分子生物学实验方法-2分子生物学.ppt

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1、6 分子生物学研究方法（下）基因功能研究技术,蛋白质是生命活动的主要执行者 蛋白质的功能主要通过与蛋白质以及其他生物分子的相互作用来实现,6.1 蛋白质相互作用技术研究,举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性

2、。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控,介导细胞的许多生物学活性。,生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应,因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。研究蛋白质相互作用的方法也就具有更为重要的意义。,免疫共沉淀,荧光共振能量转移技术,噬菌体展示技术,酵母双杂交技术,基因外抑制子,合成致死筛选,分子生物学方法,蛋白质亲和色谱法,遗传学方法,蛋白质相互作用研究方法,生物物理学方法,细菌双杂交技术,蛋白质亲和色谱protein affini

3、ty chromatography,基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose离子交换琼脂糖），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。,洗脱（2）,结合（3）,检测（6）,收集（5）,洗脱（4）,固定诱饵蛋白（1）,融合蛋白pull-down实验,为了更有效地利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase

4、,GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。,GST融合蛋白在经过固定有GSH(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用,以上两种方法都有共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能是由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可能是由第三者

5、作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。实验结果还应经其他方法验证。,以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。该法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免人为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白，另外灵敏度不如亲和色谱高。,免疫共沉淀 coimmunoprecipitation,CoIP,在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一个基团（受体）的吸收光谱有一定重叠，当这两个荧光发色基团在足够近（100埃）

6、时，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。,荧光共振能量转移技术 fluorescence resonance energy tran sfer,FRET,BFP-GFPCFP-YFP,荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辨率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。受荧光发色基团空间距离的限制,只能研究分子量小于200 kD的蛋白，而且检测的设备昂贵。,噬菌体表面展示,噬菌体表

7、面展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。,丝状噬菌体,蝌蚪形噬菌体,噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体,M13噬菌体,最关键的优势：淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。,酵母双杂交技术,基于

8、真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。,优点：简单快速，具有非常高的灵敏度，常用于发现和研究新蛋白的相互作用和功能。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性；融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能；要求互作蛋白定位于核内，不利于核外蛋白研究，会导致假阴性。,在酵母双杂交系统基础上发展起来的较为方便、快速和灵敏的检测蛋白质之间相互作用的方法。据原理可分为基于转录激活、基于转录抑制，基于酶片段互补和基于信

9、号级联反应重建的细菌双杂交系统四类。,细菌双杂交技术,细菌腺苷酸环化酶型双杂交系统（BACTH)原理示意图,百日咳杆菌B.pertussis,在大肠杆菌腺苷酸环化酶基因缺陷株中共表达,这种细菌双杂交技术有效利用了cAMP信号通路，使得融合蛋白的互作和转录机器在空间上分离，因此有效克服了酵母双杂交和其他细菌双杂交系统的一些内在缺陷，如非特异互作，不能用于转录因子和膜蛋白、分泌蛋白的研究等。筛选快捷，操作简单，成本低廉，非常适合构建快速、低耗、规模化的相互作用筛选技术平台。,缺点细菌缺乏翻译后修饰系统，真核蛋白不能得到适当地折叠和翻译后修饰，使得该系统筛选到生理作用蛋白的可能性降低。结构域的引入对

10、目标蛋白的折叠过程或构象可能产生不可预知的影响，从而导致假阳性或假阴性结果。由于该系统中设计的都是融合蛋白,因此其特性与单纯的蛋白并不一定精确对应,这样蛋白质间相互作用的结果可能与真正结果有些误差。,蛋白质芯片(protein microarray),在固体支持物表面高密度地固定化排列探针蛋白点阵,以特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。主要用于进行自动化分析,支持高通量快速筛选。能够同时高效地分析上千种蛋白质间的相互作用,也使得在全基因组水平研究蛋白质的功能(如酶活性、抗体特异性配体、受体交互作用)成为可能。但该项技术的使用受到了蛋白质固定化技术以及载体材料选择

11、的限制,同时也需要复杂昂贵的仪器来对样品进行预处理和检测。,Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的几百样品转移到NC膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的金属膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记

