仪器分析讲稿(第3章液相).ppt
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1、第三章 高效液相色谱分析(HPLC)3.1高效液相色谱的特点一、定义:液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。高效液相色谱是20世纪70年代急剧发展起来的一项高效、快速的分离技术。(液相色谱+气相色谱理论+高压泵、高效固定相+高灵敏检测器)。二、特点1.高压:可达150350105 Pa2.高速:例,分离20种氨基酸,经典色谱法要20多小时,用HPLC只需1小时.3.高效:3万塔板/米(GC2000塔板/米)4.高灵敏度:紫外检测器10-9 g;荧光检测器10-11g,三、应用范围,气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚
2、物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制,据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析;而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制,它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析,大约占有机物的70-80%。因此,高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,不受试样挥发性的限制。,3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 与GC 比较65/1;基本概念及理论基础与GC一致;主要区别:流动相不同.液相色谱中对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素:一、柱内展宽1.涡流扩散项:He=2dp:填充不均匀因子;dp填充粒度直径 高效液相色谱法的固定相是高
3、效填料,其颗粒直径比气相色谱法更小;且装柱多采用匀浆法装柱,填充很均匀,变得很小,所以He值比较小。,2.纵向扩散项65/-1:Hd=CdDm/u;当试样分子在色谱柱内被流动相带向前时,由于分子本身运动所引起的纵向扩散同样引致色谱峰的扩展。由于分子在液体中的扩散系数Dm比在气体中小4-5个数量级,在LC中可忽略,GC中重要。,3、传质阻力项,组分分子在固定相与流动相之间传质缓慢引起局部不平衡,从而引起峰扩展。(1)固定相传质阻力项(主要发生在液液分配色谱中)当流动相中的试样分子扩散进入到涂渍在载体表面的固定液内进行质量交换时,由于渗入固定液膜的深度不同,其返回到流动相中的时间也不同,因而引起峰
4、扩展。,采取措施:1)液-液分配色谱:薄的固定相层;吸附、排阻、离子交换色谱:小的颗粒填料。2)采用扩散系数大的液相固定相。3)减小流动相的流速,改善传质。,(2)流动相传质阻力项(二种形式:在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质)i.流动的流动相中的传质阻力项Hm 当流动相流经色谱柱内的填充物时,靠近填充物颗粒表面的流速较慢,而流路通道中心的流速则较快,移动速度不一样从而引起峰形变宽。,ii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm 由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内,微孔内的流动相称为滞留区流动相(静止状态,不流动)。当流动相中的试样分子与固定相进行质量交换时,必须先从流动相扩散进入
5、到滞留区。如果固定相中微孔既小又深,则滞留就越严重,传质就越慢,对峰扩展影响也越大。,由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为:H=A+B/u+Cu 由于B/u这一项可以忽略不计,影响柱效的主要因素是传质阻力项,高效液相色谱的方程可写成:H=A+Cu 提高柱效的方法:(1)减小固定相的颗直径,可明显提高柱效;(2)降低流动相粘度或提高柱温,可增大Dm;(3)在一定范围内减小流速,有利于于减小H;(4)提高装柱技术,提高柱内填充料的均匀性而减小A项。,1.固定相与装柱方法的选择:选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp10m,5m目前应用最广泛)首选化学键合相,匀浆法装柱2.流动相及其流速
6、的选择:选粘度小、低流速的流动相甲醇,约1ml/min 3.柱温的选择:选室温25左右,HPLC法中分离条件的选择,HPLC与GC的H-u曲线见图3-1:(1)两者曲线形状相似,都有一个H最小值;(2)HPLC的H最小值比GC的最小值小一个数量级以上,柱效更高;(3)HPLC的最佳流速u比GC的最佳流速u也小一个数量级以上。,二、柱外展宽:指色谱柱外各种因素引起的峰扩展.a.柱前展宽:主要由进样所引起;进样方式:将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或注入进样器的液流中。由于进样器的死体积以及进样时的液流扰动引起色谱峰不对称和展宽。解决:试样注入柱顶端中心点或填料中心12mm处。b.柱后展宽:主要由接管
