负载类肝素聚合物电纺支架的制备及与血管细胞相互作用研究分析分子材料学专业.docx

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1、目录中文摘要4Abstract5前言7第一章血管组织工程料概述71.1.1组织工程概念71.1.2血管组织工程概念71.1.3血管组织工程支架材料71.1.4血管组织工程支架材料的制备方法81.2静电纺丝技术概述91.2.1静电纺丝技术的原理及特点9L2.2静电纺丝技术的应用9肝素及类肝素对于血管细胞的作用101.3.1肝素及其制备方法10L3.2类肝素对细胞增殖的影响101.3. 课题提出1114.1研究目的及意义11L4.2研究内容及方案12第二章实验部分122.12-甲基丙烯酰葡萄糖胺（MAG）的制备122.1.1.实验原料122.1.2.实验设备132.2.聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰

2、葡萄糖胺P(SS-MAG)的制备及表征132.2.12-甲基丙烯酰葡萄糖胺(MAG)的合成132.2.22-甲基丙烯酰葡萄糖胺(MAG)的表征142.2.3聚苯乙烯磺酸钠磺化2-甲基丙烯酰葡萄糖胺p(SS-MAG)的制备142.2.4聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺p(SS-MAG)的表征142.2.5聚苯乙烯磺酸钠磺化2-甲基丙烯酰葡萄糖胺(SS-MAG)静电纺丝膜的制备152.2.6聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰喃葡萄糖胺p(SS-MAG)静电纺丝膜的表征152.3.聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)静电纺丝膜对内皮细胞增殖的影响152.3.1.内皮细胞的培养152.

3、3.2.观察内皮细胞粘附及增殖情况162.3.3.细胞的计数16第三章结果与讨论173.12-甲基丙烯酰葡萄糖胺(MAG)的表征173.2聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺p(SS-MAG)的表征173.3.聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)膜的测试与表征183.3.1.表面形貌表征183.3.2.内部结构表征203.4.内皮细胞的黏附与增殖21名吉论24参考文献25致谢错误!未定义书签。中文摘要静电纺丝技术是通过外加电场的条件下，使高分子雾化成聚合物微小射流，被接收后固化成纳米纤维薄膜。它是一种制备生物组织工程材料的重要方法。本课题将聚己内酯和聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯

4、酰胺基毗喃葡萄糖P(SS-MAG)以不同配比混合，通过同轴静电纺丝技术，形成具有生物活性和功能的纺丝，观察聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)对内皮细胞的增殖和粘附的影响。以2甲基丙烯酰葡萄糖胺(MAG)为原料，通过RAFT的手段制备聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)O之后，再与聚己内酯以不同配比混合制成静电纺丝膜。运用具有生物活性的静电纺丝膜作为载体，之后再在材料上面培养人脐静脉内皮细胞，观察其黏附以及增殖情况。通过实验结果显示，随着聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)含量的增加，静电纺丝膜对于人脐静脉内皮细胞的黏附诱导和增殖效果有促进作

5、用，为未来制备人工血管或新型血管支架材料提供了很好的研究基础。关键词：血管组织工程，血管支架，静电纺丝，类肝素作者：苏兴宸指导老师：李丹副教授AbstractTheelectrospinningtechnologyisbasedontheapplicationofanelectricfieldtoatomizethepolymerintoasmalljetofpolymer,whichisthencuredtoformananofiberfilm.Itisanimportantmethodforpreparingbiologicaltissueengineeringmaterials.Inth

6、isproject,polycaprolactoneandsodiumpolystyrenesulfonate2-methacrylamido-glucosep(SS-MAG)weremixedatdifferentratiostoformabiologicalactivityandfunctionthroughcoaxialelectrospinningtechnology.Spinning,observetheeffectofsodiumpolystyrenesulfonate2-methacryloylglucosaminep(SS-MAG)ontheproliferationandad

7、hesionofendothelialcells.Sodiumpolystyrenesulfonate2-methacryloylglucosaminep(SS-MAG)waspreparedbyRAFTusing2-methacryloylglucosamine(MAG)asrawmaterial.Afterthat,theelectrospinningmembranewasmadebymixingwithpolycaprolactoneindifferentproportions.Bioactiveelectrospinningmembraneswereusedascarrierstocu

