第06章核苷酸与核酸.ppt

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1、第 六 章核苷酸与核酸Nucleotides and Nucleic Acids,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,1868年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取核素。1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质。1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构。1968年 Nirenberg发现遗传密码。1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶。1981年 Gilbert和Sanger建立DNA测序方法。1985年 Mullis发明PCR技术。1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)。

2、1994年 中国人类基因组计划启动。2001年 美英等国完成人类基因组计划。,核酸研究的发展简史,第一节核酸概述The Generality of Nucleic Acids,一、核酸的基本结构单位是核苷酸,二、核苷酸由碱基、戊糖、磷酸组成,（一）核酸中的碱基,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),稀有碱基(rare base)：核酸中含量甚少的碱基。大多数都是甲基化碱基。tRNA中含有较多的稀有碱基，可高达10%。,核酸中部分稀

3、有碱基,（二）核苷酸中的戊糖,H,（三）核苷：AR,GR,UR,CR,嘌呤N-9或嘧啶N-1与核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成核苷(ribonucleoside)。,N,N,N,N,9,N,H,2,O,O,H,O,H,H,H,H,C,H,2,O,H,H,1,2,糖苷键,嘌呤N-9 或嘧啶N-1与脱氧核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成脱氧核苷(deoxyribonucleoside)。,糖苷键,脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR,（四）核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,腺嘌呤核苷三磷酸 ATP,腺嘌呤脱氧核苷一磷酸 dAMP,环式腺

4、苷一磷酸cAMP(环磷酸腺苷),环式鸟苷一磷酸cGMP(环磷酸鸟苷),鸟苷四磷酸 ppGpp,核苷酸的功能,脱氧核苷酸：DNA的组成成分，为数不多的参与代谢的调节。核糖核苷酸：RNA的组成成分，还以多种方式参与细胞内的生理和生化过程。,体内重要的游离核苷酸及其衍生物,含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP,多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,环化核苷酸:cAMP，cGMP,cAMP,三、核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接成多聚核苷酸（核酸）,3,5-磷酸二酯键是核酸的基本结构键，多聚核苷酸链方向性。,C,G,A,3,5-磷酸二酯键,多聚核苷酸链方向

5、性,四、核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸两类,（一）RNA是单链多聚核糖核酸（二）DNA是单链或双链多聚脱氧核糖核酸（三）组成DNA和RNA成分不同（四）多聚核苷酸中核苷酸的排列顺序是核苷酸的基本结构（一级结构）,核酸的一级结构：核酸中核苷酸的排列顺序,核苷酸间的差异主要是碱基不同，也称为碱基排列顺序。即碱基序列。,3,5-磷酸二酯键,书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,目 录,核酸分子大小表示法:单链DNA或RNA:碱基数目,base,kilobase.双链DNA或RNA:碱基对数目,base pair(bp)kilobase pair(kb)小的

6、核酸片段(50bp),称为寡核苷酸(nt),第二节DNA的三维结构The Three Dimensional Structure of DNA,DNA的空间结构又分为二级结构(secondary structure)和高级结构。,DNA的空间结构(spatial structure),构成DNA的所有原子在三维空间具有确定的相对位置关系。,一、DNA的二级结构是双螺旋结构,（一）Waston和Crick提出DNA双螺旋结构模型,碱基组成分析A=T、G C,不同生物碱基组成不同,同生物、不同组织碱基组成相同,目 录,模型理论基础：hargaff 规则,获得了高质量的DNA分子的X射线衍射照片。,

7、DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,1、反向平行、右手螺旋的双链结构：两条相互平行、走向相反的脱氧核苷酸链组成 围绕同一个螺旋轴形成右手螺旋 双螺旋结构的直径为2.37nm，螺距为3.54nm,目 录,亲水性的脱氧核糖-磷酸为骨架位于双链的外侧。疏水性的碱基位于双链的内侧。,碱基垂直螺旋轴与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;GC）。,目 录,2.DNA双链之间形成了互补碱基对,碱基互补配对:鸟嘌呤/胞嘧啶,碱基互补配对:腺嘌呤/胸腺嘧啶,大沟与小沟,大沟与小沟,目 录,互补碱基对的氢键维系DNA横向结构的稳定。相邻两个碱基对互相重叠产生的疏水作用，成称为碱