7、、检测器流通池体积所引起.解决:连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小.,3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理类型:液-液色谱;液-固色谱;离子交换色谱;离子对色谱;离子色谱;空间排阻色谱,一.液-液分配色谱法及化合键合相色谱 1.特点:a.流动相和固定相都是液体 b.两相应互不相溶,有明显的分界面 2.分离机制:试样组分溶于流动相后,在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异,溶质在两相间进行分配。K=cs/cm=kVm/Vs 分离的顺序决定于分配系数的大小,分配系数大的组分保留值大.而且流动相的种类对分配系数有较大的影响.,3.解决固定液流失问题方法:1)采用正或反相色谱 a.正相液-液
8、色谱法:流动相的极性小于固定液的极性(流疏固亲;适用于分离极性物质)b.反相液-液色谱法:流动相的极性大于固定液的极性(流亲固疏;适用于分离非极性物质)2)采用化学键合固定相 化学键合固定相:将固定相上的各种不同有机基团通过化学反应共价键合到硅胶(担体)表面的游离羟基上,形成化学键合固定相.目前反相键合相色谱法,已成为高效液相色谱中应用最广泛的一个分支。,二.液-固色谱法(或液-固吸附色谱法)1.特点:流动相为液体,固定相为吸附剂。2.分离机制:根据物质吸附作用的不同来进行分离。吸附作用大即分配系数大的组分,吸附剂对它的吸附力强,保留值就大,出峰晚,后出来.3.作用:a.适用分离相对分子质量中
9、等油性试样。b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点:由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象.,三、离子对色谱法 1.特点:离子对色谱法对各种强极性的有机酸或有机碱的分离,分离效能高,分析速度快,操作简便.2.分离机制:将一种或多种与溶质电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物,从而控制溶质离子的保留行为。X+水相+Y水相 X+Y有机相试样离子X进入柱内以后,与对离子Y生成疏水性离子对XY,后者在疏水性固定相表面分配或吸附。,3.离子对色谱法分类正相离子对色谱法(极性固定相,非常性流动相)反相离子对色谱法(非极性固定相,极
10、性流动相v如含有对离子Y的甲醇水(或乙腈水)溶液)。,可见保留值随KXY和Y-水相的增大而增大。,4.应用:解决了以往难分离混合物的分离问题.如酸、碱和离子、非离子的混合物,特别是一些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱及药物的分离了。还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收或发荧光的基团,提高检测的灵敏度。,四.离子交换色谱法 1.分离机制70/2;离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换,依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。,3.a.分配系数D愈大,表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈强。b.亲合力高的,在柱中保留值就愈大.4.应用:a.凡在溶
11、剂中能够解离的物质。b.已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等.,五、离子色谱法 1.构成:固定相:离子交换树脂 流动相:电解质溶液 检测器:电导检测器 主配件:抑制柱(抑制流动相中强电解质背景离子的干扰)。2.流程图:fig3-2,双柱型原理:离子交换原理(以分离阴离子为例)。1)分离柱:离子交换(阴离子交换剂)ROH+Na+Br-(待测)RBr-+Na+OH-(交换)RBr-+Na+OH(洗脱剂)ROH-+Na+Br-(洗脱)2)抑制柱:消除本底电导影响(阳离子交换剂)RH+Na+OH-(流动相)RNa+H2O RH+Na+Br-(流动相)RNa+H+Br-洗脱液(NaOH)转化为低电导的水,
12、消除本底电导影响;待测离子(Br-)转化为具有更大淌度的酸(HBr),提高检测灵敏度。,a.双柱型:化学抑制型离子色谱法(高电导洗脱液:阳离子用无机酸如HCl,阴离子用NaOH);b.单柱型:非抑制型,用低电导的洗脱液(阴离子用苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐等稀溶液,阳离子用稀硝酸、乙二胺硝酸盐稀溶液,不用抑制柱);3.应用:离子色谱法是目前唯一快速、灵敏和准确的多组分分析的方法因而得到广泛重视和迅速发展。从无机和有机阴离子到金属阳离子,从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析.,六、空间排阻色谱法 1.固定相:凝胶 2.机制73/-9:类似于分子筛作用,分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积和
13、分子大小有关.排阻法是建立在分子大小的基础上的。组分中太大的分子不能进入胶孔而受到排阻,先出峰;组分中太小的分子可以进入所有胶体微孔中,最后出峰。洗脱次序将取决于相对分子质量的大小,相对分子质量大的先洗脱,相对分子质量小的后洗脱。分子的形状也对保留有重要的作用。,3.分离示意图,fig3-3 a.排斥极限A点74/2;3:b.全渗透极限B点74/2;6:相对分子质量介于上述 两个极限之间的化合物,将按相对分子质量降低的 次序被洗脱而可以分离.4.特点75/2;3:1)试样色谱峰全部在溶剂的保留时间前出峰。2)用于分离相对分子质量大的化合物(约为2000以上);3)只能分离相对分子质量差别在10
