第4章12B基因工程.ppt

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1、第四章 基因工程原理基因工程的基本工具Gene Engineering,定 义,基因工程：对生物体遗传信息的基本单元基因进行人工改造、干预和定向转移，其技术特征是将不同种类生物的基因或同种生物体的不同基因按照人们的意愿在体外进行拼接重组和变异，通过载体-宿主系统转入另一种生物体内，使之能按照人们的意愿稳定遗传、复制和表达，实现按照人们的意愿，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状的目的。,基因工程基础核酸,http:/,基因工程药物的生产过程,获得目的基因,构建基因工程菌,工程菌大规模培养,分离提取目的产物,重组质粒,第一节 基因工程菌的构建与培养,一、工程菌简介,基因工程菌：微生物为操作对象

2、，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。种类：细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。,1、生产药物,表（续）,表（续）,2、生产限制性内切酶,已商品化400多种,EcoRI GAATTCEcoRV GATATCBamHI GGATCCBglII AGATCTBstI GGATCCHindII AAGCTTHpaI GTTAACKpnI GGTACCMboI GATC,3、生产生物小分子,合成Vc,双（多）菌发酵 单菌发酵,合成靛蓝 蓼兰叶提 化学合成 重组大肠杆菌生产,生产氨基酸,合成新的抗生素,4、生产生物多聚体,足丝粘性蛋白 蓝贻贝 强度特别高、防水生

3、物合成橡胶 蔗糖 17酶反应 可降解塑料 PHA、PHB,基因工程在生物工艺中的应用,筛选和鉴定具有重要生理功能或重要用途的目的基因；筛选、修饰和重组构建基因表达的转录调控元件和蛋白质生物合成的翻译调控元件；通过目的基因与载体分子重组，利用载体分子的扩增提高目的基因在受体细胞中的剂量来提高表达水平；工程菌的稳定增殖和目的基因的稳定表达；基因表达产物的后处理等；,大规模生产生物活性物质,工程细胞,基因工程蛋白质工程途径工程,发酵工程细胞工程,分离工程,酶,酶工程,分离工程,天然细胞,天然细胞,生物活性物质,基因工程的基本形式,第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程,第二代基因工程

4、蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程,第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程,第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程,3 基因工程的基本条件,C 用于基因转移的受体菌或细胞,B 用于基因克隆的载体,A 用于核酸操作的工具酶,A 用于核酸操作的工具酶,3 基因工程的基本条件,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修饰酶,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链,主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵,细菌的限制与修饰作用,hsd R：编码限制性核酸内切酶,hsd M：编码限制性甲基化酶

5、,hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出,Hind II和Hind III,限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随

6、机性切割,特异性切割,24-26bp处,型酶：来源：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。限制修饰:同时具有内切酶和甲基化酶的活性，蛋白结构:分子量较大,是一个三亚基双功能酶。辅酶：Mg2+、ATP、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、识别位点：15bp，非常特异5-TGNNNNNNNNTGCT-33-ACTNNNNNNNNCGA-5N:任一碱基；：6-甲氨基嘌呤酶切位点：识别位点上游约1000bp处.但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n

7、d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,4.识别顺序,识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,EcoR I的切割位点,识别序列一般是回文序列Eco RI 5-G A A T T C-33-C T T A A G-5简并识别序列有些酶的识别序列不是一个，而是多个。在基因重组

8、时要尽量少用这些酶,2、特点,识别位点与酶切位点高度一致，具有高度特异性。极为稳定辅酶：Mg+,5、酶切位点,II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或附近，产生以下4种情况。5粘性末端；3粘性末端；平末端和非互补的粘性末端无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内切酶，所留下的残端都是一样的。经酶切后，5端总是保留一个磷酸根；3端总是保留一个OH,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37,退火 4-7,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C

9、-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操

10、作,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0-150 mM,DTT,1 mM,0-50 mM 低盐酶,100 mM 中盐酶,150 mM 高盐酶,Volume,20-100 ml,T T,37 1-1.5 hr,1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全,水解 1 mg 标准DNA所需的酶量,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCA

11、T3,3 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,BamHI SmaI,5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA5,5 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,0.1倍体积的 5 M

