人教版教学课件2.2.2动物细胞融合.ppt

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1、,专题一：,专题,2,细胞工程,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,学习目标：1、说出动物细胞融合原理、过程和方法 2、单克隆抗体的原理和应用重点和难点：1.动物细胞融合的过程 2.单克隆抗体的制备和应用,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,复习回顾：1、植物体细胞杂交的过程是怎样的？2、动物细胞和植物细胞有何不同？,无细胞壁全能性受限制,动物细胞杂交与植物细胞杂交的不同：不需去除细胞壁不能发育成新的动物个体,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,一、动物细胞融合,1、概念：,也称细胞杂交，指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,2、结果：,形成具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,

2、一、动物细胞融合,3、原理：,细胞膜的流动性,4、诱导方式,物理法：离心、振动、电激,化学法：聚乙二醇（PEG),生物法：灭活的病毒,思考：动物细胞融合原理与植物原生质体融合的基本原理是否相同？为什么灭活病毒能够作为诱导剂？不灭活的是否可以？,利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。灭活的病毒对细胞没有感染能力,并不破坏这些病原体的抗原结构。,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,一、动物细胞融合,5、过程：,动物细胞A动物细胞B,诱导，融合,杂种细胞AB,有丝分裂,（膜融合、质融合）,（核融合）,注意：

3、动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞,多核体,一、动物细胞融合,灭活病毒诱导细胞融合,融合后的细胞进行有丝分裂,杂交细胞的特点：融合形成的杂交细胞具有两个细胞的遗传信息，可表现两个亲本的遗传性状。,一、动物细胞融合,6、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。,7、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段 特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体,一、动物细胞融合,一、动物细胞融合,对比：,细胞膜的流动性、植物细胞全能性,去壁后诱导原生质体融合,物理法（离心、振动、电激）化学法（聚乙二醇

4、,杂种细胞形成杂种植株,获得杂种植株,细胞膜的流动性,使细胞分散后诱导细胞融合,除以上方法，还有生物法,杂交细胞形成细胞群,制备单克隆抗体,杂种细胞,愈伤组织,杂种植株,植物细胞A,植物细胞B,原生质体A,原生质体B,植物体细胞杂交,去壁,融合,组培,物理法,化学法,生物法：灭活的病毒,动物细胞融合,二、单克隆抗体的制备,1、抗体,(2)来源：B淋巴细胞(具有特异性。),复习：,(1)概念：抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和纯

5、度都很低，而且制备的抗体特异性差,自主阅读P52：传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？,二、单克隆抗体的制备,B淋巴细胞的特点：,B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。每一个B淋巴细胞只能产生一种特异性抗体。,二、单克隆抗体的制备,如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？,体外培养淋巴细胞能无限增殖吗?,体外培养单个淋巴细胞，提取分泌的抗体,怎样解决这个问题？,二、单克隆抗体的制备,1975，米尔斯坦和柯勒 杂交瘤技术,极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成

6、杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。,二、单克隆抗体的制备,1、单克隆抗体,（1）概念:由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。,二、单克隆抗体的制备,诱导其融合的方法有哪些？,融合后培养液中有几种细胞,怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交瘤细胞有何优点,注射抗原的目的是什么,（2）制备过程：,二、单克隆抗体的制备,为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，多次筛选,（2）制备过程：,二、单克隆抗体的制备,知识拓展,如何进行杂交

7、瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，多次筛选,大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法,

8、（2）制备过程：,二、单克隆抗体的制备,（2）过程,B淋巴细胞骨髓瘤细胞,诱导融合,B-B细胞,B-瘤细胞,瘤-瘤细胞,杂交瘤细胞（B-瘤细胞）,克隆化培养,抗体检测,能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞,体外培养,单克隆抗体,第一次筛选,用特定的选择性培养基,第二次筛选,经免疫的小鼠,二、单克隆抗体的制备,如何大量生产单克隆抗体？,利用B淋巴细胞 的功能利用骨髓瘤细胞 的特性利用 技术将两种细胞融合获得具有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用 技术大量培养杂交瘤细胞,产生抗体,无限增殖,动物细胞融合,动物细胞培养,二、单克隆抗体的制备,动物特异性免疫分离B淋巴细胞（B）；找