8、lturehumanumbilicalveinendothelialcellsonthematerialsandobservetheiradhesionandproliferation.TheexperimentalresultsshowthatwiththeincreaseofSS-MAGcontent,theelectrospinningmembranecanpromotetheadhesioninductionandproliferationofhumanumbilicalveinendothelialcells.Forthefuturepreparationofartificialbl

9、oodvesselsornewbloodvesselstentmaterialestablishedaverygoodresearchbasis.Keywords:VasculartissueengineeringVascularstentElectrospinningHeparinoidsWrittenbyXingchenSuSupervisedbyDanLiBUS第一章血管组织工程料概述1.1.1 组织工程概念组织工程是,一门跨学科的新兴热门学科，它将生命科学和材料学两者相结合，并运用工程学的方法，研究人工合成的含有活细胞的有功能的组织，来替代人体由于疾病、外伤等原因，所造成的结构或功能受

10、损的组织或器官为了达到修复创伤和重建功能的目的，其主要过程为从活体组织（多数从与人结构功能相似的动物组织中提取）中提取少量细胞（种子细胞），再将其与生物相容性较好、可降解、可吸收的生物材料相融合，再将细胞一材料复合物，重新植入体内，植入的细胞可以随之在体内不断增殖并分化，与此同时生物材料可以降解成可以被人体吸收的物质，最终在体内形成相应的组织或器官。与传统医学相比较，组织工程具有“无创伤修复”的重要特点。在目前的研究和临床应用的方面，拥有广阔的发展空间。1.1.2 血管组织工程概念血管组织工程是指利用细胞结构和功能完整的血管壁细胞和降解性好的高分子材料进行制备血管替代材料的学科。其是利用组织工

11、程学的方法替代血管的构建，将种子细胞种植于血管支架上，从而模拟血管细胞外基质的作用与结构。所选用的材料应具有良好的生物相容性、血液相容性、不容易发生免疫排斥反应、可控的生物降解性、方便大量生产、长期储存、随时取用等特点，血管组织工程目前广为认可的最为理想的替代血管的方法【支1.1.3 血管组织工程支架材料血管支架材料是种子细胞在体外生长所需支撑物，为人造血管提供一定的机械强度和力学特性，同时还可以模拟血管细胞外基质的作用，促进细胞的黏附与生长、增殖也血管组织工程支架材料主要有天然材料、脱细胞外基质、合成生物可降解高分子材料、活性细胞膜片等。天然材料主要有胶原、纤维蛋白、弹性蛋白、透明质酸、甲壳

12、素、丝素蛋白、葡聚糖明胶、细菌纤维素等。但是由于它机械性能差的缺点，尽管天然材料拥有血管支架生物相容性好、无免疫排斥反应的优点，在临床应用方面依然受到限制。脱细胞外基质血管支架完全由天然细胞外基质组成，其优点是具有良好的生物相容性和机械力学性能，理想的支架结构和形状。缺点是力学强度和管壁顺应性不佳，且降解之后形成的物质可能引起免疫排斥和疾病传播。合成生物可降解高分子材料主要有聚乙醵酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)等以及它们的复合物。可降解高分子血管支架的优点是合成高分子材料来源广泛、加工方法多样、力学与降解性能可调，但是其缺点是细胞亲和性不佳。另外一种构建血管支架的方法是基于

13、细胞膜片的组织工程血管，这种方法无需使用支架材料。选用自体细胞作为支架用细胞，然后通过长时间(69月)细胞培养，可以分泌大量的细胞外基质，进而形成一定力学强度的细胞膜片。虽然这种方法没有免疫排斥现象，但其生产周期过长限制了它的进一步发展。1.1.4 血管组织工程支架材料的制备方法利用适当成型技术(熔融/溶液挤出法、盐沥滤法、热致相分离法、静电纺丝法、卷绕成型及其复合技术等)加工上节材料，可在体外形成自体血管结构和形貌相似的血管支架。但是熔融/溶液挤出法制备的支架可能残留有毒溶剂，且不易控制孔径大小和分布的缺点。与其他纳米纤维制备方法相比，静电纺丝能够制备小直径6mm)的纤维网状多孔结构H。,并