12、 NaAc pH 5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的纯度：,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的甲基化程度：,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位,引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、,Bgl II、Sau3A I不受影响,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序

13、列,中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,核酸内切酶的缓冲液性质：,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即,所谓的Star activity现象,EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘,油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者,5AATT3,大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75Ku的多肽链。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶的

14、分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60Ku，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆

15、菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G

16、 A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,连接多个平头双链DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50-100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5-1 mM,DTT,5 mM,Volume,10-20 ml,T T,4-15 4-16 hr,1 U

17、 DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，,完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量,DNA连接酶,平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol

18、 I,全酶）,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5 ppp dN Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）,缺口前移标记法,大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A

19、 5,Mg2+5 dNTP 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Nick translation,制备32P标记的探针,DNase I,DNA pol I,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,Klenow酶的基本性质：,大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端,三分之二的大肽段，即为Klenow酶,Klenow酶仍拥有53的D

20、NA聚合酶活性和35的核,核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,Klenow酶的基本用途：,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,cDNA第二链的合成,双脱氧末端终止法测定DNA序列,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T

21、-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,DN

22、A聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本特性：在模板及引物存在的条件下，T4 DNA聚合酶催化沿53方向DNA的合成。本酶还具有35外切核酸酶的活性，该活性比DNA聚合酶I强。T4 DNA聚合酶不像大肠杆菌DNA 聚合酶 I，不具有53 外切核酸酶的活性。,在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切,在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止,在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,应用：,3突出末端平滑化（1，2）5突出末端补平（3）单链删除后亚克隆（3）基因定位突变中的第二条链的合成（4）通过置换合成法（replacement

23、 synthesis）对DNA探针进行标记。,DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5,T4-DNA聚合酶,5 G-C-T-C-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-C-C-T-C 5,注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多,DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

24、-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+5 ppp dN 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-OH,HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA pol,T4-DNA pol,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,DNA聚合酶,依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,反转录酶,Mg2+dNTP,5TTTTTTTTTTTT o

25、ligo(dT)12-18,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTTTT,3cDNA,DNA聚合酶,依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,反转录酶,3 RNA,5 DNA,3,5,3 RNA,5 DNA,3,5,反转录酶,5 DNA,3,DNA聚合酶(DNA polymerase),核酸酶,单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+,ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,核酸酶,双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）,ExoVII,3

26、,5,3,5,Mg2+,3,5,3,5,大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切,核酸酶,双链核酸外切酶：l 核酸外切酶（lExo）,lExo,3,5,3,5,Mg2+,l核酸外切酶特异性地从5 端外切,3,5,3,5,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae）,Zn2+必需,最适pH范围为4.0-4.3,需要NaCl 10-300 mM,降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍,降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA,

27、5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5 dNMPs 或 5 NMPs,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C A-C

28、-C-T-C-A 5,nick,gap,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G,3 C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A 5,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1 mapping）,DNA,mRNA,杂交,S1,EcoRI,核酸酶,单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,S1核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）,Ca2+,5 dNMPs 或 5 NMPs,ssDNA or RNA,Ca2+,Ca2+,核酸酶,单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,Bal31核酸酶的基本用

29、途：诱发DNA突变,EcoRI,A,B,C,EcoRI,EcoRI,B,C,A,Bal31,B,C,A,环化,A,C,核酸修饰酶,末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）,TdT的基本特性：来自小牛胸腺,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,TdT的基本特性：,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+dATP,5 p,3 HO AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA OH 3,p 5,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+dATP,5 p,3

30、 HO,AAAAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,AAAAAAAAAAA,核酸修饰酶,碱性磷酸单酯酶,来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）,来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）,5 p,OH 3,DNA or RNA,5 ppp dN,5 pppN,BAP/CIP,OH 3,5 HO,5 HO dN,5 HO N,核酸修饰酶,T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷,5 HO,3 HO,OH 3,OH 5,T4-PNP,Mg2+pppATP（g-32P-ATP）,5 p,3 HO,OH 3,p 5,用于探针的末端同

