2023血浆微颗粒在静脉血栓凝血机制中的研究进展.docx

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1、2023血浆微颗粒在静脉血栓凝血机制中的研究进展摘要许多静脉血栓栓塞(VTE)的临床病例诱因不明，且缺乏典型的临床症状，因此急需开发可靠的生物标志物辅助VTE的预测和诊断等。微颗粒(MP)是由活化、损伤或凋亡细胞产生的细胞外囊泡，携带多种生物活性物质,具有广泛的生理功能并参与多种疾病的病理进程。近年来随着研究手段的进步，MP对凝血过程复杂的调节作用被逐渐揭示。MP参与了多种临床VTE相关疾病的病理进程，因此在提示VTE风险和辅助VTE诊断方面拥有的潜在的应用价值,对MP进行系统的研究对于临床VTE相关疾病的诊治具有重要意义。静脉血栓栓塞(venousthromboembolism,VTE)是一

2、种慢性疾病，包括深静脉血栓形成(deepveinthrombosis,DVT)和肺栓塞(pulmonaryembolism,PE),是全球死亡率和残疾的主要原因之一，全球每年有近1000万例患者受其影响1,而且许多VTE患者没有明确的临床诱因和经典的临床表现。因此可靠、易于检测的生物标志物对于辅助VTE的预测、诊断和预后具有重要意义。近年来随着细胞外囊泡(extracellularvesicles,EV)研究的不断进展，逐渐发现微颗粒(microparticles,MP)在VTE中发挥着重要作用。MP携带生物活性物质并具有相对稳定的结构，被认为是颇具研究潜力的疾病生物标志物,因此对MP进行系统

3、的研究对VTE的临床诊治具有重要意义。一、MP的研究现状根据粒径和产生方式的不同，可以将EV划分为外泌体、MP和凋亡小体。MP是直径为0.11IJm的EV,是多种细胞在活化、损伤或凋亡时，由细胞膜向外萌芽、裂变脱落并随之释放到细胞外2,31需要注意的是，EV的分类和命名尚无统一标准，因此在许多研究中存在混用的现象。MP具有封闭的磷脂双分子层，稳定存在于机体的体液和组织中。同时MP携带多种生物活性物质，可在细胞间传递信息，从而发挥广泛的生物学功能并参与某些疾病的病理进程3,4,5Je既往研究表明，MP的组分会根据不同的细胞类型及其生理状态进行相应的调整，包括其脂质，蛋白质和核酸等6OMP内的货物

4、通过锚定到质膜脂质的方式MP定位于囊泡萌芽的部位7,同时Ca2+依赖性酶驱动不对称的膜磷脂进行重E磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserinePS)从内叶暴露到细胞表面，膜发生物理弯曲，肌动蛋白使细胞骨架重组，促进MP的出芽和释放2,7OMP与受体细胞结合后可能保留在质膜上，也可能被内化与细胞融合8,9,这与MP特定的组成成分以及靶细胞膜上特定结构有关，这个过程相当复杂，目前尚未完全阐释清楚。目前MP分离纯化的常用方法包括高速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱分离、聚乙二醇沉淀，基于免疫沉淀的商用试剂盒等10这些方法分离的MP具有不同的纯度、浓度和完整性，应根据下游分析目的合理选择分离纯化

5、的方法。例如，实验室常用的高速离心和密度梯度离心回收率较高，但重复性较差和耗时长的缺点限制了其在临床的推广应用。不同品牌推出的商用试剂盒分离纯化的效果差异较大，因此目前难以得出一致的评价等。分析MP组成和形态最常用的方法包括蛋白质印迹分析111纳米颗粒跟踪111透射电子显微镜12和流式细胞术11以及组学分析（包括蛋白质组学、脂质组学和转录组学13,14D国际囊泡协会建议，对EV的鉴定应从蛋白质印迹分析TEM、纳米颗粒跟踪和透射电子显微镜3个方面展开101二、MP对血栓生成的调节功能因为MP在形成的过程中,Ca2+依赖性酶驱动PS从内叶暴露到细胞表面，从而赋予了MP促凝特性。在Ca2+存在的情况