8、基堆积力(base stacking interaction)。维系DNA纵向结构的稳定,3、疏水作用力和氢键共同维系着DNA双螺旋结构的稳定。,碱基堆积作用力,（三）DNA双螺旋结构的多样性,（三）DNA双螺旋结构的多样性,B型DNA:Watson和Crick,右手螺旋(1953年)A型DNA:Wilkins(1953年)Z型DNA:Rich等,左手螺旋,(1979年),三种DNA构型的比较,（四）某些DNA 具有更复杂的螺旋结构,Hoogsteen碱基配对 形成三股螺旋DNA T*A=T C*G=C,H-DNA的结构,三链结构,鸟嘌呤之间通过Hoogsteen氢键形成特殊的四链结构(tet

9、raplex)。,四链结构,24条多聚鸟嘌呤核苷酸链形成四螺旋DNA,真核生物DNA3-末端是富含GT的多次重复序列，因而自身形成了折叠的四链结构。,回文结构：反向重复序列1、中线水平回折1800：5-TTAGCACCACGATT-3 3-AATCGTGGTGCTAA-52、水平回折：5-TTAGCACGTGCTAA-3 3-AATCGTGCACGATT-53、部分回折：5-TGCGATACTCATCGCA-3 3-ACGCTATGAGTAGCGT-5,3.在特异碱基序列基础上DNA局部可形成特殊结构,碱基序列依赖性的局部DNA 可形成发夹形或十字形结构,5-TGCGATACTCATCGCA-

10、33-ACGCTATGAGTAGCGT-5,二、DNA的三级结构是超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil)DNA在双螺旋基础上通过扭曲、折叠形成的特定三级结构。即超螺旋结构。双螺旋缠绕过分或不足产生的张力，使DNA分子发生扭曲，以抵消张力，这种扭曲称为超螺旋结构。,意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,（一）原核生物DNA的是环状超螺旋结构,大肠杆菌DNA，4639 bp,环状超螺旋结构,共价闭环双螺旋结构,（二）真核生物的线粒体、叶绿体DNA也是环状超螺旋结构,线粒体DNA(mtDNA):是一个封闭的双链环

11、状分子。人mtDNA全长16,569个碱基对，共计37个基因,分别编码13个蛋白质、2个rRNA、22个tRNA。,（三）拓扑异构酶改变超螺旋的数量和类型,正超螺旋(positive supercoil)双螺旋缠绕过分产生的超螺旋，为左手超螺旋。,负超螺旋(negative supercoil)双螺旋缠绕不足产生的超螺旋，为右手超螺旋。,1核酸拓扑同分异构体,环状DNA的三种拓扑异构体示意图,松弛形环状,负超螺旋（右手）,正超螺旋（左手）,环状 B-DNA：2000 bp、右手双螺旋周数 200,Lk：双螺旋周数,2拓扑连环数,Lk Tw+Wr,Lk：拓扑连环数（linking number）

12、闭合环状 DNA 双链的互绕数。实际双螺旋周数Tw：扭曲数（twisting number）松弛形DNA双螺旋周数（Lk0）,由构象决定的。B-DNA：Tw=Lk0=碱基对数除以10；2000 bp：Tw=200 B-DNA：右手螺旋，Tw为+；Z-DNA：左手螺旋，Tw为-Wr：超螺旋数或缠绕数（writhing number）Wr=Lk=Lk-Lk0,拓扑同分异构体的产生环状 B-DNA：2000 bp LK0=+200 右手螺旋 松弛形：Lk=Lk0=200 Wr=Lk-Lk0=200-200=0 正超螺旋：Lk=202 Wr=202-200=+2 Wr为正，左手超螺旋 负超螺旋：Lk=