31、位素标记：,基因工程中常用的工具酶,DNaseI,1.特点：具内切酶活性，作用于双链DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg 2+或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值当酶浓度很低时，双链DNA分子上将形成切口Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置2.用途：切口移位，制备DNA探针制备RNA样品时除去DNA分子基因突变时产生切口,TaqDNA聚合酶,1.特点：分离自水生耐热菌，分子量为94,000，最适反应温度75，对95高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性2.用途：主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应

32、稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4106倍。,RNA聚合酶,特点：依赖于DNA的RNA聚合酶，具SP6启动子特异型用途：主要用于RNA分子的体外合成，RNA分子可用于：RNA分子的拼接研究标记的RNA常用于杂交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA具高放射比活性DNA的定序分析基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置还可以用于蛋白质的合成研究,其它酶类,1.原生质体的制备酶类制备原生质体目的：外源DNA导入；核酸和蛋白质的提取溶菌酶，zymolyase，glusulase，NovoZyme，溶壁酶，纤维素酶2.蛋白质降解酶类蛋白酶K3.检测酶类抗生蛋

33、白链素-半乳糖苷酶,碱性磷酸酶,辣根过氧化物酶,B 用于基因克隆的载体,3 基因工程的基本条件,质粒（plasmid）,噬菌体或病毒DNA,考斯质粒（cosmid）与噬菌粒,人造染色体载体,载体的功能及特征,载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体的基本特征及特征,载体应具备的条件,在载体中有若干可供外源DNA插入的限制性核酸内切酶位点，插 入外源DNA片段后不影响其进入宿主细胞和细胞中的复制；能高效进入宿主细胞，并能在一定程度上相对稳定存在；有较高的自我复制能力；带有显性的转化子选择标记和方便检测

34、的重组子识别筛选的标志；带有实现载体功能所需的基因序列。,质粒,质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并,被稳定遗传的一类核酸分子,质粒常见于原核细菌和真菌中,绝大多数的质粒是DNA型的,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，,即cccDNA,质粒DNA的分子量范围：1-300 kb,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为,两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝 stringent

35、plasmid,松弛型复制控制的质粒 10-60 拷贝 stringent plasmid,质粒,质粒的基本特征,质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于,一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,粒组成不相容性群,质粒,质粒的基本特征,质粒的不相容性：分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种,拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不

36、同，,两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的,拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，,因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一,细胞内,其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,质粒,质粒的基本特征,质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到,另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等,如Col、R的其它成员,非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒,的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和,mob 基因

37、决定,质粒,质粒的基本特征,携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,质粒,质粒的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：,pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr,Col

38、E1 6.5 kb 拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,质粒,质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker,整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、

39、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,pBR322,质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。质粒载体pBR322的大小为4361bp，相对

40、分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。同时，由于其为人工构建质粒，虽然带有抗药性基因，但已不能在自然界的宿主细胞间转移，同时应用安全菌株，亦不会引起抗生素抗性基因传播。,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18/19：,拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和

41、测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18/19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,酶所识别，因此相

42、应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,质粒,质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,质粒,质粒DNA的分离纯化,氯化铯密度梯度离心法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,质粒,质粒DNA

43、的分离纯化,碱溶法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,用无DNase的RNase去除残余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,质粒,质粒DNA的分离纯化,沸水浴法：,用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒钟,离心，用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA,噬菌体或病毒DNA,噬菌体

44、或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染,宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏,起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工,程的有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性：生物结构,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,l 噬菌体生物学特性：生物结构,5 TCCA

45、GCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75-105%,即 36-51 kb,D,A,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l

46、 噬菌体生物学特性：溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能

47、被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,噬菌体载体-类噬菌体载体,构建噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。按照这一基本原理构建的噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：一种是插入型载体（insertionvectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。另一种是替换型载体（rePlacementvectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。在基因

48、克隆中的二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,（51 37）,（i）插入型载体,外源的DNA克隆到插入型的载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。插入型的载体又可以分为免疫功能失活的（ina

49、ctivatiortofimmunityfunction）和大肠杆菌-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofEcoli-galactosidase）两种亚型。免疫功能失活的插入型载体：在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插入的重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。-半乳糖苷酶失活的插入型载体：它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码着半乳糖着酶基因lacZ。

50、由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,（ii）替换型载体,替换型载体又叫做取代型载体（substitutionvector），是一类在噬菌体基础上改建的、在其中央部分有