1.5盐酸(HCI):优级绳.42.2溶液配制4.2.2.1提取液:无水乙酹+水+盐酸=2+1+1代八八)，量取200ml.无水乙醇4.2.1.1),100

5、ml.水和100m1.盐酸(4.2.1.5),混匀.4.2.2.210%款酸甲解溶液：款酸+甲醇=】+9丫/丫，量取IOb1.盐酸(5.2.1.5和90m1.甲醇2.1.3)混匀。4.2.2.3流动相A：造甲酸溶液：准确吸取甲酸(4.2.1.4)IOB1.至1OOO三1.容量瓶中,水定容至刻度，摇句.4.2.2.4流动相B：1%甲酸乙准确吸取甲酸(5.2.1.4)1Om1.至100OnI.容设瓶中，乙脐(4.2.1.2)定容至刻度，丘匀.4.2.3标准品4.2.3.1E燕草色索(DClPhinidin：CAS号528-53-0,纯度96%4.2.3.2矢车菊色素(Cyanidin)：CS号52

6、8585,纯度N984.2.3.3矮牵牛色素(PetUnidin)：CAS号1429-30-7,纯魔96乐4.2.3.4天当美色素(PelargOnidin)：CRS号134-04-3,纯度。96九4.2.3.5芍药索(PeOnidin)：CAS134-01-0,纯度398%。4.2,3.6锦舞色索(MaIVidin)rCAS号643-84-5,纯度96%4.2.4标准溶液配制4.2,4,1分别准确称取&燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色泰、芍药素和锦嬖色素标准品10.0%,用10%盐酸甲解溶液(4.2.2.2)溶斛并分别定容10ml.容附瓶中即为1m“m1.的单标储备液,于78C下冷

7、冻保存.在密闭的棕色玻璃Si中保存有效期为6个月.4.2.4.2混合标准使用液：将单胡准储备液进行等比例混合后，用10%越酸甲醉溶液(4.2.2.2)作为溶剂，逐级稀释成0.1ug三1.,0.2ug1.,0.5gm1.,2.0gm1.,10.0gm1.,20.0ug/m1.或其他浓度的花再素混合标准使用液，于4C条件下保存,有效期为3个月.4.3仪器和设备4.3.1裔效液相色潮仪：带紫外或.极管阵列检测器，4.3.2天平:精度0.01mg,0.01Ko43.3数显恒温水浴祸。4.3.4研磨机.4.3.5超声波清洗器.4.3.6移液枪：204200“410001.4.4分析步建4.4.1试样制备

8、枭用四分法分取样品，取约2(X)K样品于研磨机中粉碎，过60目豌。制得样品在-18C下保存。4.4.2提取称取5g(精确至001g)制备好的试样于501.锥形瓶中，加入20ml提取液(4.2.2.1)至刻度，混匀!in.超济提取15in(功率参数：100%34千新效，25D.4.4.3水解超声提取后,于沸水浴中水解Ih,取出冷却后，转移至25m1.容量瓶，用提取液(42.2.1)定容至刻度，摇匀，静置,取其上清液用0.22m谑膜过油,待测。制备好的样品可在41C条件下保存不超过48h4.4.4空白试脸以相应试剂为空白，与试样提取水解过程一：ft.4.5测定4.5.1港相色澧参考条件4.5.1.

9、1色谐柱：填料为2.7mSBCl8,柱长100nm,内径2.1mm或性能相当液相色谱柱.4.5.1.2流动相A：1%甲酸水溶液(4.2.2.3),液动相B：1%甲酸乙脐4.2.2.4).4.5.1.3检测波长：530nm,4.5.1.4柱温：4QC。4.5.1,5进样体积：2.OO1.4.5.1.6梯度洗脱程序见表1.表1梯度洗脱程序时何(Ilin)流速(11l11i11)海动相A(%)海必相H(%)0.000.390)01.W)0.3901013.OO0.37822)3.500.3)090】5500.3109015.600.3901018.000.390104.5.2色诺分析4.5.2.1分

10、别将标准溶液和试样溶液,注入液相色谱仪中，以保留时间定性,以样品溶液峰面积与标准溶液峰面积比较定fit.色诣图参见附录A.4. 5.2.2被测忒杼中目标花青素色谱峰的保留时间与相应标准色港峰的保阳时间相比较，相时误差应在2.5%之内.4.6 结果计算高效液相色谱测定采用标准曲线法定飞,标准曲设法定状结果按式(1)计算:y_(CCo)x1000m1000式中：A=-一试样中花当素的含量，单位为亳克抵千克(mk)；C-从标准曲线上得到的被测组分溶液浓度,单位为微克每意升(g/mlj：d-空白试样的浓度，堆位为微克每汽升(U&/1.):一样品溶液定容体枳，单位为亮升:一一试样质砥，单位为克(g.4.