13、198 Wr=198-200=-2 Wr为负，右手超螺旋,拓扑同分异构体的产生 环状 Z-DNA 2400 bp LK0=-200 左手螺旋 松弛形：Lk=Lk0=-200 Wr=Lk-Lk0=-200+200=0 正超螺旋：Lk=-202 Wr=-202+200=-2 Wr为负，右手超螺旋 负超螺旋：Lk=-198 Wr=-198+200=+2 Wr为正，左手超螺旋,3.比超螺旋（specific superhelix）超螺旋密度（superhelical density）Wr/Tw，或（Lk-Lk0)/Lk0 正超螺旋：=(202200)/200=2/200=0.01 负超螺旋：=(198

14、200)/200=-2/200=-0.01：DNA拓扑同分异构体超螺旋方向和数量。,3、拓扑异构酶（Topoisomerase）催化DNA连环数的改变,概念：能够引起拓扑异构反应的酶。作用：既能切开又能连接DNA，DNA解链时切开DNA，使DNA拓扑异构体发生改变，不至于打结，适当时候又把切口封闭，,类型：大肠杆菌：至少有2型4种拓扑异构酶。型拓扑异构酶：拓扑异构酶 拓扑异构酶，功能：去除负超螺旋而松弛DNA；型拓扑异构酶：拓扑异构酶 拓扑异构酶，功能：是引入负超螺旋。,真核生物细胞：I型拓扑异构酶：拓扑异构酶I 和III；II型拓扑异构酶：拓扑异构酶II和II。与原核生物的拓扑异构酶不同，拓

15、扑异构酶I：能消除负超螺旋，也能消除正超螺旋，拓扑异构酶III只消除负螺旋，但活性较低。,三、真核生物DNA与组蛋白组成高度有序的染色体,（一）核小体(nucleosome)是染色质的基本组成单位，由DNA和蛋白质构成。,双链DNA缠绕在组蛋白核心上构成核小体：组成：DNA：约 200 bp 组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4,2组蛋白是小分子量的碱性蛋白质,5种组蛋白：分子量和氨基酸序列有差异；分子量：1121kD，富含精氨酸和赖氨酸。H3，H4氨基酸序列高度保守，序列相似性多，提示功能相同。H1、H2A、H2B的相似性很少。,核心颗粒：146bp H2A,H2B,H3,H4各两分子1

16、46bp,14 0bp,连接区：60bp H1,核小体的结构示意图,a 组蛋白八聚体核心 b 核小体 c 直径30nm纤维的剖面图显示H1的位置 d 核小体组成串珠样的染色质,a,c,b,d,（二）核小体进一步组装成染色质/染色体,DNA双螺旋结构：2 nm第1层次:核小体：200bp,10nm,体积减少6倍第2层次:纤维状结构：6个核小体卷曲,30nm,40倍第3层次:柱状结构:300nm染色质:700nm,1000倍染色体:1400nm,10000倍,端粒,着丝粒,端粒,端粒和着丝粒的结构示意图,基因，分散的重复序列和多重复制起点,（三）真核生物染色体有端粒和着丝粒两个功能区,1端粒(te

17、lomere)：是染色体末端的结构,端粒 DNA：重复序列:5-(TxGy)n,比 3-(AxCy)n 长12-16nt。人 1000-1700次，单细胞 20-100 端粒蛋白：结合端粒DNA，保护染色体3末端 TRF-1、TRF-2(telomere repeat binding factor)结合端粒DNA形成T环端粒末端结构。端粒酶：含酶蛋白和RNA 以端粒酶RNA为模板，延长染色体3末端。,端粒酶,端粒酶RNA,模板DNA结合蛋白,TRF1和TRF2,端粒结构,a 端粒末端DNA序列和端粒酶及端粒酶中的RNA序列 b 端粒末端结构示意图,图 a,图 b,2着丝粒是连接两个染色单体的中

18、心部位,着丝粒（centromere）在有丝分裂时，使染色体均等有序地进入子代细胞。着丝粒结构：富含AT，序列简单。酵母着丝粒长130bp。高等真核生物细胞的着丝粒，含有上千个串联短序列拷贝。不同的物种着丝粒重复序列变化很大，反映进化速率快慢。着丝粒DNA的确切功能依然不清楚。,四、DNA是遗传的物质基础,以基因的形式携带和传递遗传信息。DNA的碱基序列含有遗传信息，可作为复制和转录的模板传递遗传信息。是生命遗传的物质基础，也是生命活动的信息基础。,基因的遗传学定义:是携带遗传信息的结构单位，控制遗传形状的功能单位。,基因从结构上定义：(Principles of Biochemistry 3