12、物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。,高通量筛选蛋白互作的方法：亲和纯化耦联质谱鉴定、细菌双杂交、酵母双杂交、蛋白质芯片等。,酵母单杂交系统,真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。酵母单杂交系统是研究DNA-蛋白质之间相互作用的技术。（酵母双杂交系统是研究蛋白质-蛋白质之间相互作用的技术。）将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的

13、上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。,酵母单杂交的基本原理示意图,从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的 转录因子示意图。,6.2 基因表达研究技术,基因表达系列分析技术RNA的选择性剪接技术原位杂交技术基因定点突变技术,6.2.1 基因表达系列分析技术,SAGE（serial analysis of gene expression）是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸

14、片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。LongSAGE技术。标签来自转录物3端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。,锚定酶(Anchoring Enzyme,AE)要求至少在每一种转录物上有一个酶切位点，一般4碱基限制性内切酶能达到这种要求，因为大多数mRNA要长于256碱基。NlaIII,每一种接头都含有标签酶(Tagging Enzyme,TE)酶切位点序列(标签酶是一种类限制酶，它能在距识别位点约20碱基

15、的位置切割DNA双链)。BsmFI MmeI,6.2.2 RNA的选择性剪接技术,RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可分为：平衡剪切、5选择性剪切、3选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。,果蝇Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体,选择性剪切的不同类型a.平衡剪切 b.5选择性剪切c.3选择性剪切d.外显子遗漏型剪切e.相互排斥性剪切,RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切,以cDNA两端特异引物或来自不同外显子的引物序列在不同组织

16、来源的RNA样品中进行扩增，观察PCR产物大小是否存在差异，若有，即可通过序列分析来判断这种差异是否来自于选择性剪接。,6.2.3 原位杂交技术,原位杂交（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。荧光原位杂交（FISH）首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和

17、标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。,mRNA的互补链，杂交信号集中于纤维细胞中。,负对照，mRNA的 同义链,无杂交信号。,正对照，UBQ10杂交信号遍布于整个胚珠。,原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达,6.2.4 基因定点突变技术,通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因

18、序列中进行定点突变。,寡核苷酸介导的DNA突变技术,重叠延伸介导的定点诱变,大引物诱变法,6.3 基因敲除技术,6.3.1 基本原理,经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。,基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完

19、全基因敲除）两种。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。,用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验,正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞,HSV-tk:Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase,Cre重组酶和LoxP序列:Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于 Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的

20、基因序列被删除或重组。LoxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：5-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-33-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5,延伸：Cre/LoxP,6.3.2 高等动物基因敲除技术,真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重

21、组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。,模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。,6.3.3 植物基因敲除技术,T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失

22、 活”,植物基因敲除及突变体筛选a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。b.PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。,6.4 基因芯片及数据分析,基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。,6.5 利用酵母鉴定靶基因功能,6.5.1 酵母的遗传学和分子生物学简介,酿酒酵母有稳定的单倍体和二倍体细胞。酵母细胞有三种交配型

23、：MATa,MAT,MATa/.两种不同生殖型的酵母（MATa,MAT）可以通过酵母接合的形式，形成二倍体传代。MATa/是二倍体。野生酵母是原养型的。,6.5.2 酵母基因转化与形状互补,“一步置换法”制备酵母缺失突变体的流程图,“两步置换法”制备酵母缺失突变体的流程图,6.5.3 外源基因在酵母中的功能鉴定,将棉花的-6脂肪酸脱氢酶转入酵母中,酵母的生理生化特性决定了它适合于动植物基因功能的研究。,6.6 其他分子生物学技术,凝胶滞缓实验噬菌体展示技术蛋白质磷酸化分析技术,6.6.1 凝胶滞缓实验,凝胶滞缓试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DN

24、A mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电 极移动的距离也就相应缩短了。,拟南芥转录因子与不同DNA元件有不同的结合能力。,6.6.2 噬菌体展示技术,噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫

25、作烈性噬菌体。溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。,原理 将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋 白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。,噬菌体展示技术的应用,Light Chain,15aa linker,heavy chain,TAG,PIII,amber,Phagemids can allow either soluble expression

26、 of recombinant protein in bacteria,or the production of the fusion protein encapsulated on the phage tip,non-suppressorE.Coli(HB2151),suppressorE.Coli(TG1),STOP,glutamic acid,噬菌体抗体库的筛选,6.6.3 蛋白质磷酸化分析技术,由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。,