11、7 精密度在史虹条件下於得的两次独立测定结果的绝对差位不得超过算术平均值的10%.48桧出限和定量限本方法检出限和定量限见表2.表2方法的检出限和定量限序号化合物名称英文名称CS高效液相色i法检出双ng/kg定你限三k1E烝空色素Delphinidin528-53-00.51.52失车先色索Cynnidin528-58-50.51.53殛牵牛色素Pctunidinll29-：Mh70.51.51天竺普色索Pelargonidin1344M-30.51.55芍药案Peonidin134-01-00.51.56锦蕤色索Malvidin61381-50.51.55三市四极杆液质联用法5.1 原理六堡

12、茶中花百素主要以花色背的形式存在.试样经乙酹水-盘酸溶液超声提取花色素背后，经沸水浴将花色素甘水解成花青,素.用液相色谱-三重四极杆质谱仪测定，以保留时间和特征离子嶙定性,外标法定量.5.2 试剂和材料除男有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求.5.2.1 试剂5. 2.1.1无水乙醉(CH(川)：色浩纯.6. 2.1.2乙肪；色谱纯，7. 2.1.3甲解(CtfaOH)：色诺纯.8. 2.1.4甲酸(IICOOH)：色清纯。9. 2.1.5盐酸(IlCl)：优级绳.10. 2.2溶液配制52.2.1提取液：无水乙醉+水+盐酸=2+l+l(vvv)，量取20

13、Om1.无水乙醉(5.2.1.1),K)Om1.水和100ml.盐酸(5.2.1.5).混匀10.2. 2.210%盐酸甲醉溶液：盐酸+甲醉=l+9(vv),量取IOmI.盐酸(5.2.1.5)和SoB1.甲IS(5.2.1.3)混匀。5.2.2.3流动相A：0.1%甲酸溶液:准确吸取甲酸(5.2.1J)Imi,至100QB1.容M:瓶中，水定容至刻度，摇匀。5.2.2.4流动相B:0.居甲酸乙脑：准确吸取甲酸(5.2.1.4)1b1.至1OOOm1.容量瓶中.乙脑(5.2.1.2)定容至刻度.猫匀.5.2.3标准品5.2.3.1飞燕草色素(DeIPhinidin)：CAS号528-53-0,

14、纯度N96%.5.2.3.2矢车菊色素(Cyanidin)：CAS号528-58-5,纯度298%.5.2.3.3矮牵牛色素(PeUmidin)：CAS号E29-30-7,纯度96也5.2.3.4天竺葵色素(PelargOnidin):CAS号134-04-3,纯度96乐5.2.3.5芍药3(PeonidiIO：CAS号134-01-0,纯度298%.5.2.3.6锦葵色素(Malvidin):CAS号643-845,纯度N96.5.2.4标准溶液配制5.2.4.1分别准确称取飞葱草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天些费色素、芍药素和锦舞色索标准品10.Omg,用1族盐酸甲醉溶液(5.2.2.2

15、)溶解并分别定容IOb1.容量瓶中.即为Img/m1.的单标储备液.于T8P下冷冻保存，在密闭的棕色玻璃瓶中保存，有效期为6个/1.5.2.4.2混合标准使刖液：将单一标准储备液进行等比例混合后，用I(W盐酸甲醉溶液(5.2.2.2)作为溶剂,逐级稀择成1ng/ml,、2nga1.5ngm1.%20ne/m1.、100ng/ml、200ngn1.或其他浓度的花出索嘏合标准使用液.于4C条件下保存，有效期为1个月。5.3仪器和设备1.1.1 3.1液相色潮-申联版谱仪：三球四极杆质港，配有电喷其离子源(ESI),具会反应监测功能,1.1.2 天平：精度0.(Hmg,0.0191.1.3 数显恒温

16、水浴锅.5.3.4研磨机。5.3.5却声波清洗器,5.3.6移液枪：20U1.、200u1.、10001.41.1.1 步骤1.1.2 4.1试样制备操作步骤同4.4.1.1.1.3 提取操作步骤同4.4.2.1.1.4 水解探作步骤同4.431.1.5 空白试验以相应试剂为空白，与试样提取水解过程一致.5.5测定5.5.1液相色谱参考条件5.5.1.1色谐柱：填料为2.7mSBYI8,柱长I(K)nm,内径2.1mm或性能相当液.相色i龄柱.5.5.1.2流动相A：0.1%甲酸水溶液(5.2.2.3),流动相B：0.1%甲酸乙肪(5.2.2.4).5.5.1.3检测波长：530M5.5,1.

