转基因物生和基因打靶.ppt

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1、1,王晓华,转基因生物和基因打靶,第三章,Transgenic biology and gene targeting,第一节 转基因动物,1）转基因：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中。2）转基因技术（Transgene technology）就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，并使其在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变的技术。,转基因动物：以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,转基因动物的研究历史,1974年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜注射法获得转基因小鼠。,1981年，美国

2、科学家成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。1982年获得转基因小鼠。,1989年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠。,1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌-抗胰蛋白酶，含量高达30毫克/升。,1997年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多利”培育成功。,1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展”之一。,1997年10月，英国罗斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出

3、3只携带有人凝血因子基因转染绵羊。,转基因超级鼠,1982年，英国的自然杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中，培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。,超级奶牛体积比普通奶牛的大三倍（英国）,上海转基因动物,遍体白色，颈下的两个肉垂特征明显，除了个头略有大小，长得就像“孪生三兄弟”,东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪,转绿色荧光蛋白的克隆兔,二、基本原理,获取外源目的基因,实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中,目的基因整合到基因组中,再植人受体动物输卵管(子宫),揭

4、示外源基因的功能,显微注射等方法,发育成携带有外源基因的转基因动物,培育优良的动物品种,转基因技术操作的具体流程,（一）目的基因的设计 转基因可分为随机整合型基因和基因敲除（gene knockout）型载体基因。随机整合型基因要求结构完整，包括5上游启动子区和3下游区等，多用基因组文库筛选或人为改造基因，改造基因可选择不同的启动子来控制外源基因表达的组织特异性。基因敲除（gene knockout）型载体基因要设计与待剔除基因的同源性的载体基因。,三、转基因的基本方法,（二）重组载体的构建 选择合适的基因载体，要求载体序列不干扰外源基因的表达、能接受外源DNA容量大小、稳定、对宿主细胞无威胁

5、。（三）重组载体的体外验证（in vitro）重组载体的正确性验证，如拷贝数、连接方向等。对于连有组织特异性启动子或局部体细胞转染的载体需先在同类型的体外离体培养细胞中初步验证表达特性。,（四）基因转移 1）化学法 2）物理法 3）生物法（五）转基因动物模型的验证从基因组、mRNA、蛋白质和整体表型各个层次进行验证。用核酸杂交、聚合酶链反应、免疫印迹杂交、酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法等多种方法，筛选出有外源基因整合的阳性动物，传代后检测外源基因在转基因动物中的表达情况，对外源基因表达产物的生物活性和生化性质进行鉴定，以及检查转基因动物的生理功能和是否出现某些疾病病症状的表型等。

6、,（六）组建转基因系 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能在后代中稳定遗传。,1、显微注射法：以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的外源DNA直接注射到受精卵的原核内，再把接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管，使之发育成正常的幼仔，获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。操作技术性很强，受过严格训练的专业人员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5。因此用增大微注射受精卵的数目的办法提高成功率。,转基因的基本方法,优点

7、：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观；整合率相对高 缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默,注意事项1.显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体系胞后，在染色体上的整合位置是随机的2.外源基因甲基化程度在胚胎发育过程中会影响其活性3.某些外源基因的表达程度可受到个体细胞正常调节机制的控制4.由于受到宿主组织分化的影响，外源基因还具有一定的组织特异性,2、胚胎干细胞（ES细胞）法,ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注射入动物的早期胚胎内，可

8、产生嵌合体，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因。通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。,优点：1.外源基因整合情况的可控性高,可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性2.外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便 缺点：1.ES细胞系建立及培养困难 2.维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易，所得个体为嵌合体,将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的),获得转基因动

9、物的方法。目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作。,3、逆转录病毒感染法,优点：受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高,缺点：容纳大小有限 潜在致癌性,载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性,4、体细胞核移植方法,：将外源基因导入到体细胞中，筛选、培养、扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植，即把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活，将重构胚胎进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。,1997年2月17日英国Roslin研究所的Wilmut从1只六岁母羊的乳腺上皮细胞成功的克隆到

10、了一只绵羊一多利(Dolly)。这是人类第一次采用分化的体细胞作为供体细胞，它的成功是20世纪生物学重大突破之一。学术意义在于证明分化的体细胞甚至是分化终端的体细胞核仍有全能性。,优点：转基因效率显著超过显微注射可以方便的建立生产畜群可以预测基因表达水平可以使用定点整合目标基因的技术对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转基因的效率，具有“ES细胞途径”的全部优点，且物种适用面广。,缺点：技术上难度大，成功率极低，胚胎死亡率高，非一般实验室可以开展。,直接以精子为载体的转基因方法：将成熟精子与外源共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源

11、DNA整合到染色体中。目前国际上只有1例成功模型，国内也很少有相关报道，精子载体法很少被应用。,5、精子载体法,转基因动物研究出现的问题,1、制作转基因动物效率低：如显微注射法生产转基因动物小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊，转基因阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%,0.9%。2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制：转基因随机整合于动物基因组中，有可能引起宿主细胞染色体的插入突变，可造成插入位点的基因片段的丢失及位移，也可能激活正常情况下处于关闭的基因。其结果导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流产、畸形等异常现象。3、转基因表达水平低：许多转基因的表达水平受到宿主染色体上整