19、th)A segment of a DNA molecule that contains the information required for the synthesis of a functional biological product,whether protein or RNA,is referred to as a gene.（P325)A gene,therefore,is all of DNA that encodes the primary sequence of some final gene product,such as a polypeptide or an RNA

20、 with a structural or catalytic function.(P908)编码有功能的多肽链或RNA所必需的DNA片段。,（二）细胞中全部遗传信息称为基因组(genome),基因组（genome）一个细胞或病毒的全部遗传信息。绝大多数生物个体的基因组是DNA，但有些病毒的基因组是RNA。,在真核生物体，基因组是指一套完整的单倍体的染色体DNA和线粒体DNA的全部序列。,All of a cells genes and intergenic DNA(the DNA between genes)form the cellular genome.P907,人类基因组：3X109

21、bp 30%编码蛋白质相关，1.5%编码外显子；45%转座子DNA,可从基因组的一处转移到另一处的长短不一的重复序列。25%其它序列：3%为SSR(简单重复短序列)，存在端粒和着丝粒。,（三）常染色质与异染色质的DNA活性不同,常染色质（euchromatin），相对比较伸展，是基因表达活跃区域。对DNase敏感。异染色质（heterochromatin），折叠压缩程度较高，是转录不活跃的区段，占染色质的10%，如着丝粒、端粒等。,第三节 RNA的结构与功能 RNA Structure and Function,RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。RNA比DNA小的多

22、。RNA的种类、大小和结构远比DNA表现出多样性。RNA与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。,RNA的特点：,一、动物细胞内有4大类RNA,动物细胞内主要的RNA种类及功能,二、信使RNA：具有共同的基本结构框架和编码功能,*真核mRNA的成熟：由hnRNA经过剪切,目 录,mRNA结构特点：,氨基酸编码区5非翻译区、3非翻译区5末端帽子结构（m7GpppNm-）3末端多聚腺苷酸(polyA)结构,帽子结构,（一）5-端具有共同的帽结构 真核生物mRNA的5末端7甲基鸟苷-三磷酸鸟苷结构称为帽子结构。,5，5-磷酸二酯键,转录后在5末端加上一个7-甲基鸟苷，同时第一或第二个核苷酸的C2

23、也进行甲基化，形成m7GpppNm-。,帽子结构的功能：维持mRNA 5末端稳定性。与帽结合蛋白（cap binding proteins,CBPs）结合，转运mRNA到细胞质。与核蛋白体、翻译起始因子的结合，参与翻译起始过程。,（二）3-末端具有多聚A尾结构 真核mRNA的3末端多聚腺苷酸poly(A)结构，称为多聚A尾。PolyA与PolyA结合蛋白（PolyA binding protein,PABP)结合，每1020个碱基结合一个PABP单体。形成PolyA蛋白质多聚体复合物。mRNA核内向胞质的转移；维持mRNA3末端稳定性。,mRNA分子从5-末端的AUG开始，每3个核苷酸为一组，

24、决定肽链上一个氨基酸，称为三联体密码(triplet code)或密码子(codon)。由AUG及其以后的连续三联体密码(无终止信号)组成的核苷酸序列称为开放阅读框(open reading frame，ORF)，是多肽链的编码序列。,（三）信使RNA中间序列编码多肽链,（一）tRNA分子含有较多稀有碱基7495个核苷酸组成，含 1020%稀有碱基，如 DHU具有 TC(:假尿嘧啶核苷)3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G,三、转运RNA具有特征性的分子结构,tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,tRNA中含有多种稀有碱基,1 3,1.氨基酸臂 2.反密码环 3.D

25、HU环 4.TC环 5.额外环,（二）tRNA的二级结构形似三叶草,tRNA单链局部碱基互补形成双链结构。茎环结构(stem-loop)发夹结构(hairpin)。,3-末端都以CCA结尾。3-末端的A与氨基酸共价连结，携带氨基酸不同的tRNA结合不同氨基酸。tRNATyr:未结合酪氨酸的tRNA(未结合)Tyr-tRNATyr:已结合酪氨酸的tRNA(已结合),tRNA的3-末端连接氨基酸,tRNA的反密码子环上有一个由三个核苷酸构成的反密码子(anticodon)。tRNA上的反密码子依照碱基互补的原则识别mRNA上的密码子。,tRNA的反密码子识别mRNA的密码子,（三）tRNA的三级结

