含氮化合物的分析检验.ppt

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1、含氮化合物的分析检验,一、概论二、凯氏定氮法测定蛋白质含量三、蛋白质的快速测定法四、氨基酸的测定五、应用举例,一、概论,蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。,蛋白质是生命的物质基础，人体11%13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同，在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能

2、合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。,一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉20.0%，猪肉 9.5%，兔肉 21%，鸡肉 20%，牛乳 3.5%，带鱼 18.0%，大豆 40%，面粉 9.9%，菠菜 2.4%，黄瓜 1.0%，苹果 1.4%,1、蛋白质测定的意义：,氮是微生物生长繁殖必需的营养要素之一。酒类产品中的含氮化合物主要来源于原料，原料中蛋白质含量的高低不仅影响微生物的生长繁殖，还直接影响产品的质量。（1）只有通过原料中总氮的测定，才能了解原料中蛋白质的含

3、量，从而有利于对原料的选取；（2）只有通过总氮的测定，才能了解半成品或成品中总氮、可溶性氮的含量。,2、蛋白质的测定方法简介,蛋白质的测定方法分三大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量 还有一类是使用色谱和质谱，通过色谱的分离，和质谱的质量分析进行测定。食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。,3、具体测定方法,凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。由

4、Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、半微量法、自动定氮仪法及改良凯氏法。双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法红外分析仪、紫外分光光度法液相色谱和飞行时间质谱,4、蛋白质的定量测定,一般情况下，蛋白质的含氮量一般为 15%17.6%，有的上下浮动。据此，可以测出总氮 N，从而推算样品中蛋白质含量。此数值（6.25）称为蛋白质系数，用F表示。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。,二、凯氏定氮法,由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动

5、定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物。凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍 被作为标准检验方法。,三聚氰胺事件,2007.3，美国食品药品监督管理局(FDA)在中国出口的宠物食品原料小麦蛋白粉中查出三聚氰胺（C3N3H6），被怀疑是宠物中毒死亡的元凶。之后，中国政府

6、开始严打三聚氰胺、蛋白精。饲料级蛋白精是以工业氮和异丁醛为原料在酸催化剂的情况下，经缩合反应而生成的，异丁叉二氮英文名：isobutyildenediurea。（或尿素糊化淀粉，其蛋白高达100）,1、常量凯氏定氮法,原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。,常量凯氏定氮装置,操作步骤：消化：精密称取0.202.00g

7、固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20mL液体样品(相当于氮30-40mg)，小心移入已干燥的500mL定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，10g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后，于瓶口放一小漏斗，将瓶以45斜支于有小圆孔的石棉网上，小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体沸腾（微沸）。至液体呈蓝色澄清透明后，再继续加热0.5h，放冷。,14,浓硫酸的作用：脱水作用使有机物脱水并碳化为C、H、N 氧化作用将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫 酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作

8、用生成硫酸铵留在酸性溶液中。,加入硫酸钾的作用：提高溶液沸点而加快有机物的分解（3400C 4000C）K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：（NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。,加入硫酸铜的作用 催化作用：加速有机物的氧化分解 C 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 CO2 Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 2H2O SO2

9、此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。消化完全指示：蓝绿色；蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀。,加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。,仪器：要防止爆沸。,20,蒸馏：小心加入200mL水，再放冷，连接已准备好的蒸馏装置上，塞紧瓶口，冷凝管下端插入接收瓶液面下，接收瓶内盛有（20g/L）硼酸溶液50mL及2-3滴混合指示液。,21,放松节流夹，通过漏斗倒入70-80mL（400g/L）氢氧化钠溶液，并振摇定氮瓶，至内容物转为深蓝色或产生褐色沉淀，再倒入100mL水，夹紧节流夹，加热蒸馏，至氨被完全蒸出。停止加热前，先将

10、接收瓶放下少许，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后停止加热，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。,22,吸收 用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.810-10），与氨形成强碱弱酸盐，酒红色蓝绿色 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O,滴定 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定,蓝绿色灰红色(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3,适用范围：此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定仪器、试剂:500mL凯氏烧瓶、凯氏定氮装置 消化用：浓硫酸 硫酸钾 硫酸铜蒸馏用：40%氢氧化钠溶液吸收用：4%硼酸滴定用：HCl标准溶液

