DNA的粗提取与鉴定修改.ppt

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1、5.1 DNA的粗提取与鉴定,一、基础知识,（一）提取DNA的方法,1.提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2.提取DNA的基本思路,提取DNA，去除其他成分利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异,DNA的溶解性,DNA和蛋白质等成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，DNA析出。,3.DNA等大分子的理化性质,DNA不溶于酒精溶液,DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。,DNA对酶、高

2、温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶水解蛋白质，对DNA没有影响,高 温大多数蛋白质不能忍受6080 而DNA在80以上才会变性,洗涤剂溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响,（二）DNA的鉴定,沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色。,二、实验设计,（一）实验材料的选取,从下列材料中选取23种,原则：,菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌,凡是含有DNA的生物材料都可以考虑选用DNA含量相对较高的组织,要容易取得、细胞分散或容易分散、细胞容易破碎或容易研碎、细胞核中的DNA容易释放。,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动

3、物细胞,容易破碎,鸡血细胞溶液：加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液。,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA。,2、植物细胞,需要溶解细胞膜,加入一定的洗涤剂和食盐,充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,洗涤剂离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNA释放食 盐NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中。,研磨不充分，核内的DNA释放不完全，提取的DNA量少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理。,讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？,可能

4、含有核蛋白、多糖和RNA等杂质,1.DNA的溶解性,2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,（三）除去滤液中的杂质,利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开；,利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性与DNA分离。,为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,（四）DNA的析出与鉴定,与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95)，静置23min，溶液中会出现白色丝状物。粗提取DNA,1、DNA的析出,用玻璃棒沿一个方向搅拌，（以利于DNA分子的附着和缠绕）卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。,2.DNA的鉴定,向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml 其中一

5、支试管中加入DNA丝状物 各加入二苯胺试剂4ml 混匀后，置于沸水浴中加热5min 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象：溶解丝状物的溶液变为蓝色,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。,（1）材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；（2）DNA的释放和溶解，是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；（3）

6、DNA的纯化，根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；（4）对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。,共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”,2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？,提取蛋白质比提取DNA的难度大。（1）与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；（2）并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。,课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段,一、基

7、础知识,（一）DNA分子的结构,C、H、O、N、P,1、组成元素,脱氧核苷酸,2、基本单位,3、脱氧核苷酸结构,多脱氧核苷酸链结构简图,（二）DNA的复制,2、时期,有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期,3、场所,细胞核（主）、线粒体、叶绿体,4、模板,DNA母链,1、概念,由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程,5、原材料,脱氧核苷酸,6、基本条件,酶、ATP、原料、模板,7、复制过程,（半保留复制）边解旋边复制,8、遵循原则,碱基互补配对原则,9、复制的意义,使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。,（三）PCR(多聚酶链式反应）,1、DNA聚合酶特性,不能从头合成DNA

8、，只能从DNA的3端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物,2、DNA聚合酶作用过程,当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸,3、PCR原理,在80100C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。,利用PCR技术扩增目的基因,二、PCR 的实验操作,1、PCR仪,（一）设备及用具,实质上一台能够自动调控温度的仪器,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml

9、,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,一、基础知识,蛋白质提取与分离的依据:(蛋白质的物化理性质),形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。,血红蛋白的提取与分离,1.凝胶色谱法,（1）原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。（2）材料:多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。,（3）分离过程,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等,（4）

10、缓冲溶液洗脱剂组成：配制：作用：,调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。,2凝胶电泳法：,1）原理：,不同蛋白质微粒带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场（或介质）中的运动方向和运动速度不同。,思考：蛋白质为什么带有电荷？,在一定的PH下，蛋白质可电离的基团会带上电荷,2）蛋白质分子在电场作用下运动的影响因素,3）方法:a.琼脂糖凝胶电泳（如PCR产物的检测）b.聚丙酰胺凝胶电泳（测蛋白质分子量的方法）c.聚苯乙烯凝胶电泳如：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳“蛋白质SDS复合

11、物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,二、实验操作,血液组成成分,阅读思考：血液由_和_两部分组成。血细胞中_细胞数量最多，细胞中含量最高的化合物是_。血红蛋白是由 _和_构成的（4条肽链），每条肽链环绕一个能与O2和CO2结合的_基团。,1.红细胞洗涤,血液100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,目的：洗去血浆蛋白,3.分离血红蛋白,红细胞混合液,烧杯,有机溶剂血红蛋白,2.释放血红蛋白,操作目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,4.透析血红蛋白,透析的目的：,去除血红蛋白中的小分子杂质,纯化凝胶色谱法洗脱,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,图519示制作橡皮塞,3.样品的加入和洗脱,纯度鉴定：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,本课题总结,血红蛋白的提取和分离,