14、具有良好的机械性能和力学性能，还有利于细胞黏附的表面，使得支架的顺应性与天然血管基本匹配。在组织工程血管支架构建领域静电纺丝技术凭借这些特点，成为近年血管组织工程支架研究常用手段。1.2. 电纺丝技术概述1.2.1 静电纺丝技术的原理及特点静电纺丝是通过聚合物溶液或熔体在强电场作用下形成喷射流，喷射流被拉成泰勒锥，凝固后形成纳米纤维，以无纺布状排列于收集板上形成材料UL近年来随着流体力学研究的不断深入，特别是非牛顿流体相关研究的深入，由于静电纺丝所使用的溶液或熔融体大多为非牛顿流体,也间接推动了电纺理论的发展。一种新的电纺方法同轴电纺及其紧密相关的同轴射流技术应运而生。本次实验中所使用的即为同

15、轴静电纺丝技术。在2个内径不同但同轴的毛细管中分别注入芯质和壳质溶液，二者在喷头末端汇合，在电场力的作用下固化成为复合纳米纤维，这就是同轴静电纺丝的基本原理。122静电纺丝技术的应用静电纺丝技术自20世纪30年代出现以来，以其制备的支架比表面积大、孔隙率高，纳米纤维直径与体内许多细胞尺寸相当，能够负载生长因子诱导细胞黏附、增殖和分化，对于体外细胞培养、模拟细胞外基质构造的独特优势”也逐渐成为目前组织工程应用中制备支架的常用方法。然而，单一材料静电纺生物相容性不好的弊端逐渐暴露出来。因此，由此发展出了共混静电纺和同轴静电纺丝等技术。例如：莫秀梅所在的东华大学生物所生物材料与组织工程课题组率先采用

16、同轴静电纺丝方法，选用可降解生物相容性良好的P(LLA-CL)生物可降解材料作为基本材料，制备了具有良好抗凝血性能，且孔径约90nm,壳芯纤维直径约47Onm的P(LLA-CL)/肝素壳芯纳米纤维。此外，还采用此方法制备了负载生物活性因子的TPU功能纳米纤维。H5116gi叫同轴静电纺丝被广泛用于制备中空纤维材料，并且方法简单，适宜工业化生产，在生物医学等领域具有广泛的潜在用途，如用来保存不稳定的生物试剂或病毒，防止不稳定化合物的分解，分子药物的持续释放，通过芯层材料实现生物功能获得功能化的纳米纤维支架等U叫1.3. 肝素及类肝素对于血管细胞的作用1.3.1 肝素及其制备方法肝素因其首先从肝脏

17、发现而得名,存在于动物中肥大的细胞,结构不均一不明确,平均分子量为15KD,呈强酸性。它通常存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然生物活性的物质。现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。作为生物活性剂，是由二种多糖交替连接而成的聚合物，在体内外都有诱导细胞粘附以及促进细胞增殖作用3L目前，肝素的市场需求量很大，同时也是非常重要的抗凝血、生物活性剂。现如今,肝素的提取方法主要来源于猪小肠粘膜提取L不过由于提取出的肝素并不纯净,通常含有许多杂质。在应用中也由于其药理学特性在体内的量效反应个体间的差异很大，目前尚无肝素剂量精准的个体化计算方法,用量过大，患者可能出现出血迹象，如血尿、咯血、消化

18、道出血或颅内出血等现象22）。这些都严重影响了肝素的临床应用。1.3.2 类肝素对细胞增殖的影响由于肝素在目前应用领域的种种问题，因此我们选用类肝素为药物载体。与肝素相比，类肝素适当的降低了抗凝血活性，但同时还能保持其他的生物活性。根据进一步研究显示，肝素因其单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置不同属于糖胺聚糖的一种，它的磺化单元（三）和糖单元（G）在调节细胞增殖和分化中起到不同的作用。对于细胞增殖，单位S和G单位之间存在协同效应通过分裂和重组。对于细胞分化，尽管仅含有单位G（pMAG）的聚合物在诱导ESC的神经分化方面没有显示出显着的能力，但含有单元S和单元G的共聚物比仅含有单元