26、构呈倒L型,环,氨基酸臂,DHU环,反密码环,反密码子,tRNA三级结构及氢键的位置,*rRNA的结构,四、核糖体RNA的结构更复杂,*rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA,原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA,（一）原核生物有3种rRNA，真核生物有4种rRNA,（二）原核生物和真核生物的核糖体均由容易解聚的大、小两个亚基组成。,rRNA与核糖体蛋白质共同构成核糖体。核糖体是蛋白质生物合成的场所，为肽链合成所需要的mRNA、tRNA、多种蛋白因子提供了相互结合的位点和相互作用的空间环境。,（三）核糖体是蛋白

27、质合成的场所,五、细胞内尚有大量其他小分子RNA,除三种RNA外，细胞存在的其他种类小分子RNA，统称为非mRNA小RNA,非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs,snmRNAs)。,snmRNAs的种类核内小RNA核仁小RNA胞质小RNA催化性小RNA小片段干涉 RNA(siRNA),研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。参与基因的表达和转录调控。,RNA组学,（一）细胞核内小RNA 参与mRNA前体的剪接过程,（二）催化性RNA也参与特殊RNA剪接,具有催

28、化作用的小RNA亦被称为核酶(ribozyme)或催化性RNA(catalytic RNA)。催化特定RNA降解，在RNA合成后的剪接中具有重要作用。RHA基因组剪切。,（三）核仁小RNA参与rRNA中核苷酸残基的修饰,（四）小干扰RNA参与转录后调控,siRNA是生物宿主对外源基因表达的双链RNA进行切割，所产生的特定长度和特定核酸序列的小片段RNA。siRNA可以与外源基因表达的mRNA相结合，并诱发这些mRNA的降解。基于此机理，人们发明了RNA干扰技术。双链RNA对基因表达的抑制作用,被称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）。,小片段干扰RNA(small int

29、erfering RNA,siRNA),miRNA是体内基因表达产物，与siRNA有相似的功能，在基因表达调控中起重要作用。对生长发育和行为具有十分深远和复杂的影响，与人类疾病发生发展密切相关。对miRNA的研究还处在理论水平，对它的应用还有待进一步探讨。以miRNA为靶点或者以miRNA为诊断和治疗手段的设想，将成为研究的一个焦点。,微小RNA：（microRNA，miRNA）：,近几年生命科学研究的热点，2001-2003年Science杂志连续将siRNA、miRNA、RNA干扰方面的研究评为十大科技突破。siRNA和miRNA调控基因表达，影响细胞的许多功能，使人们重新认识RNA分子在

30、细胞进化和功能作用的地位以及广泛的应用前景。,siRNA、miRNA的研究,第 四 节核 酸 的 理 化 性 质Physical-chemical Characters of Nucleic Acids,目 录,一、核酸可被酸、碱水解,目 录,核酸中的糖苷键和磷酸酯键都能被酸、碱和酶水解。DNA易被酸水解RNA易被碱水解,二、核酸是两性化合物,（一）碱基可发生互变异构,酮式,烯醇式,氨式,亚氨式,（二）碱基在体液环境中以碱性解离为主（三）核酸分子是酸性化合物 核酸为多元酸，具有较强的酸性。可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇,三、核酸溶液有高分子性质,粘度：DNA RNA、dsDNA ssDN

31、A 粘度大，易断裂。沉降系数：不同空间结构，沉降速率不同；线性 环状 超螺旋的DNA；超速离心分离。,四、核酸有紫外线吸收的特性,核酸的紫外吸收：OD260单核苷酸 ssDNA（或RNA）dsDNA,碱基的紫外吸收光谱,1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,OD260的应用,五、核酸具有变性、复性和杂交行为,定义：在理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。本质：破坏氢键，改变空间结构。方法：强酸