6、下，PS有助于促凝血酶原活酶复合物（因子Vila、IXa、X）和凝血酶原酶（因子Va、Xa、凝血酶）复合物的形成15JOPS阳性的MP增强因子X的活俗口凝血酶的形成，而用PS拮抗剂能抑制促凝血酶原活酶复合物和凝血酶原酶复合物的形成，逆转凝血时间的缩短及纤维蛋白的形成160研究发现约50%血小板（即CD41）或班胞（即CD235a）来源的EV不表达PS17L其原因可能是由于部分EV在生成过程中维持了磷脂不对称性18L也有可能是由于PS含量未达到检测下限19Jo此外，MP的促凝特性还与组织因子（tissuefactor（TF）的表达有关。TF是启动外源性凝血途径关键因子，血源性的TF含量很少且处于

7、非活性状态，在活化血小板分泌的蛋白质二硫异构酶的作用下，非活性状态的TF激活，从而发挥促凝活性20JoTF阳性的MP又能与活化的血小板结合，使凝血反应进一步加强21,研究发现,MP表达的PS和TF活性远高于母细胞的活由21L能够显著缩短小鼠出血时间，促进血栓的形成。此外，MP还携带P-选择素糖蛋白配体-1和糖蛋白GpIb,分别介导MP与活化血小板、内皮细胞和VonWillebrand因子（vWF）相互作用，使MP相关的TF迅速沉积在血栓生成部位，从而更有效的促进凝血级联反应启动和放大221除了直接促进凝血外，MP也可以通过间接机制促进血栓形成，比如通过活化的血小板产生的EV能够转移花生四烯酸等

8、货物，从而诱导其他血小板活化23；内皮来源的MP通过上调内皮细胞和单核细胞表面TF的表达量，减少组织因子途径抑制物和血栓调节蛋白的表达水平，显著提高促凝活性等24,250此外，肿瘤细胞分泌的EV促进中性粒细胞陷阱的形成，中性粒细胞陷阱能够使肿瘤细胞产生的EV聚集，进一步促进血栓前状态的出现26L部分研究发现，MP还具有抗凝和促进纤维蛋白溶解的作用。内皮细胞和白细胞产生的MP表面表达尿激酶型纤溶酶原激活受体，能够促进纤溶酶原的活化271而血小板产生的MP则可以结合蛋白S促进蛋白C的抗凝活性28,因此蛋白C和蛋白S缺陷的患者更容易发生VTEo此外，活化蛋白C能够刺激内皮来源的MP表达内皮细胞蛋白C

9、受体，从而影响抗凝血系统290由于这些结果均为不同的病理情况的体外实验，且不同细胞来源、不同刺激产生的MP的生物机制差异有统计学意义，因此MP各亚群在个体水平对凝血系统和纤溶系统的影响仍有待评估。值得注意的是，炎症和血栓形成的关系密切，近期发现MP还可以通过作用于炎症系统间接促进凝血。高水平的MP能显著上调促炎信号分子的表达，激活全身凝血反应并诱导炎症和细胞凋亡30总之MP除了具有促凝血的功能特性外，还可能在某些特定情况下促进纤溶系统和抗凝血系统，而在某种疾病的病理过程中，MP在个体水平上对于凝血系统的影响仍有待系统研究。三、MP与VTE性疾病MP在VTE中发挥的病理生理作用已被证实,研究发现

10、DVT和PE患者体内的MP水平显著升高31,实际上，在多种VTE风险较高的疾病中观察到MP的水平发生显著改变，比如血细胞或血管异常性疾病、血栓性疾病、肝脏疾病、创伤、脓毒症和癌症等。(一)血细胞或血管异常性疾病JimeneZ等32发现，血栓性血小板减少性紫瘢患者在急性期，血浆内皮细胞来源的MP水平显著升高。而在适当的治疗使疾病缓解后，患者血浆内皮细胞来源的MP水平下降至与健康人差异无统计学意义，且用血栓性血小板减少性紫痛血浆诱导肾脏和脑微血管的内皮细胞可以增加其MP的生成。肝素诱导的血小板减少症患者体内的免疫复合物导致血小板、内皮细胞和单核细胞释放TF阳性MP、促凝活性增强，并且诱导中性粒细胞

11、陷阱的产生，TF阳性MP与血栓栓塞的风险呈正相关33I此外,镰状细胞病、地中海黄血等患者因体内溶血继发形成血栓前状态，研究发现红细胞衍生MP与纤维蛋白溶解和凝血酶生成生物标志物（如D二聚体和凝血酶原片段1+2）的血浆水平密切相关，说明红细胞衍生微囊泡与血栓形成密切相关，阻断因子IX可以减少50%凝血酶的随后生成,说明其机制可能是表达PS的MP通过激活因子IX或因子X与凝血酶原酶复合物结合来触发凝血酶的产生340Behqet综合征患者循环中总MP水平高于健康人且有血栓形成史的患者组织因子途径抑制物阳性与TF阳性MP的比值显著低于无血栓形成史的Behqet综合征患者35,提示TF阳性MP与组织因子