19、S的均聚物PSS诱导更好的神经分化，G单元协助实现合成聚合物的GAG模仿性质。所以单元S和单元G在实现GAG生物活性方面的不同作用。另外，在合适的单元S与单元G的比例下，合成聚合物表现出比肝素更好的生物活性12叫1.4. 课题提出1.4.1 研究目的及意义血管组织工程支架主要研究目的在于模拟人体血管，为其在临床应用提供基础，在最近的几年里受到了极大关注，也渐渐成为热门研究项目。运用工程学、材料科学和生命科学的原理及方法，模拟血管组织的结构与功能来制备具有一定生物活性的血管替代物，以重建、维持或提高细胞外基质的生理功能，这就是血管组织工程学的定义。组织工程研究的内容包括支架材料、种子细胞、组织器

20、官三维构建及移植应用4个方面12久一个理想的组织工程血管支架首先应该具备以下特点：1、 生物相容性好；2、 具有纤维网状多孔结构，材料直径与正常的血管壁细胞相似；3、 生物降解性好，降解所形成的产物对机体无毒副作用；4、 良好的纤维多孔结构，易于种子细胞粘附、增殖；聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰胺基毗喃葡萄糖P(SS-MAG)是一种可以人工合成的类肝素，在促进HUVEC的细胞粘附和增殖中表现出高生物活性，甚至其活性高于天然肝素。本实验采用静电纺丝技术能够使得聚合物溶液或熔体在强电场下静电雾化的特点，将难以被纺丝的天然聚合物与具有良好降解性但缺缺乏生物活性的物质一起混合纺丝，形成纳米级的支架材料。

21、制备出的静电纺丝因其直径与体内许多细胞尺寸相当，能够负载生长因子诱导细胞黏附、增殖和分化，能够模拟天然细胞外基质的胶原纤维网络结构。本课题在天然GAG(肝素)中分裂和重组硫酸化和糖单位来制备类肝素，再运用静电纺丝技术将类肝素与聚己内酯(PCL)混合纺丝，制成具有生物相容性的生物活性静电纺丝膜。制备出的静电纺丝膜对于促进细胞增殖具有一定程度的促进作用，可能在未来制备人造血管支架领域提供一定的基础。1.4.2研究内容及方案本实验通过制备MAG单体与苯乙烯磺酸钠，将其以1:1的比例混合制备聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰胺基毗喃葡萄糖P(SS-MAG)的类肝素，再与聚己内酯以不同的比例混合，运用同轴静电纺

22、丝技术制成静电纺丝膜。再在膜的表面接种人脐静脉内皮细胞，观察细胞的黏附和增殖情况。第二章实验部分212甲基丙烯酰葡萄糖胺(MAG)的制备1.1.1. 实验原料本章实验中所采用的主要原料见下表。实验用水均经过MilliPOre系统纯化，电阻率为18.2MQCm。表1实验原料药品名称生产厂家纯度葡萄糖胺东京化成工业株式会社AR硫酸国药集团化学试剂有限公司AR碳酸氢钠国药集团化学试剂有限公司AR甲基丙烯酰氯上海亭新化工厂AR无水甲醇国药集团化学试剂有限公司AR六氟异丙醇Sigma-Aldrich公司AR聚己内酯Sigma-Aldrich公司ARPBSHyClone（美国）AR无水乙醇国药集团化学试剂

23、有限公司AR偶氮二异丁脂AIBNSigma-Aldrich公司AR层析用硅胶南京化学试剂股份有限公司200-300目盐酸南京化学试剂股份有限公司AR2.1.2,实验设备本章实验中主要运用的生物试剂如下表。表1主要实验仪器仪器名称生产厂家AL-204电子天平梅特勒-托利多（上海）有限公司PureLab超纯水仪ELGA公司（英国）HS7型恒温磁力搅拌器IKA公司（德国）101-2A型电热鼓风干燥箱上海博迅实业有限公司医疗器械厂SHZ-D（In）循环水式真空泵巩义予华仪器有限责任公司Scientz-12N立式冷冻干像机宁波新芝生物科技股份有限公司DZF-6050型真空干燥箱上海右一仪器有限公司Nex