9、到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）细胞融合三种融合方式:（BB;BG;GG）,单抗的制备过程要点：,对小鼠注射特定的抗原蛋白,二、单克隆抗体的制备,4.第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G-BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）,单抗的制备过程要点：,二、单克隆抗体的制备,5.第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。6.选择所需要的杂

10、交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。7.提取单克隆抗体。,二、单克隆抗体的制备,单抗的制备过程要点：,3）、如何进行第2次筛选？,培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。,1）、本过程利用了哪些技术手段？,细胞融合和动物细胞培养，（免疫原理）,2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,二、单克隆抗体的制备,小结：,4）、为何要进行两次筛选？,二、单克隆抗体的制备,2.单克隆抗体的应用：,作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与特异性结合 优点：

11、准确、高效、简易、快速,在基础理论研究中具有重要意义,单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、产量大,二、单克隆抗体的制备,用于,运载药物：制成“生物导弹”,治疗疾病：主要用于癌症治疗,既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。,生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）,二、单克隆抗体的制备,植物细胞工程与动物细胞工程的主要区别,二、单克隆抗体的制备,总结,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法灭活病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势,第

12、一步：从一只小鼠体内提取T淋巴细胞，然后与骨髓瘤细胞诱导融合。第二步：再用普通培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死去。第三步：对上述经选择性培养的杂交瘤细胞直接在体外条件下做大规模培养，这样从细胞培养液中就可以提出破伤风杆菌单克隆抗体。,实验评价,1、已注入过灭活破伤风杆菌的小鼠,2、B淋巴细胞,3、选择培养基,4、必须经过专一抗体阳性检验,下面是某同学根据单克隆抗体技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。指出不足之处。,点击此处添加标题文字,思考与探究1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再

13、融合，动物细胞是两个体细胞直接融合。,点击此处添加标题文字,2.哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体以凝聚或杀死这些抗原，动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性-在体外条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性抗体,课堂练习,1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种

14、细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）A.经过免疫的B淋巴细胞 B.没经过免疫的T淋巴细胞C.经过免疫的T淋巴细胞 D.没经过免疫的淋巴细胞,A,2.动物细胞融合的目的中最重要的是-（）A.克服远缘杂交不亲和 B.制备单克隆抗体 C.培育新品种 D.生产杂种细胞3.动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确是（）诱导融合的方法完全相同 B.所用的技术手段基本相同 C.所采用的原理完全相同 D.都能形成杂种细胞,B,D,课堂练习,B,4（2004年，全国）用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是（）A将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋

15、巴细胞B用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合D筛选杂交资金积累细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体,课堂练习,5.关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是()A.可以制成诊断盒，用于疾病的诊断 B.可以与药物结合，用于病变细胞的定向治疗 C.可以利用基因工程技术生产 D.可以在生物体内生产，不能体外生产,课堂练习,D,6.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自

16、身融合细胞杂交瘤细胞A BC D,C,课堂练习,7、动物细胞融合过程中所用的诱导剂灭活的病毒，抗原性和感染力的有无是（）A.失去抗原性，具有感染力 B.具有抗原性，也具有感染力 C.失去抗原性，也失去感染力 D.具有抗原性，失去感染力,D,课堂练习,8、单克隆抗体是指（）A.单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体 B.单个B淋巴细胞增殖产生的抗体 C.单个杂交瘤细胞增殖产生的高度单一的抗体 D.单个抗体通过克隆化，产生大量抗体,C,课堂练习,9、“生物导弹”是指（）A.单克隆抗体 B.杂交瘤细胞 C.产生特定抗体的B淋巴细胞 D.在单克隆抗体上连接抗癌药物,D,课堂练习,10.下图为某同学根据杂交瘤技术

