免疫自动化分析仪器让您做第一时间的知讯人.ppt
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1、第二十三章 免疫自动化仪器分析,本章学习要点:,掌握:自动化免疫比浊分析原理及类型,化学发 光自动化免疫分析原理及类型,荧光免疫 自动化分析原理及类型,各类型分析特点。熟悉:分析试剂中不同标记物的作用原理及类型,抗原过量检测设计原理。了解:自动化分析的发展历史、基本原理、临床 应用范围。,第二十三章 免疫自动化仪器分析,手工操作,分析自动化,免疫学的发展,分析自动化,临床化学特殊化学析灵敏度精密度速度快微量和超微量,计算机技术材料科学进步生物学技术,第二十三章 免疫自动化仪器分析,免疫学测定(IA)利用抗原和抗体特异性结合反应的特点,检测样本中微量物质的方法,各个领域,免疫球蛋白及其片 补体、
2、细胞因子、体黏附分子及其配体,病原体抗原或体、多种凝血因子、酶和 同工酶、激素及多肽,肿瘤标志物、药物及毒品等,高精度,高效率,免疫分析的基本技术新技术的应用,第二十三章 免疫自动化仪器分析,手段更先进,方法更可靠,灵敏度达到ng或pg心肌标志物、内分泌激素、血浆特种蛋白、肿瘤标志物维生素及治疗药物,更快更准确,酶免疫分析生物素-亲和素技术荧光免疫分析化学发光技术,自动免疫分析仪的结构特点:,第二十三章 免疫自动化仪器分析,主机部分,发射光源系统,信号检测系统,稀释加样清洗,样处理系统品,计算机系统,信息处理及数字转换,信息储存分析报告系统,报告打印,SYNCHRON CX PROSeries
3、SYNCHRON LX,LX20 PROSeries,IntegratedSystemSolutions,YNCHRON LXi 725SCOULTER LH 755,InstrumentSolutions,基于系统的自动化,SYNCHRON CX PROSeriesSYNCHRON LX,LX20 PROSeries,IntegratedSystemSolutions,YNCHRON LXi 725SCOULTER LH 755,InstrumentSolutions,基于系统的自动化,临床实验室 自动化,设计思路五点技术指标,第二十三章 免疫自动化仪器分析,检测用抗体必须具有高特异性和高亲
4、和力,通常采用磁性微球作为固相载体,增加反应面积,放大反应信号,最常使用生物素-亲和素包被、酶-发光底物、酶-荧光底物、元素-化学发光、元素-荧光系统,保证对微量样本、小分子多肽或蛋白敏感、准确,结合计算机软件系统自动处理分析信号及数据转换,人工智能化的设计,自动检测及校对功能,免疫检测的基础抗原抗体间的特异性反应 手工操作 自动化分析免疫比浊分析技术发展,第一节 自动化免疫比浊法,核心基础,两个阶段,测定抗原抗体形成后的阶段 散射(终点)比浊,测定抗原抗体结合的峰值 速率散射比浊,免疫比浊法分类,第一节 自动化免疫比浊法,当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱,透
5、射比浊法:在光源的光路方向(00)测量透射光强度和被检测溶液微粒浓度关系的方法。,散射比浊法:在光源的光路方向(50-960)角的方向上测量透射光强度和被检测溶液中微粒浓度关系的方法。,一、散射免疫比浊分析原理散射比浊法:在液相中可溶性抗原、抗体特异性结合,形成一定大小的复合物粒子,当入射光沿水平轴照射在粒子颗粒上时,光线被颗粒吸收或折射,发生偏转,其偏转的角度与发射光的波长和复合物颗粒大小和多少有关。散射光的强度与复合物的含量成正比,即待测抗原越多,形成的复合物越多,散射光就越强。,第一节 自动化免疫比浊法,影响散射信号的因素:如入射光的波长、偏振、微粒大小、浓度、质量、以及检测点的距离。,
6、第一节 自动化免疫比浊法,(一)散射颗粒与散射光 Rayleigh原理:即散射光的强度与复合物的量呈正比,与散射 光的夹角呈正比,与波长呈反比。在散射比浊中,增加抗原-抗体复合物的体积,减少入射光的波 长,扩大散射光夹角等因素,均可增加检测的敏感度。,如果颗粒直径比入射光的波长小的多 则散射光的分布比较均匀 如果颗粒直径接近入射光的波,则散射光的分布呈明显不均匀,称为Rayleigh散射,称为 Mile散射,第一节 自动化免疫比浊法,(二)反应物含量与散射浊度,Heidelberger曲线:即当抗体量恒定时,形成的抗原抗体复合物的反应与散射信号响应值的上升呈正比。同时,散射信号随抗原抗体反应时
7、间增加而曲线上升。,当抗原量与响应值上升到一极限时,再增加抗原量,使散射响应值迅速下降,因此,在采用散射比浊测定时,一定要保证抗体过量。,第一节 自动化免疫比浊法,二、定时散射比浊分析(一)基本原理,是将沉淀反应与散射比浊分析相结合,“在抗原抗体反 应几秒钟后开始测定峰值信号”。目的是排除抗原抗体反应的不稳定性,降低检测误差。采用抗体过量,以获得颗粒产生的最强的散射光信号。,时间检测分两个,在预反应时段,加小量样本与抗原抗体反应,测定第一次散射光信号值,加全量样本,约反应 2分钟后,第二次测定散射光信号,信号峰值计算机处理转换为样品浓度,第一节 自动化免疫比浊法,二、定时散射比浊分析(二)抗原