24、us傅立叶变换红外光谱仪ThermoFisherScientific公司电子防潮箱常熟市加腾电子设备厂超低温冰箱SANYo公司（日本）静电纺丝机北京永康乐业科技发展有限公司LDZX立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂YDS-IO液氮生物容器成都金凤液氮容器有限公司Galaxy170R细胞培养箱Enppendorf公司（德国）血球计数板上海求精生化试剂仪器有限公司低速台式离心机长沙湘仪微量移液器芬兰大龙公司超声波清洗仪宁波新芝生物1X71正置显微镜OLYMPUS公司（日本）BX51倒置荧光显微镜OLYMPUS公司（日本）2.2. 聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺p（SSMAG）的制备及表征22

25、12甲基丙烯酰葡萄糖胺（MAG）的合成将葡萄糖胺盐酸盐(2.32x10-2moi)和K2CO3(2.3210-2mol)在125mL甲醇中在25OmL单颈圆底随后在甲醇/冰浴下剧烈搅拌下滴加甲基丙烯酰氯(2.09x10-2mol)o混合物反应4小时，然后用真空抽吸通过烧结漏斗过滤。然后收集滤液并减压浓缩。将淤浆通过以4:1的CH2Cl2和甲醇混合物作为洗脱剂加载到柱色谱上来纯化。2222甲基丙烯酰葡萄糖胺(MAG)的表征2-甲基丙烯酰葡萄糖胺(MAG)运用核磁共振氢谱观察223聚苯乙烯磺酸钠磺化2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的制备通过可逆的加成-断裂链转移(RAFT)聚合以CTDB作为

26、链转移剂和AIBN作为引发剂合成聚合物。将MAG和SS以1:1的比例混合(1.6mmol),CTDB(0.016mmol)和AIBN(0.008mmol)溶于含有1:1的DMF和H2O的混合物作为溶剂的25mL圆底烧瓶中。通过用氮气鼓泡脱氧30分钟后，将溶液转移至用干燥氮气纯化的手套箱中。聚合在70进行。在所需时间后，通过用液氮骤冷，然后暴露在空气中终止聚合。然后将聚合物溶液在水中透析2天，然后冻干分离。2.2.1. 聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的表征聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)运用核磁共振氢谱和红外光谱观察2.2.2. 聚苯乙烯磺酸钠磺化2甲

27、基丙烯酰葡萄糖胺(SS-MAG)静电纺丝膜的制备2gPCL溶于20ml六氟异丙醇并不断搅拌，带溶解均匀后，选用20大小的电纺丝针头，将溶液缓慢导入针筒里45ml,清理电纺丝转筒，用酒精浸湿的棉花擦拭，再用干的擦镜纸擦干净，调整温度30,湿度50%,打开通风，通风口放入通风橱内，缠上接收纸，将上层撕开，将下方剪下一块粘好，调整出丝口对准接收纸的中央,高度对准或略低于转筒中央,将针筒放入卡槽,将推进器推到前端刚好挤出液滴为止,调整出丝口距离转筒约为20cm,设置推进速度为2mmmin,转筒速度50rmin,开始推进，打开电压，设置低压-4kV,高压14kV左右，使喷出来的丝稳定(不大幅上下摆动，电

28、压合适，过高摆动剧烈，丝不稳定，过低纺出的丝过厚)，每30min检查一次出丝口防止堵塞(若堵塞用木架子清理出丝口即可)。获得聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)静电纺丝膜。226聚苯乙烯磺酸钠2.甲基丙烯酰喃葡萄糖胺P(SS-MAG)静电纺丝膜的表征聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)静电纺丝膜运用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)进行表征2.3. 聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺p(SS-MAG)静电纺丝膜对内皮细胞增殖的影响2.3.1. 内皮细胞的培养首先用75%酒精棉擦拭超净工作台、实验手套以及实验用具，进行消毒，点燃酒精灯，之后选用一

29、块新的酒精棉继续擦拭24孔血球计数板以及培养细胞所用到的各种试剂瓶瓶口等。之后，将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）复苏后在细胞培养瓶中进行细胞培养，再加入内皮细胞专用培养液基进行培养，之后将其放于温度为37、湿度为95%和C02含量为5%的培养箱中培养。当细胞快要长满培养瓶时，用胰酶洗脱细胞进行细胞传代培养并将剩余细胞进行冻存。2.3.2. 观察内皮细胞粘附及增殖情况首先用75%酒精棉擦拭48孔板以及培养细胞所用到的各种试剂瓶瓶口等。然后放入静电纺丝膜样品，加入适量细胞悬液和1640培养基，每孔液体总体积为ImL。以30000/孔的密度种植人脐静脉内皮细胞。放入恒温培养箱里培养4h。然后，取出培