11、0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合指示剂,计算,式中：W蛋白质的质量分数，%；c盐酸标准溶液的浓度，mol/L；V1空白滴定消耗标准液量，mL；V2试剂滴定消耗标准液量，mL；m样品质量，g；0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol；F蛋白质系数。,2、微量凯氏定氮装置,2、微量凯氏定氮装置,微量凯氏定氮法操作步骤 样品消化 蒸馏 吸收 滴定样品消化:步骤：准确称取一定量的样品，加入硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中(固体或粉末用纸卷成纸筒送入)，轻轻摇匀，以45斜支于有小孔的石棉网上用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电

12、炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后加大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸至液体变蓝绿色透明后继续加热微沸30min关闭电炉，取下烧瓶、冷却转移至100mL容量瓶中，加水定容。,消化管先小火加热，待泡沫停止后加强火力，保持管内液体微沸，至溶液呈蓝绿色澄清透明后，再加热0.5h。冷却后加水定容（数次冲洗，使溶液全部注入容量瓶）。时做空白试验。,35,仪器,35,图8-1 消化炉,蒸馏与吸收：按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入10mL 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝

13、管下端插入液面以下。准确吸取消化液10mL于反应管内，经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏10min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min。,吸取10.0mL样品消化稀释液，由小漏斗流入反应室，并以蒸馏水洗涤小漏斗使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。,将10mL 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞，使其缓慢流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小漏斗中，以防漏气。,41,反应室沸腾开始计时蒸馏5min，移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后停止加热，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，取

14、下接收瓶,41,滴定 将接受瓶内的硼酸液用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。,注意问题：加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈；消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫；消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。,蒸馏、吸收注意问题：（1）整套装置不能漏气，要注意各蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。（2）在蒸汽发生瓶中要加

15、入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。（3）加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。（4）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏；吸收液温度不应超过40，若超过时可置于冷水浴中使用；蒸馏完毕后，应先将,冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。（5）在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管(倒吸法，在吸收瓶中加入蒸馏水，其余同测定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即移开电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中，打开夹子，即

16、可放出废水。（6）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,(4)结果计算 式中：W蛋白质的质量分数，%；c盐酸标准溶液的浓度，mol/L；V1空白滴定消耗标准液量，mL；V2试剂滴定消耗标准液量，mL；m样品质量，g；0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol；F蛋白质系数。,常量和微量的差别：装置不同，二者皆属于水蒸气蒸馏操作，只是常量把蒸汽直接导入反应室，微量把蒸汽导入反应室外加热。,47,注意事项及说明1、所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。2、蒸馏装置不能漏气。3、样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。4、消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以

17、免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。,48,5、消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。6、蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在7090时发黑。,7、样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。8、若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 ml的比例增加硫酸用量。9、样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液

18、体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。,50,10、般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品。如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。11、消化时，如不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂23ml，促使氧化。,51,12、向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀。这是由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀；有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。13、硼酸吸收液的温度不应超过40C，否则氨吸收减弱

19、，造成损失，可置于冷水浴中。14、蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源。否则可能造成吸收液倒吸。,52,4、自动凯氏定氮法,1、原理及使用范围：同前 2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化多个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。,53,54,蛋白质测定仪-滴定,55,KDN型蛋白质测定仪,56,57,现测定某一种食品的蛋白质的含量，这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分结合，经

20、振摇后大火加热进行消化；消化2h后，估计消化完全，取出消化液加入少量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对吸收液进行滴定。,讨 论,59,60,采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列记录的数据计算：水份含量=8.0%，1 号样品重量=1.015g，2号样品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl当量浓度=0.1142N，1号样品所用的HCl溶液的毫升数=22.0ml，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5ml，空白的HCl溶液的毫升数=0.2ml，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有17.5%的氮。,怎样区分是否加入含氮物?,在凯氏