8、过量检测,抗体过量 在检测中抗体结合抗原的能力可达到相当于正常 血清的50倍以上,以保证高浓度样本中的抗原与 抗体的结合。对抗原过量进行阈值限定 先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信 号,若未超过阈值,可进行全量样本测定。若超 过阈值,提示样品浓度过高,需稀释后测定。,采用两项保证措施:,第一节 自动化免疫比浊法,三、速率散射比浊分析(一)基本原理,是测定抗原抗体结合反应的动态过程。所谓速率,是在单位时间内抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起,即是动态 的速率比浊分析。当仪器测定到某一时 间内形成速率下降时,即出现速率峰,该峰 值的高
9、低,即代表所 测抗原的量。,第一节 自动化免疫比浊法,三、速率散射比浊分析(一)基本原理(二)抗原过量检测 设计原理,速率峰值一般在25秒时出现。在反应介质中加入一定量的促凝剂,可加速抗 原抗体复合物的形成,以减少反应时间。速率法的优点:是快 速、不需要减去样本 和试剂本底读数,校 正结果也较稳定。,第一节 自动化免疫比浊法,四、免疫透射比浊分析(一)基本原理,当光源的光路(角度与正前方夹角为00时),通 过一定体积的溶液,由于溶液中抗原抗体结合复 合物粒子对入射光因反射、吸收或散射而衰减。透射光的强度和形成的复合物的量呈反比。,检测器,检测器,光源 透镜 滤光片,平光线,散,射,光,透射光,
10、散射比浊、透射比浊光路图,第一节 自动化免疫比浊法,四、免疫透射比浊分析(一)基本原理 是个极其简单的方法。在抗原过量情况下,与待测样品中相应的Ig发生抗原-抗体反应,形成可溶性复合物,使反应介质的浊度发生改变。测量方法利用分光光度计测量被吸收的量。读数以吸收单位(A)或OD值表示,A值反映了入射光和透射光的比率。待测物中Ig含量可通过标准曲线计算得出。待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比,而与透射光呈反比。反应在PEG的作用下,加速复合物的形成。,第一节 自动化免疫比浊法,四、免疫透射比浊分析(二)实验要求,溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm)溶液中形成的复合物分子要足够多 控制
11、抗原抗体反应的温度和时间 加促凝剂,提高复合物形成速度,缩短检测时间 应选择亲和力好、效价高的抗体,保证抗体过量 将标准品稀释至少5个浓度测定,以吸光度值(A)为纵坐标,浓度为横坐标,在半对数纸上绘出标 准曲线,,第一节 自动化免疫比浊法,五、免疫比浊分析的注意事项,(一)校准程序 保证仪器处于正常的工作状态(二)定标及质控程序 保证使用的试剂可靠性,从而检测结果的准确性(三)自动控制系统 自动稀释功能,从而获得准确的光散射信号 仪器均具有自动监测或报警功能,可减少劳动强度,第一节 自动化免疫比浊法,免疫比浊分析的临床应用,检范围测,如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、;补体C3、C4;血浆蛋
12、白AAT、TRF、A1M、CER、HPT、PAB、ALB;炎性反应蛋白 SAA、CRP;载脂蛋白 APO、ABI;尿蛋白系列小分子治疗药物,检范围测,血浆、体液中特种蛋白,第二节 化学发光自动免疫分析,一、化学发光分析的原理 在常温下,一些特定的化学反应产生的能量使其产物或中间态分子激发,形成电子激发态分子;当其衰退至基态时,所释放出的化学能量以可见光的形式发射,这种现象称为化学发光(CL)。能产生CL反应的物质称为化学发光剂或化学发光底物。,发光物标记,元素标记,酶标记,根据标记物分为三大类,特点,化学发光反应与免疫反应结合,即具有免疫反应的特异性,又兼有发光反应的高敏感性。,总称CLIA,
13、第二节 化学发光自动免疫分析,一、化学发光分析的原理 化学发光物质大多数属氧化反应;该反应能提供足够的能量使其产物分子或中间体分子上升至电子激发态;发光物质的理化特性能满足分析设计的要求。,化学发光反应,气相反应体系,液相反应体系,固相反应体系,化学能转化为电子激发态能,使中间体变成电子激发态,即反应生成中间体,激发分子辐射迁回到基态,第二节 化学发光自动免疫分析,二、化学发光分析中的标记物及类型,两种分类法,两类,酶参与的CL反应非酶参与的CL反应,三类,直接参与发光反应的标记物以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物以能量传递参与氧化反应的非酶标记物,(一)直接参与发光反应的标记物 这类
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