17、的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活的病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的B淋巴细胞.,11、下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。,（1）_技术是单克隆抗体技术的基础。（2）根据培养基的用途分类，图中HAT培养基属于_培养基。（3）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是_。（4）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用_。（5）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的_特点，又具备淋巴细胞的_特点。（6）淋巴细胞是由动物体_中的_细胞分化、发育而来。（7）

18、杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是_。,动物细胞培养,选择,特异性强,灵敏度高,灭活的病毒,在体外大量增殖,分泌特异性抗体,骨髓,造血干细胞,主动运输,12.下图是单克隆抗体制备过程示意图，据图回答：,（1）图中A过程是从小鼠的脾脏中取得_细胞，该细胞能够产生_。从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射_类物质。（2）B过程是一个_过程，该过程的进行需要灭活的_或_的诱导。,B,抗体,抗原,细胞融合,病毒,聚乙二醇,点击此处添加标题文字,13.现有A和B两个肉牛品种，A品种牛的细胞组成可表示为A细胞核、A细胞质，B品种牛则为B细胞核、B细胞质。（1）如果要获得一头克隆牛，使其

19、细胞由A细胞核和B细胞质组成，基本步骤是，从A品种牛体内取出体细胞，进行体外培养。然后再从培养细胞中取出_注入B品种牛的_卵母细胞，经过某处刺激和培养后，可形成胚胎，该胚胎被称为_，将该胚胎移入代孕母牛的_中，通过培育可达到目的。（2）一般来说，要想大量获得这种克隆牛比较难，原因之一是卵母细胞的数量_，为解决这一问题，可以用_激素处理B品种母牛。,细胞核,去核,重组胚胎,子宫,不足,促性腺,（3）克隆牛的产生说明_ _ 具有全能性。克隆牛的性状主要表现_ _品种牛的特征。由A、B两品种杂交得到的牛与克隆牛相比，杂交牛细胞核的遗传物质来自_个亲本，细胞质来自_性亲本，克隆牛和杂交牛的遗传物质组成

20、_（相同，不同）,动物体细胞核,A,两,雌,不同,14.回答下列有关动物细胞培养的问题：在动物细胞培养过程中。当贴壁细胞分裂生长到细胞表面 时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成的细胞层数是。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是。随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现 现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成细胞，该种细胞的黏着性，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量。现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是。,相互接触,接触抑制,单层（或一层）,胰蛋白酶,衰老甚至死亡,不

21、死性,降低,减少,由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色（或由于死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色）,检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察。在细胞培养过程中，通常在 条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中的活性降低，细胞的速率降低。给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作 进行攻击。,中,冷冻（或超低温、液氮）,酶,新陈代谢,抗原,具有一定的流动性,C,有丝,不变,抗体能与抗原发生特异性结合的特点,点击此处添加标题文字,克隆：又称“无性繁殖

22、系”。遗传组成完全相同的分子、细胞或个体及其组成的一个群体。则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。（1）个体水平：在植物的无性增殖中，植物的发芽、插条等由同一个体通过无性生殖而增长的个体群均被视为克隆。采用组织培养方法可使植物细胞培养发育成完全的个体（愈伤组织），采用这种方法得到的具有相同基因型的个体群，也被称为克隆；在动物的无性增殖中，典型的例子是采用核移植实验方法，把分化细胞的核移植到一个事先去核的蛙卵中，让其发育并得到克隆蛙。克隆动物具有均一遗传性质，2）细胞水平：由一个细胞经过有丝分裂生成的细胞群叫克隆。（3）基因水平：利用基因重组操作技术，使特定的基因与载体结合，在细菌等宿主中进行增殖，有可能得到均匀的基因群。,