高通量组学技术简介.ppt

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1、高通量组学技术简介,2014-11-26,目录,代谢组学及其相关技术蛋白质组学及其相关技术糖组学及其相关技术脂质组学及其相关技术,代谢组学,代谢物组学（metabolomics）是在后基因组学时代兴起的一门跨领域学科，其主要目标是定量的研究生命体对外界刺激、病理生理变化、以及本身基因突变而产生的其体内代谢物水平的多元动态反应。代谢物组学诞生于上个世纪末，由英国伦敦帝国大学Jeremy Nicholson教授创立，之后得到迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学，植物学等与人类健康护理密切相关的领域。,常用技术手段,色谱-质谱联用技术 色谱是分离混合物的

2、有效方法,但难以得到结构信息,主要靠与标样对比来达到未知物结构的推定;质谱法提供了丰富的结构信息,用样又是几种谱学方法中用量最少的。因此色谱与质谱的结合,成为分离和鉴定复杂样品的理想手段,这是单独采用色谱、质谱所不及的,同时也不存在类似于NMR技术灵敏度低、检测动态范围窄弱点,有较高的灵敏度和专属性。,色质联用技术已在代谢组学领域得到广泛应用,特别是液质联用(LC-MS)、气质联用(GC-MS)以及毛细管电泳-质谱联用技术(CE-MS)。LC-MS的应用涉及毒理、植物代谢、遗传学、真菌的代谢等诸多领域的不同类小分子物质的定性与定量。GC-MS要求足够的蒸气压和被分析物的热稳定性好,特别对极性物

3、质的分析前要进行样品的衍生化处理。但其高效、高选择性、高灵敏度、用量少和分析速度快的优点是其得到广泛应用的主要原因。,GC与TOF/MS以及四极杆质谱的联用在代谢组学的研究中发挥了自身的优越性。CE-MS也是代谢组学中强大的分析工具。Soga等分析了细菌代谢物经三重CE分离后的近千种小分子物质,有利于代谢物的系统性分析。此外,毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC),与质谱的联用在蛋白、多肽、氨基酸和糖类的分析中得到应用。,核磁共振技术 核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用

4、下,吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。其特点为:不破坏样品的结构和性质,无辐射损伤;可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件,能够在接近生理条件下进行实验;可设计多种编辑手段,实验方法灵活多样。基于这种特点,核磁共振技术对完整器官或组织细胞内许多微量代谢组分进行检测,得到相应的生物体代谢物信息。,综合分析这些信息所反映的生物学意义,可了解生物体代谢的规律。二维和多维的核磁共振技术也成为了代谢组学研究领域的重要技术。另外,NMR技术还可以和色谱技术联用,充分发挥各自优势,达到更为理想的分析效果。相关的高性能联用技术将会用于小分子代谢物的定性与定量。,代谢组学的优势与劣势,蛋白质组学,蛋白质组

5、定义为一种基因组所表达的全部蛋白质。因蛋白质组具有时空性和可调节性,蛋白质组的概念实际指在特定时刻、特定环境和实验条件下基因组所表达的全部蛋白质。,蛋白质组学的核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析,通过对某种物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质性质(包括表达水平、结构、分布、功能、丰度变化、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质与疾病的关联性)的研究,对蛋白功能做出精细和准确的阐述。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白亚型在某种生理或病理状态中,发生的相应的变化。,蛋白质组学的研究内容主要有两方面:结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构

6、蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究,包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容,主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。,常规的方法是提取蛋白质,经分离形成一个蛋白质组的二维图谱,通过计算机图像分析得到各蛋白质的等电点、分子量、表达量等,再结合以质谱分析为主要手段的蛋白质鉴定,建立起细胞或组织或机体在所谓正常生理条件下的蛋白质图谱和数据库。,高效液相层析(HPLC)虽然HPLC在蛋白组分析中未能广泛应用,但其作为分离蛋白质的第一步,仍具有很好的前景。双向高效液相层析(2D-HPLC)也是一种很好的蛋白质分离纯化方法。其第一相根据分

7、子大小分离蛋白质,第二相是反向层析。2D-HPLC分离蛋白质的容量比2-DE大,且速度快。而毛细管柱反相高效液相色谱(RP-HPLC)也比2-DE快速、分辨率高12。目前,又出现了将不同液相层析联合使用技术,称之为连续液相层析,其大大提高了液相层析的效率,亲和层析亲和层析是利用分子生物学之间具有的专一性而设计的层析技术。一些生物分子和其配基之间有特殊的亲和力,如抗原与抗体、酶与底物、激素与受体等,他们在一定条件下能结合为复合物。如果能将复合物中的一方固定在固相载体上,就可以从溶液中专一性的提纯另一方。亲和层析特异性强、简便且高效,对含量少又不稳定的活性物质更为有效,并可得到高产率的纯化产物。但

8、是,由于并非所有的生物分子都具有特定的配基,只有那些具有配基的生物分子才能用亲和层析分离,所以亲和层析应用范围受到一定的限制,毛细管电泳毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)技术是在高电场强度作用下,对毛细管内径(510Lm)中的样品按分子质量电荷、电泳迁移率等差异进行有效分离,包括毛细管区电泳(CZE,依据不同蛋白质的电荷质量比差异进行分离)、毛细管等电聚焦(CIEF,依据蛋白质等电点不同在毛细管内形成pH梯度实现分离)和筛板-SDS毛细管电泳(依据SDS-蛋白质复合物在网状骨架中迁移速率的不同而实现分离)等技术,其优点是可实现在线自动分析,可用于相对分子质量