21、定氮法测定样品的总含氮量之后,再取一份样品,先用三氯乙酸处理样品,让蛋白质形成沉淀。,过滤后,分别测定沉淀和滤液中的氮含量,就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的物质的氮含量。,皮革奶,皮革水解蛋白的检测难度比三聚氰胺更大，因为它本来就是一种蛋白质。目前农业部规定的检测方法，主要是检查牛奶中是否含有皮革水解蛋白，这是动物胶原蛋白中的特有成分，在乳酪蛋白中则没有，所以一旦验出，则可认为含有皮革水解蛋白。,所谓皮革水解蛋白粉，是指利用皮革生产过程中部分不能使用的皮革、毛发、毛囊等物质，甚至是动物屠宰场所收集的毛发类物质，通过化学方法加工，使之水解成为蛋白质。这种方法水解出来的蛋白质，由于加工过程

22、中带入了重金属铬，原材料本身带来的诸如二噁英、多氯联苯等毒害物质，使其不可能作为食品或者药品级的添加剂。,通过单独的重金属检测确定是否添加不合格水解蛋白。,三、蛋白质的快速的测定法,传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有害气体污染环境，影响操作人员健康。新开发的：双缩脲法、福林-酚比色法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝法、水杨酸比色法等,64,1、分光光度法测定蛋白质含量,原理：试样与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后在pH=4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的化合物。在波长400nm处测定吸光度，与

23、标准系列比较定量，结果乘以蛋白质系数，即为蛋白质含量。,分光光度法测定蛋白质含量,氨氮标准溶液（1.0g/L）：精密称取经105 干燥的硫酸铵0.4720g，用水溶解并定容至100mL,临用时用水稀释至0.1 g/L,2、双缩脲法,双缩脲的性质：当脲被小心地加热至150160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质含有两个以上的肽键（与双缩脲中肽键相似），因此有双缩脲反应。在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，用吸收光度法来测定蛋白质含量，最大吸收波长为560nm。,双缩脲反应:碱性环境,多肽及蛋白质分子结构中

24、均含有许多肽键，其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同。因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反应。其反应过程如下：,3、福林-酚法（双缩脲法的发展）,两步反应,(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质铜络合物。,(2)此络合物将试剂磷钼酸磷钨酸(olin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)。A 750,(3)灵敏度高，酚类及柠檬酸对本法有干扰。,70,4、考马斯亮蓝法,(1)考马斯亮蓝G-250与蛋白质染色，在620nm处有最大吸收值。,71,(2)简单快速、适合大量样品的测定、灵敏度与福林-酚法相似，但不受酚类、游离氨基酸和小分子影响。,72,5、杜马斯法（

25、燃烧法）,样品在高温下（700-800）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。,73,几种蛋白质测定方法比较,总氮量,蛋白氮,总氮量,蛋白氮,凯式定氮装置,分光光度计,高温装置、GC,分光光度计,浓硫酸,用量较少,不需要,福林-酚试剂,长,简单快速,3min,简单快速,74,四、氨基酸的测定,双指示剂甲醛滴定法电位滴定法茚三酮显色法氨基酸的分离及测定,氨基酸的测定,蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺

26、乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。,氨基酸的测定,随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。,氨基酸的测定,氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故称为氨基酸态氮。氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量。,氨基酸态氮的测定,双指示剂甲

27、醛滴定法,电位滴定法,双指示剂甲醛滴定法,原理 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。,方法特点及应用,此法简单易行、快速方便，在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高;酪氨酸含有羟基，滴定时会消耗碱液使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果高。特别适合浅色样品的测定,

28、试剂,40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。0.1%百里酚酞乙醇溶液 0.1%中性红50%乙醇溶液 0.1%mol/L氢氧化钠标准溶液,操作方法,预处理：移取含氨基酸约2030mg的样品溶液2份中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量）：其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点，记录V1,滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）：另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点，记录V2,计算,式中：c：氢氧

29、化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1：用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;V2：用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;m：测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014：氮的毫摩尔质量，g/mmol,注意事项,此法适用于测定食品中游离的氨基酸。固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃取，萃取可在50 水浴中进行0.5h即可。液体样品可直接进行测定。若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-COOH时的pH为8.59.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确

30、。,电位滴定法,原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。,仪器：酸度计、磁力搅拌器、碱式滴定管、刻度吸管试剂 酚酞乙醇指示液：1%甲醛：36%-38%氢氧化钠标准溶液：0.05mol/L（标定）,操作,吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数V