12、途径抑制物阳性水平的不平衡可能参与血栓形成。总之,表达促凝血表型的MP水平反映了免疫相关疾病患者凝血系统的状态。阻断促凝MP的产生和作用或许为治疗免疫相关血栓栓塞提供了新的思路。（二）血栓性疾病有血栓事件史的抗磷脂综合征患者的促炎MP和促凝血MP水平显著升高36JeMP能够激活内皮细胞，单核细胞相关囊泡还能将miRNA转移到受体细胞，从而触发促炎信号通路37o存在遗传性凝血因子缺陷的易栓症患者患VTE的风险明显增大，Campello等38分别评估了抗凝血酶缺陷患者，蛋白C缺陷患者、蛋白S缺陷患者和健康人的血浆MP含量，发现易栓症患者促凝MP中位水平升高，且发生VTE的易栓症患者促凝MP中位水平

13、高于无VTE的患者。以上结果说明循环中的MP既可以通过直接激活凝血级联反应，也可以通过促发炎症反应间接促进VTE的发生，但MP对血栓性疾病患者的凝血系统和炎症系统的影响程度仍有待进一步的评估。(三)肝脏疾病慢性肝病和肝硬化患者处于凝血系统失调的状态，更容易发生血栓栓塞。有研究发现，发生门静脉血栓的肝硬化和肝细胞癌患者PS阳性的MP和内皮源性的MP血浆水平显著高于未发生门静脉血栓的患者39J5动物实验发现，肝损伤小鼠的微粒的TF活性显著增加，而下调小鼠全局和肝细胞TF表达后,其肝脏和微粒中的TF水平均降低，并且在不改变肝纤维化程度的情况下，降低小鼠的凝血激活40研究表明，急性肝衰竭患者MP促凝活

14、性明显升高，参与维持急性肝衰竭患者整体正常的止凝血系统的平衡41JO与PS阳性MP相比，TF阳性MP能更好的指示肝脏疾病相关蛋血栓栓塞42Je我们检测了循环中肝细胞来源的MP,发现DVT患者该MP亚群水平显著高于无DVT患者和健康人，其中PS阳性的肝源性MP可以明显区分创后DVT患者f口无DVT患者，曲线下面积为0.894(95%CI0.8330.955),因此MP可能是反映肝脏止凝血功能的新型生物标志物。通过检测MP水平的变化，可识别肝病患者止凝血系统的平衡状态。（四）创伤创伤后引起组织损伤，TF的大量释放和内皮下胶原的暴露，激活外源性凝血通路和血小板，使机体表现为高凝状态，发生血栓事件和死

15、亡的风险增加2至4倍。既往研究发现，与健康个体和轻度受伤患者相比，多发性创伤患者的血小板和内皮细胞衍生的MP浓度显著增加，且内皮细胞衍生的MP水平与凝血参数的改变相关43,表明MP在创伤后调节血液凝固中的重要作用。与健康对照组相比，创伤导致人类和小鼠循环中血小板来源的囊泡显著增加，这些PEV导致大量凝血酶生成、血小板聚集增加、出血时间减少以及不受控制的出血减少，PEV被招募到发育中的血栓部位,有助于增强静脉血栓形成44.此外，创伤性脑损伤导致快速和全身性的高凝状态，VTE是创伤性脑损伤患者的严重并发症，导致患者的致残率和病死率增加，脑源性MP在其中发挥着重要的作用。Zhao等45发现，脑源线粒

16、体MP表面表达心磷脂，其促凝血活性是纯化心磷脂的1600倍。除直接促凝血的作用外，脑源性线粒体MP还能结合并激活血小板，破坏内皮细胞的完整性。另一项研究发现阻断脑源性MP的PS和TF后，其促进凝血的作用减弱,说明脑源性MP的促凝血活性依赖其表面的PS和TF460我们的研究发现创伤患者PS阳性的MP水平远高于健康对照，且在创后发生DVT的患者中升高更为明显，说明创伤后的MP水平的升高可能是VTE的重要的先前特征,并且减少MP产生可能是降低创伤后DVT风险的潜在靶点。（五）感染性疾病脓毒症是宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，是一种特定的复杂的炎症反应，死亡率很高约为26%47,48L