30、养4h的内皮细胞，将培养液吸去，用PBS洗去培养基和未黏附的细胞（不能用PBS清洗时间过长，如果PBS洗时间过长的话会将细胞冲洗下去），大约洗3遍。为了固定细胞，向每个孔中加100L多聚甲醛，之后静置15min15min后再用PBS洗去培养基和未黏附的细胞，然后每个孔加100LTritonX-100（破膜液），开始计时5mi1105min后再用PBS洗去培养基和未黏附的细胞，将纺丝膜夹到孔板的盖子上，用滤纸吸去周围多余的液体。为了方便观察，首先浸染细胞骨架。在避光条件下，每个片上加100LFITC染料，静置40min,滴加染料时注意染料要准确滴在片上,若滴加到外面，应该及时用滤纸清晰干净，再重

31、新滴加。浸染结束后，边缘的染料用移液器枪吸取干净，片上的染料用滤纸从边缘吸去，用PBS完全洗去培养基和未黏附的细胞。把片夹到盖子上其它干净的孔内，周围的液体用滤纸吸去。之后进行细胞核染色，每个片上加100LDAPI染料，静置IOmin,用同样的方法吸干染料，用PBS洗4遍，最后将孔内的剩余液体用滤纸完全吸干。染色全部结束，将纺丝膜倒扣在干净的载玻片上，盖上盖玻片，利用荧光显微镜拍摄荧光照片，用于之后细胞计数。选用已经培养了48h的细胞，按照上述同样的步骤进行染色观察，利用荧光显微镜拍摄荧光照片，用于之后的细胞计数。2.3.3. 细胞的计数将上述拍照获得的荧光照片运用Image-PrO计算不少于

32、20张荧光照片上的细胞个数，之后再去掉其中的最大值和最小值，计算剩余数据的平均值与标准偏差，绘制成柱状图。第三章结果与讨论3.12 甲基丙烯酰葡萄糖胺（MAG）的表征采用核磁共振氢谱对2.甲基丙烯酰胺基毗喃葡萄糖（MAG）观察图12-甲基丙烯酰葡萄糖胺（MAG）的核磁共振氢谱上图为2-甲基丙烯酰胺基毗喃葡萄糖（MAG）的核磁共振氢谱，由图可见H的峰面积大约为1:1:0.5:6:3,正好符合2-甲基丙烯酰胺基毗喃葡萄糖（MAG）的化学式,表明合成2甲基丙烯酰胺基毗喃葡萄糖（MAG）成功3.13 苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P（SS-MAG）的表征实验采用傅里叶红外光谱对聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙

33、烯酰葡萄糖胺p（SS-MAG）进行分析OH/N-HWU9WIVMWavenumbr(cmt)图2聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的核磁共振氢谱和红外光谱图上图为聚苯乙烯磺酸胺2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的核磁共振氢谱和红外光谱图。左图为聚苯乙烯磺酸纳2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的核磁共振氢谱，由图可见H的峰面积大约为8:6:10,正好符合聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的结构式，表明合成聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺p(SS-MAG)成功。右图为聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的红外光谱图,位于30003

34、500cm为O-H/N-H的仰缩振动峰，12001400cm/为S=O伸缩振动峰，表明聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)制备成功。3.14 聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺p(SS-MAG)膜的测试与表征3.14.1. 面形貌表征实验验运用扫描电子显微镜分别观察聚己内酯及聚己内酯与0.5%、1%聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P (SS-MAG)生物静电纺丝膜的结构，纤维直径。结 果如图：图3聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)膜的扫描电镜照片A、 B、C分别为PCL、PCL与0.5%、1%聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P (SS-MAG)同轴纺丝

35、所得的生物活性静电纺丝膜的扫描电镜SEM照片。通过上图的测量与计算，图A、B、C的纤维直径分别为0.6188120.221712m0.3725680.062606m0.3139780.098802m0纤维直径逐渐减小，且内部纤维结构趋向致密。这是由于聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的含量增多，导致电压升高，从而使得纺丝被拉伸程度提高。3.3.2,内部结构表征图4聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)膜的透射电镜照片A、B、C分别为PCL、PCL与0.5%1%聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)同轴纺丝所得的生物活性静电纺丝膜的透射电镜照片。