31、，可计算总酸含量）。加入10mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数V1。同时取80mL水，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数V2。,第一次滴定是除去其它游离酸，所消耗的NaOH溶液体积不用于计算氨基酸态氮，但可计算总酸含量）。第二步滴定才是测定氨基酸，用消耗的NaOH溶液体积进行计算。在测定过程中为什么要加入中性甲醛的作用是什么？,计算

32、,式中：W：氨基酸态氮质量浓度，%;c：氢氧化钠浓度，mol/L；V1：加入甲醛后耗NaOH的量，ml；V2：空白试验加甲醛后耗NaOH量，ml；0.014：氮的毫摩尔质量，g/mol；m：样品量，g.,说明,本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。结果要求精密度10%，即在重复条件下两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。,茚三酮显色法,原理：氨基酸在碱性溶液中与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物(除脯氨酸外均有此反应)，该化合物的颜色深浅与氨基酸的含量成正比。在570nm处测吸光度，用氨基酸标准溶液绘制标准曲线。样品溶液需澄清，通常采用活

33、性炭脱色处理。,氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法）Thin Layer Chromatography简介：近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。,（一）原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf

34、值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。,Rf=a/b,a,b,样点,溶剂前沿,点样原点,优点：展开时间短，一般在2030分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。层析后得到的斑点小而清晰。能够使用多种显色剂。点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10100倍）精确到0.01ug。也可用于大量分离500 mg，作为样品制备层析。缺点：Rf值重现性比纸上层析差。分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。,（三）操作方法：薄层板制备 样品液制备 点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记

35、作为 原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔12cm。a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。b.用一小直径3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。,展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度1030，下端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。,a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的23种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。,b.展开剂的选择方法：.微量圆环法。.用小载波片试验，

36、微量展开剂展开5cm。.图解法：样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。有机溶剂极性由小到大为：石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。,c.展开的方式：上行法、下行法、双向展开、单向多次展开、双向多次展开。双向展开：,显色：a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。（涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中）,定性：在同一块板上，同等条件下操作，被测样与标准样同时展开、显色，同

37、 Rf 值即是；查手册找相同的 Rf 值。定量：a.目视定量法：以标准斑点对照，相当于样品斑点中含量ug数。b.斑点面积定量法。c.将样点取下来，定容，离心，比色。d.利用薄层色谱扫描仪：例：日本岛津 CS-910 型双波长薄 层色谱扫描仪,介绍离心薄层色谱仪：,1.LBG 1型离心薄层色谱仪 北京产2.7924型离心薄层色谱仪 美国Harrison 公司研制3.CLC 5型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达 10g。二氨基酸自动分析仪法三气相色谱法四高效液相色谱法,氨基酸自动分析仪,10-3,食品中挥发性盐基氮的测定,挥发性盐基氮是指动物性食品由于

38、酶和细菌的作用，在腐败过程中，是蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质（如伯胺、仲胺及叔胺等）。挥发性盐基氮属于蛋白质分解产物，这些分解产物的含量与动物性食品的新鲜程度有明显的对应关系。故此指标可用于评价动物性食品的新鲜度。此类物质具有挥发性，在碱性溶液中蒸出后，用标准酸溶液滴定计算含量。,挥发性盐基氮的测定,半微量定氮法,微量扩散法,蛋白质分解后产生的碱性含氮物质，在氧化镁碱性条件下蒸馏以氨的形式释效，再用酸滴定以定量，所得结果为挥发性盐基氮。,半微量定氮法测挥发性盐基氮,将样品除去脂肪、骨及腱后，切碎搅匀，称取10g，置于锥形瓶中，加100mL水，不时振摇，浸渍30min后过滤，滤液置冰箱备用。预先将盛有10mL吸收液并加有56滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插人锥形瓶内吸收液的液面下。吸取5.0mL上述样品滤液于蒸馏器反应室内，加5mL 1氧化镁混悬液，迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸气，待蒸气充满蒸馏器内时即关闭蒸气出口管，由冷凝管出现第一滴冷凝水开始计时，蒸馏5min即停止，吸收液用0.01molL盐酸标准溶液滴定，终点至蓝紫色。同时做试剂空白试验。,微量扩散法测挥发性盐基氮,微量扩散法测挥发性盐基氮,应用举例啤酒中蛋白质的区分的测定,