17、近年来的研究发现，MP含量和组分的变化可能反应脓毒症患者的持续的病理炎症过程。与健康对照相比，脓毒症患者在入院时显示PS阳性的MP、TF阳性的MP和血小板来源的MP水平升高，其中TF阳性的MP的活性与脓毒症患者疾病严重程度相关，并在抗生素治疗3d感染消退后，出现血浆TF阳性的MP活性和TAT浓度下降49,50L说明MP除了作为全身炎症反应标志物的重要作用外，携带TF的MP升高还可被视为全身性感染的早期指标,可用于指导进一步的抗菌药物治疗。由于炎症反应和凝血反应密切相关，携带TF和PS的MP可能在脓毒症并发VTE的发展中发挥重要作用51L通过监测脓毒症患者循环MP的变化，可以为改进脓毒症患者的治

18、疗方案提供重要信息，较为有效的抑制病程的进展以及严重并发症的发生。（六）癌症癌症相关VTE的发病机制与一般VTE有很大不同，目前，关于MP在癌症相关VTE中的作用正在争论中。VTE的发病率值因癌症类型而异。肿瘤细胞衍生的EV显示出激活凝血和促进血栓形成的特性,以TF依赖性方式促进癌症患者体内凝血和血栓形成39,53静脉注射胰腺癌细胞产生的TF阳性MP诱导小鼠DVT的发生540与黑色素细胞相比，黑色素瘤衍生的MP表达更高水平的TF,表现出更强的促凝血活性，阻断TF可完全消除黑色素瘤衍生的MP的促凝特性55L此外，与没有VTE病史的患者相比，有VTE病史的软组织肉瘤患者的血小板衍生MP水平更高，与

19、VTE的发生相关，因此，检测血小板衍生MP可能是早期诊断软组织肉瘤患者VTE风险增加的工具，可据此采取预防性抗凝措施，减少VTE的发生561然而，也有研究指出，尽管在癌症患者（伴或不伴VTE）的血浆中观察到携带TF阳性MP数量增多，但其数量与血栓形成之间不存在显著关联，而是与癌症患者的死亡率和预后独立相关。MP对癌症相关VTE的贡献是相当复杂的，在某种癌症类型中可能涉及多种机制，抑制癌细胞产生MP,可能会减少癌症相关的血栓形成，改善癌症患者的预后。四、MP作为VTE新型生物标志物的潜力和挑战MP表面和内部携带大量母细胞来源的生物活性物质，在细胞间通信，炎症和凝血中发挥重要作用。MP广泛存在于血

20、液、尿液、羊水等多种体液中，且在多种疾病中均发现MP数量及其内容物的异常，因此MP有希望成为无创液体活检的指标。止血是凝血系统、抗凝血系统和纤溶系统共同作用平衡的结果，任一系统的失衡都可能导致出血或者血栓栓塞形成。研究证明MP对凝血系统的调节不限于其表面暴露的PS和TF等促凝分子,还包括转移MP内容物，参与细胞间通信等。作为血栓形成研究领域的一个新角色，MP可能是提示体内的凝血状态的新指标。考虑到几乎所有凝血因子都是由肝细胞合成的,所以肝脏来源的MP可能是探索VTE的机制的重要线索，或可为血栓风险预测和诊断提供新的指标。值得注意的是，诱发VTE的疾病是多样而复杂的，MP在不同疾病以及疾病的不同

21、阶段，动态地作用于凝血系统和炎症系统，其作用可能在全身循环和病灶局部有所差异,因此MP在临床上的应用仍有较多待解决的问题。首先MP的实验室制备和监测尚无标准化流程，各实验室之间的检测结果无法进行比较。因此MP的提取和研究程序的标准化对于综合各实验室的研究成果，快速推动MP在临床疾病中的研究十分重要。其次，不同细胞产生的MP差异较大，不同疾病状态MP的变化也不尽相同，因此特定细胞来源的MP在特定疾病中发挥的作用及其机制，仍需要未来更加深入和细致的研究。此外，目前大多数实验存在排除标准多且队列小，样本是单采样时间点等局限，导致纳入研究的人群高度异质化，或者无法反映MP在整个病理进程中所发挥的动态作用。因此扩大样本来源，降低排除标准,将扩大MP相关的研究成果的应用人群，在疾病过程中连续监测MP的动态变化，可以更好地揭示其在特定疾病过程中发挥的作用。五、小结与展望总体而言，MP在预防和诊断VTE中潜在的应用前景是巨大的，但是落实任一方面的应用都需要解决MP检测的方法学挑战,包括标准化MP的检测、扩大研究中心和临床适用性评估等。