32、、碱，加热，变性试剂（尿素、酰胺）、有机溶剂（乙醇、丙酮）等。理化性质变化：OD260增高.,（一）核酸变性时空间构象破坏,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,DNA的解链曲线,连续加热DNA的过程中以温度相对于A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。,解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应的温度。,解链温度(melting temperature，Tm),热变性,解链温度(melting temperature,Tm)：变性是在一个相当窄的温度范围内完成。,（二）Tm值是DN

33、A变性的重要参数,在变性温度范围内，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度。,Tm值的影响因素：1DNA均一性决定熔解温度范围大小：均质DNA Tm范围小、异质DNA Tm范围大。2G-C碱基对含量决定熔解温度高：G-C与Tm值呈正比3介质中的离子强度影响变性：离子强度低、易变性，Tm低；高盐保存。,（三）变性的核酸可以复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,退火(annealing)：热变性的DNA经缓慢冷却后复性，这一过程称为退火。,1变性的核酸可复性,减色效应：

34、DNA复性时，其溶液OD260降低。,DNA复性影响因素：分子量大、浓度小、重复序列多，复性快,2.具有同源序列的核酸分子可相互杂交,核酸分子杂交（hybridyzation）：不同来源，但具互补序列的核酸，按碱基配对原则形成杂化双链的过程。杂化双链：DNA与DNA分子，DNA与RNA分子，RNA与RNA分子间形成。,DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用（1）Southern印迹可检测DNA（2）Northern印迹用于检测RNA Western印迹用于检测蛋白质,（3）斑点印迹杂交(Dot blot)（4）DNA芯片(DNA microarray)技术也是利用

35、核酸杂交原理设计的。,第 五 节核 酸 酶 Nucleases,核酸酶是指所有可以水解核酸的酶一、核酸酶的分类有多种方法（一）按底物专一性分类DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解DNA。RNA酶(ribonuclease,RNase)：专一降解RNA。,（二）按对底物作用方式不同分类核酸内切酶：限制性核酸内切酶 非特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：53或35核酸外切酶。（三）按对底物二级结构的专一性分类双链酶：作用于双链核酸单链酶：作用于单链核酸,二、核糖核酸酶是一类RNA内切酶,（一）胰核糖核酸酶(RNase1):嘧啶核苷酸（二）RNaseT1:鸟嘌呤核苷酸

36、（三）RNaseT2:腺嘌呤核苷酸,3种核酸酶作用位点,Py:嘧啶核苷酸;Pu:嘌呤核苷酸,三、脱氧核糖核酸酶是一类DNA消化酶,（一）胰DNase：切割单链/双链，产物DNA是5-磷酸末端的寡聚核苷酸（二）脾DNase：产物是3-磷酸末端的寡聚核苷酸（三）BAL 31 核酸酶：DNA外切酶活性为主。（四）限制性内切核酸酶：具有位点特异性。,四、N-糖苷酶可移去碱基,N-糖苷酶（glycosidase）：水解核苷酸的N-糖苷键，切除核苷酸的碱基。有碱基特异性或非特异性的糖苷酶。,第六节重要的核酸分离、分析技术Techniques for Isolation and Identification

37、 of Nuclear Acids,一、分离核酸有多种方法,（一）酚抽提法是分离核酸的基本方法1酚抽提法可抽提DNA 2酚抽提法也可提取RNA（二）超速离心可分离核酸（三）凝胶电泳法分离核酸很常用（四）层析法分离核酸与分离蛋白质原理基本相同1亲和层析法分离特异核酸2凝胶过滤层析又称分子筛过滤,（一）Sanger法又称双脱氧终止法（二）Maxam和Gilbert法是化学裂解测序（三）tRNA序列分析比DNA测序更复杂,二、两种方法常用于核苷酸序列测定,Sanger双脱氧法DNA测序,返回,双脱氧三磷酸核苷酸,ddATP,目的和要求,掌握：核酸的组成与一级结构；DNA双螺旋结构模型特点；mRNA和tRNA结构与功能；核酸理化性质及其应用。熟悉：DNA超螺旋结构与DNA的功能；rRNA的结构与功能；核酸酶与核酶。,