14、%以上的分子。,3.4 液相色谱法固定相 色谱柱是色谱法的心脏,固定相及装柱技术是关键.一、液-液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相1.全多孔型担体:直径小于10m,由nm级的硅胶微粒堆聚而成为5m直径的全多孔型担体。颗粒小,柱效高。2.表层多孔型担体:直径为3040m的实心核(玻璃微珠),表层上附有一层厚度约为12 m的多孔硅胶,填柱容易,重现性好,但试样容量低。目前510m直径是使用最广泛的高效填料。3.化学键合固定相(P76及P69)定义:用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面.,化学键合固定相,根据在硅胶表面的化学反应不同,键合固定相可分为:硅氧碳键型(Si-O-C)
15、;硅氧硅碳键型(Si-O-Si-C);硅碳键型(Si-C);硅氮键型(Si-N)。硅烷化反应:,化学键合固定相的特点:,(1)表面没有液坑,比一般液体固定相传质快得多;(2)无固定液流失,增加了色谱柱的稳定性和寿命;(3)可以键合不同的官能团,能灵活地改变选择性,应用于多种色谱类型及样品的分析;(4)有利于梯度洗提,也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。分离机制77/2:既不是全部吸附过程,亦不是典型的液-液分配过程,而是双重机制兼而有之,只是按键合量的多少而各有侧重.,二、液-固吸附色谱法固定相 目前较常用5-10m的硅胶微粒(全多孔型).三、离子交换色谱法固定相 1.薄膜型离子交换树脂,以
16、薄壳玻珠为担体,表面涂1%离子交换树脂.2.离子交换键合固定相:用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。a.键合薄壳型:担体,薄壳玻珠;b.键合微粒担体型:担体,微粒硅胶.四、排阻色谱法固定相 a.软质凝胶:葡萄糖凝胶;琼脂糖凝胶;(水流动相,常压)b.半硬质凝胶:交联聚苯乙烯凝胶;(有机溶剂,较高压)c.硬质凝胶:多孔硅胶;多孔玻珠;(高速),3.5 液相色谱法流动相1.重要性:GC载气仅三四种,要提高柱效选择性,主要是改变固定相的性质;LC则不同,当固定相选定时,流动相的种类,配比能显著地影响分离效果,因此流动相的选择很重要。2.选择流动相应注意的因素79/2:5点,,选择流动相的注意
17、因素:(1)流动相的纯度:一般是采用分析纯试剂,必要时需进一步纯化,以除去干扰的杂质。(2)应避免使用会引起柱效损失或保留值特性变化的溶剂。(固定相不能吸附溶剂或与流动相互溶。)(3)对试样要有适宜的溶解度,否则会在柱头易产生沉淀。(4)溶剂的粘度小些为好,否则会降低试样组分的扩散系数,造成传质速率缓慢,柱效下降。(5)应柱检测器相匹配(溶剂不能被相应的检测器检测出来),3.溶剂的选择79/-3:a.依据:溶剂的极性是重要依据。b.溶剂极性顺序,水最大,煤油最小。c.采用多元组合溶剂系统作为流动相(底液和洗脱液)(底剂决定基本的色谱分离情况;洗脱剂则调节试样组分的滞留并对几个具有选择性的分离作
18、用)d.根据不同的方法选择合适的底液和洗脱液,选用溶剂的依据:溶剂的极性。,正相色谱:底剂(弱极性)洗脱剂(极性较强)反相色谱:水(主体)有机溶剂调节剂。离子交换色谱:组分保留值通过流动相的离子强度(盐的浓度)和pH来控制。增加盐的浓度,保留值降低;阳离子交换柱流动相pH增加,保留值增加,阴离子交换柱相反。排阻色谱:所用的溶剂必须与凝胶本身非常相似,这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。,3-6 高效液相色谱仪 high performance liquid chromatograph,液相色谱仪(2),液相色谱仪(3),液相色谱仪(4),3.6 高效液相色谱仪一、概述80/1:高效液相色谱仪一般都
19、具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。二、结构示意图,fig3-4.三、部件介绍 1.高压泵(压力150 350105 Pa)要求:a.流量要稳定;80/-1b.压力平稳无脉动;81/2.c.对流速要有一定的可调范围.81/4.,动画,类型:a.往复式柱塞泵是目前广泛使用的恒流泵.机理特点81/-2;6:1)不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响,连续供给恒定体积的流动相;2)可方便地通过改变柱塞冲程的大小或往复的频率来调节流量;3)由于死体积小(约0.1mL),更换溶剂方便,很适用于梯度洗提.不足:1)输出有脉冲波动,会干扰检测器正常工作;
20、2)由于产生基线噪声而影响检测的灵敏度.,b.气动放大泵恒压泵 原理:p1SA=p2SB 其工作原理:这是一种恒压泵。特点82/-6:1)能供给无脉冲的稳定流量的输出.2)液缸体积大,更换流动相不方便;3)不便于梯度洗提.4)适合匀浆法填装色谱柱。,2.梯度洗提(梯度洗脱、梯度淋洗)装置82/a.作用:与GC 中的程序升温一样.(P22、23)b.定义83/1:所谓梯度洗提,就是载液中含有两种以上不同极性的溶剂,在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性,通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素,以提高分离效果。应用梯度洗提还可以使分离时间缩短,分辨能力增加,还可提高最小检测
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