人教版教学课件江苏省怀仁中学高二生物12基因工程的基本操作程序.ppt

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1、1.2 基因工程的基本操作程序,2023/11/11,1,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,编码区：,能转录，编码蛋白质,非编码区：,不编码蛋白质,能调控遗传信息表达,2023/11/11,2,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子,外显子,与RNA聚合酶结合位点,编码区：,非编码区：,外显子：,内含子：,能编码蛋白质的序列,不能编码蛋白质的序列,2023/11/11,3,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,启动子,原核,真

2、核,基因的结构,2023/11/11,4,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,2023/11/11,5,山西省孝义市第二中学,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,操作过程,目的基因的检测与鉴定,2023/11/11,6,2023/11/11,7,目的基因主要是指_,编码蛋白质的基因,目的基因的获取,即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。也可以是一

3、些具有调控作用的因子,2023/11/11,8,获得目的基因的方法,从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,基因的核苷酸序列等,利用PCR技术扩增目的基因人工合成,含有一种生物的全部基因,含有一种生物的部分基因,根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNA,未知序列,基因较小已知序列,已知序列,2023/11/11,9,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶

4、,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,(二)基因表达载体的构建,2023/11/11,10,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,核心,同一种,(二)基因表达载体的构建,4.过程:,2023/11/11,11,科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插

5、入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,2023/11/11,12,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2023/11/11,13,(三)将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,2023/11/11,14,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法

6、,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收DNA分子,(三)将目的基因导入受体细胞,2023/11/11,15,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原-抗体杂交,2023/11/11,16,直接分离法:,用限制酶切成许多片断,2.构建基因文库,将含有某种生物不同基因 的许多DNA片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,2023/11/11,1

7、7,直接分离法：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,分别与 载体连接,受体细胞,分别 导入,2.构建基因文库,2023/11/11,18,mRNA 反转录cDNA(互补DNA）DNA聚合酶双链DNA,反转录法：,2.构建基因文库,2023/11/11,19,cDNA合成过程,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,2023/11/11,20,基因文库

8、的构建方法,2023/11/11,21,依据：目的基因的有关信息。,如：根据,基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因的表达产物蛋白质等特性。,3如何从基因文库中得到所需要的基因？,2023/11/11,22,利用PCR技术扩增目的基因,原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。,2023/11/11,23,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,选修1 P60,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DN

9、A双链复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,利用PCR技术扩增目的基因,2023/11/11,24,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,2023/11/11,25,2023/11/11,26,利用PCR技术扩增目的基因,2023/11/11,27,山西省孝义市第二

10、中学,PCR技术扩增过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,2023/11/11,28,利用PCR技术扩增目的基因,2023/11/11,29,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA）,双链DNA(即目的基因),反转录,合成,1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质

11、的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,2023/11/11,30,2.微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.常用菌：,2023/11/11,31,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达,1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受

12、体细胞的染色体上,2.转化,2023/11/11,32,2023/11/11,33,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,2023/11/11,34,将目的基因导入受体的方法,2023/11/11,35,目的基因的检测与鉴定,检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,2023/11/11,36,寻根问底为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获

13、得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,2023/11/11,37,寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此

14、法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,2023/11/11,38,思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,2023/11/11,39,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增

15、强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,2023/11/11,40,思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,2023/11/11,

16、41,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,思考与探究：,2023/11/11,42,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四

17、环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,2023/11/11,43,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A.B.C.D.,1

18、、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个,A.540 B.8100 C.17280 D.7560,2023/11/11,44,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接4.有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,2023/11/11,45,5.哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因6.(2008,全国高考)已知某种限制酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种数是,A3 B4C.9 D12,a,b,c,d,2023/11/11,46,