36、如图所示，通过图A、B、C的对比，B、C两张图片呈现出非常明显的浅色与深色的夹心区域,表明同轴静电纺丝成功合成出聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)混合纺丝，具有明显的“核壳”结构。图A所呈现“白边”现象，是由于测定过程中过焦的结果，在测定TEM时应保证处于欠焦状态，才能得到准确良好的图像。图5聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)膜的纤维荧光照片A、B、C分别为PCL.PCL与0.5%、1%聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)混合纺丝所得的生物活性静电纺丝膜的纤维荧光照片。如图所示，荧光标记的聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)

37、在图片中清晰的显示出来,证明实验所制得混合纺丝确实具有聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)o3.15 内皮细胞的黏附与增殖我们运用对比实验的方法，将只含有聚己内酯静电纺丝膜作为对照组，与0.5%,1%配比加入聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺p(SS-MAG)的静电纺丝膜作为实验组，观察细胞的黏附情况。培养4h和48h后，用FITC与NAPI染色HUVEC的细胞膜和细胞核，再运用荧光显微镜拍摄的荧光照片用于细胞计数和形态观察。之后统计内皮细胞的数目，计算不同照片上内皮细胞数目的平均值与标准偏差，结果如下：PCLPCL+0.5% SS-MAGPCL+1% SS-MAG图6内皮细胞

38、的黏附和增殖情况由图6中4h的3张图片对比可以看出，随着聚苯乙烯磺酸钠2.甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)含量的增多，同轴纺丝样品上粘附的内皮细胞数量有轻微增长。证明了聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)与PCL共纺的生物活性静电纺丝膜对细胞粘附具有促进作用。48h的3张图片对比可以看出，随着聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的百分含量的增多，细胞增殖的数目有了明显的增长，证明了聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)与PCL共纺的生物活性静电纺丝膜对细胞增殖具有促进作用S=。Uo-S UPe f jo JBqEnU -a H图7内皮细胞

39、的黏附和增殖情况图7更加直观的显示出加入聚磺化2聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺p(SS-MAG)的细胞数目兵线多于只含有聚己内酯静电纺丝膜，并且许多细胞开始聚集在一起形成区域。这说明加聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)的静电纺丝膜具有促进内皮细胞增殖的能力，具有良好的生物相容性。并且荧光标记的聚苯乙烯磺酸钠2甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)成功从纤维中释放出来，直接影响了内皮细胞的增殖和分化。结论同轴静电纺丝技术在制备血管组织工程支架方面有着极为广泛的应用O将具有良好生物相容性的聚合物与可降解性好的支架材料进行“核壳”结构纺丝，可以获得具有特定功能的生物组织工程支架

40、。本课题将不同比例聚苯乙烯磺酸钠2.甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)与聚己内酯混合的溶液进行同轴纺丝，成功制备出了静电纺丝膜。之后，在同轴纺丝上种植人脐静脉内皮细胞。目的是将只含有聚己内酯静电纺丝膜样品作为对照组，间接证明同轴静电纺丝中的核聚苯乙烯磺酸钠2.甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)可以顺利提高材料生物活性，能够很好地诱导细胞粘附、促进细胞增殖。这样一来就有可能可以解决人造血管中支架材料生物相容性差的难题，也证明了同轴静电纺丝技术在血管组织支架材料领域拥有非常广阔的应用前景。并且聚苯乙烯磺酸钠2-甲基丙烯酰葡萄糖胺P(SS-MAG)作为新的类肝素，可以非常有效的诱导内皮细胞粘附、

41、促进内皮细胞增殖，这为新一代的模拟血管结构和组织表面的制造做了铺垫，也为治疗血管类疾病提出了新的解决方案。参考文献1KhademhosseiniA;LangerR;BorensteinJ;VacantiJP.MicroscaletechnologiesfortissueengineeringandbiologyJ.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2006,103(8):2480-2487.2曹谊林.组织工程学理论与实践J.上海科学技术出版社，2004.3侯俊华.血管组织工程的研究与进展J.中

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