9、范围不适于2-DE的样品,其缺点是存在对复杂样品分离不完全的现象,糖组学,糖组学（Glycomics）又称糖体学，是生物学的一个学门，专门研究寡糖类（oligosaccharide）构造与功能。用来表示生物个体内拥有的所有碳水化合物。糖组学研究技术的关键在于糖蛋白的分离和富集。目前，糖蛋白和聚糖分离策略主要途径；一是经典的凝集素亲和色谱“糖捕获”方法，另一种是二维电泳结合特殊染色的分离技术。,植物凝集素探针植物凝集素是一类非免疫来源的，无酶活性的，能与聚糖特异性结合的蛋白质，它想探针一样可以捕获到混合物中的聚糖，为目标细胞、组织或集体的糖组学研究提供一手资料。在凝集素亲和色谱中最常用的植物凝集

10、素有刀豆素A、半乳糖凝集素、花生凝集素、橙黄网胞盘菌凝集素等。不同的植物凝集素用于分离不同类型的糖蛋白和糖肽，如ConA和GaL6特异吸附高甘露糖型和复杂型N-聚糖；在O-聚糖中GaL6专门吸附含有LacNAc的聚糖。显然，在糖捕获操作中植物凝集素的应用还是有一定的限制的。,糖基捕获的过程，利用植物凝集素亲和柱捕获糖蛋白的过程：a、植物凝集素亲和柱1捕获一组糖蛋白；b、糖蛋白被蛋白酶彻底水解；c、水解产物在经植物凝集素亲和柱1捕获到糖肽；e、肽链和糖链分别经HPLC/MS分离鉴定；f、获得肽序列和糖链分子质量；g、分析蛋白质序列并查询数据库获得相关遗传信息；h、分析聚糖的结构获得糖基化信息。使

11、用不同的植物凝集素柱进行第二和第三次循环，捕获其他类型的糖肽，可以对某个细胞核集体进行较全面的糖组学研究。,PAS法最初是作为寡糖的荧光标记发展的。后来PAS运用在糖蛋白的二维电泳中，后修饰染色和鉴别染色技术对糖蛋白与肺汤蛋白的差异染色，染色蛋白质在胶内水解用质谱测定准确的相对分子质量。该方法灵敏度较高，检测限可达到300pg，而且MS检测PA衍生糖蛋白的灵敏度远高于非衍生糖蛋白。,Steinberg等使用高碘酸将糖蛋白的聚糖氧化成醛，然后荧光染料Pro-Emerald 300共价结合到糖醛上产生高荧光共轭化合物。通过2DE分离蛋白质，2DE凝胶用SYPRORuby染料染色，所有蛋白质被染色成

12、红色，而糖蛋白与Pro-Emerald 300的共轭化合物在530nm呈绿色，将非糖蛋白和糖蛋白区别开。切下2DE凝胶上糖蛋白点，可以进行后续的鉴定。,脂质组学,脂质组学是对生物体、组织或细胞中的脂质以及与其相互作用的分子进行系统分析的一门新兴学科脂质具有多种重要的生物功能，脂质代谢异常可引发诸多人类疾病，包括糖尿病、肥胖症、癌症以及神经退行性疾病等。目前，脂质组学研究已成为一个前景广阔的热门领域，并广泛地应用到包括药物研发、分子生理学、分子病理学、功能基因组学、营养学以及环境与健康等重要领域,TLC法是最早应用于脂质分析的色谱法。它将脂类用硅胶板上行法展层,展开后的板上喷脂质显色剂。显色剂有

13、碘蒸气、Dittmer-lester钼蓝、Dragendorff试剂、Vaskovsky试剂和茚三酮等。各种脂质在TLC板上展开后,脂质的定量可采用薄层色谱扫描仪计算积分值,或将脂质的斑点刮下来,然后测定其含量(Peterson and Cummings,2006)。TLC法分为单向和双向2种。,单向TLC能够同时分析几个样品,但很难将组分完全分开;双向TLC可将脂类各组分完全分开,但是它1次只能分析1个样品。TLC法具有直观、快捷的优点,能快速分离脂质,而且价格比较便宜。脂质经过TLC初步分离后也可以用气相色谱和高效液相色谱做进一步的分析。,但是,TLC法需要的样品量大,测定的灵敏度和分辨率

14、都很低。而且,由于TLC板上的斑点在切除过程中极易发生不饱和脂类氧化,因而破坏了部分脂类结构。另外,显色反应也容易受到样品杂质的干扰。,软电离技术出现于20世纪80年代末期。这种技术的特征是可以使生物分子在无碎片断裂的情况下进行离子化。其优点一是可不需要衍生化而直接对高分子量和不挥发性的混合物进行检测;二是被分析物碎片最少,有利于对样品混合物的解析。通过软电离质谱技术进行脂质组学分析在动物和微生物中应用较早,分析方法也较为成熟。但是,该方法在植物上应用则相对滞后,主要因为植物比动物含有更多的难以分析的甘油糖脂,如MGDG、DGDG、SQDG等。,电喷雾电离质谱(ESI-MS)法电喷离子化法(ESI)是目前脂质组学分析中应用最多的软电离法。该方法是将含有分析物的洗脱液通过高电压的针尖喷射出来,带电的雾滴再被加热使溶剂蒸发,最后分析物分子形成气相的离子(Kebarle andHo,1997)。Fenn等(1989)最早将ESI技术应用于大量混合物的分析。根据分析方法不同,可将ESI-MS定量分析脂质的方法分为3类:ESI-MS直接定量法、ESI-MS/MS定量法及HPLC-ESI-MS定量法。,Thank you.,