12、合位点的影响，出现异位表达，影响转基因的表达能力，从而使大部分转基因表达水平较低,转基因动物的应用前景1、研究外源基因在动物整体水平的表达调控规律。2、转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。4、改变动物基因使其表现型更适合人类需要，用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。,第二节 转基因植物,转基因植物(transgenicplant)：是指利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因导入植物细胞或组织中进行表达，从而获得新性状的植物。这一技术使基因交流的范围无限扩大，可将从细菌、病毒、动物、远缘植物、人工合成的基因导入植物，所以其应用前景十分

13、广阔,一、基本方法技术路线,获取外源目的基因，克隆到表达载体,培养受体细胞，如培养悬浮细胞,将转化细胞进行适当培养,筛选阳性转化细胞,转基因植株的鉴定,电击法、基因枪法、显微注射法,培植阳性转化植株,抗虫基因,外源基因导入植物的方法,（1）农杆菌介导的基因转移自然界中存在着根癌农杆菌，含有Ti质粒，约200-250kb。当农杆菌感染双子叶植物受伤组织后，Ti质粒上的一段DNA可被整合到植物的染色体上，并随染色体一起复制。农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。将表达某蛋白质的结构基因克隆到Ti质粒的T-DNA内，再用重组质粒转化农杆菌，当农杆菌感染植物细胞后，导人的外源结构基因可能整合到这些细胞的

14、染色体上，在一定的条件下可以长成新生的植株。并将这种性状传给子代。,（2）基因枪法,利用基因枪的装置，将钨粉或金粉与外源DNA吸附制成“子弹”，通过高压放电将“子弹”加速到482m/s，金属粒子能穿透植物细胞壁，击发一次可将成千上万个带有外源DNA的金属粒子同时射入完整的细胞或器官。优点：单子叶和双子叶都可使用缺点：成本高，操作麻烦。,（3）种质系统的基因导入,使用显微注射器，选取发育适当时期的种质系统（如子房、种胚、花粉管及幼穗等），将外源DNA注入特定部位，经过筛选可获得转基因植株。,二、转基因植物在医学上的应用,植物基因工程技术生产药用蛋白：如1型糖尿病是一种自身免疫性疾病。利用植物转基

15、因技术，将谷氨酸脱羧酶等自身免疫抗原基因转入植物细胞内，表达相应抗原，通过口服食用此转基因植物诱导机体产生免疫耐受，为免疫干预1型糖尿病的发生与发展提供一条新的防治途径优点：植物是真核生物，可在自身细胞内完成蛋白的翻译后加工，使生产的药物更利于人体吸收；大幅度降低生产成本，提高产量。,转基因植物可成为新的疫苗来源，植物病毒也成为人类疫苗的可能来源。优点:植物病毒对动物不致病，利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以诱导哺乳动物免疫系统发生反应。转基因植物还可以生产单抗，有公司已用转基因大豆生产出单抗BR96，作为化疗药物的靶向载体治疗乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌，目前正处于试验阶段。,三、存在问题1

16、、食品安全问题：1）未知的可能副作用？2）外源基因在人体内表达？2、技术问题：1）成本；2）成功率；3）基因组的有效整合、稳定遗传；,第三节 基因打靶,基因打靶（gene targeting）：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。基因敲除（knock out of gene）：利用基因打靶技术，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活。基因敲入（knock in of gene）：利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中进行同源重组，在细胞内获得表达。,一、基因打靶的必备条件,1.胚胎干细胞(ES细胞)：取自小鼠受精卵

17、发育第4、5天的胚泡细胞。特点：能在体外培养，保留发育的全能性。2.打靶载体Neo 阳性筛选标志：新霉素抗性基因，neor基因插入用于打靶的外源DNA中（一个启动子缺失的正向选择基因 neo neomycin），当重组后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。（同源重组）HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。（鉴别非同源重组）,将HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，载体部分(含HSV-tk基因)是不能被整合到染色体中的。如果ES细胞在此种培养基中被杀死，说明含

18、有HSV-tk基因载体部分插入基因组。可能发生非同源重组。如果细胞能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明含有HSV-tk基因载体部分没有重组到染色体中；可能发生同源重组。,二、基因敲除的基本程序,1、构建打靶载体,2.将打靶载体导入ES细胞 选取发育第4-5天的胚胎干细胞(ES)，将打靶载体导入胚胎干细胞。同源重组并筛选打靶成功的阳性细胞基因敲除细胞。,随机整合,同源重组,3、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎。4、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。5、嵌合体的杂交育种,把胚胎注入假孕小鼠,Southern印记,把细胞注入胚泡,三、基因打靶在医学中的应用,1、采用基因打靶技术可建立基因缺陷型的的转基因动物疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分子机制。2、研究基因改变与肿瘤发生及治疗的关系3、基因打靶可用于构建高效的动物反应器或植物反应器，用于药物生产。4、改造动物基因型，鉴定新基因或其新功能，研究发育生物学；5、改造生物、培育新的生物品种。,50,The End,