17、4柱汹：40C。5. 5.1.5进样体枳：1.OoU1.5.5. 1.6梯度洗脱程序见表3.表3梯度，光脱程序时间(IIiloifti(111.min)iftMl()近动和0.000.390101.000.39010IlW)0.3782213.500.3109015.500.3109015.6(0.3JX)1018.000.390115.5.2质谱参考条件5.5.2.1电喷罂溪子源(ESI).正离了模式.5.5.2.2毛细管电压:3500V,5.5.2.3鞘气温度:350To55.2.4渐气流速：121.Ztniru5. 5.2.51魂气温度：250C.5.5. 2.6干魄气流速：18IJmi

18、n,5.5.2.7雾化器压力:25psi,5.5.2.8多离子反应监测方式(MRM)。55.2.9监测围子对、碎裂电压、碰撞能量见表4.表4目标化合物的多离子反应监测条件化合物理as子（z子离子(nz)驻留时间4碎裂电压八喊捡能就M(燕草色素303.1257.03038。28229.03038030矢车菊色素27.1108.93038042137.03038032然牵牛色素317.1M2.0ao：W024203.0ao：W0豺天箜整色崇271.0121.0-303803865.03038055芍药米301.05286.05*3038025201.093038010锦套色素331.2315.I*

19、3038028242.O30：W0M注I帝”的为定量离八本方法松仔的随训条件为推存条件.对于不同旗声仪器参数可fig存在速异.可根据实际情况.送挣响应信号GUl无干货的需广对进行抬测.物诺图数亦可根依实万可达到被优武收收的条件进行设定.5.5.3质诺分析5.5.3.1离子丰度比在相同实龄条件下进行样品测定时,如检出的色谱蜂I的保刷时间标准样相一致，并且在扣除宵累后的样品质谱图中,目标化介物选择的子离子均出现,而且同一桧测批次，对同一化合物样品目标化合物的离子丰度比与质量浓度相当的基质标准溶液相比,其允许偏差不超过表5规定的范用则可到阍样从中存在目标农药.本方法的标准物质1.CTSHS多反应监测

20、质疑色谱图参见附录B.表5定性时离子丰度比的最大允许偏差*位为附分比海子丰度比5020-S010-20WlD允许相对的茏20士2530505.6结果计算液招色谱7；联质谱测定采用标准曲线法定信，标准曲税法定限结枭按式(幻计算：X_(Cf)XVXlOg一mx1MO1OOO式中：A=-一试样中花育米的含量，单位为亳克每千克OnK”G：t-从标准曲线上得到的被测纲分溶液浓度，单位为微克母皂开(I.):3空白试样的浓度,单位为微克每型升(Ug/BlJ:.样品溶液定容体枳，单位为充升.计算结果应扣除空白值,测定结果取两次测定的舞术平均值,计算结果保密三位有效数字。5.7 精逡度在重义条件卜获得的两次独立

21、测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%.5.8 楼出限和定置限本方法检出限和定量限见表6.表6方法的检出限和定量限序号化合物名移英文名称SS号三一四横杆液明联用法检出限MR,k定IitBIWkgI飞燕草色素IXrlphinidin528-53-05.015.02矢车菊色索Cynnidin528-5-55.015.03场奉牛色素Petunidin1429-30-75.015.0I天竺奏色索PelargonidinBl-01-35.015.05芍药武PeonidinBl-Ol-O5.015.06饰蕤色系Malvidin643-84-55.015.0附录A（资料性）6种花吉素标准溶液色谱图（波

22、长=530nm）见图A.I.注；保留时间I飞莪草色索5.370Sim矢李用色索-7.41。mini康康牛色素8.237Iim天竺契色索9.5IOiIim芍药米-10.470ninl6一色米-11.077nin.图AI6种花=素标准溶液色谱图（波长=53011m）附录B（资料性）6种花青素的MRM提取色诺图见图B.1.注：离子对：1l*ft*-331.2/242.0/31S.h矮节牛色素-317.1/203.0/302.0；E熬点色素-：川3.1/229.0/257.0；芍药用-301.Q5/201.09/286.的矢车菊色般287.1/108.9/137.Oi天竺葵色IK-Zn.0/65.0/121.0.ISB.16种花青素的MRM提取色诺图