蝴蝶兰组织培养.ppt

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1、,蝴蝶兰的组织培养与快繁技术,教学目标,工作任务,实践操作,问题探究,知识拓展,项目实践,教学内容,作 业,教学终极目标,会蝴蝶兰的组织培养和快速繁殖的技术方法和流程。,能熟练进行蝴蝶兰花梗侧芽的消毒和培养 能进行原球茎诱导、继代、生根与炼苗,促 成 目 标,项目介绍,蝴蝶兰：兰科，蝴蝶兰属；别名：蝶兰，拉丁名：Phalaenopsis amabilis蝴蝶兰是单茎性附生兰，茎短，叶大，花茎一至数枚，花大，因花形似蝶得名。其花姿优美，颜色华丽，为热带兰中的珍品，有“兰中皇后”之美誉。,蝴蝶兰属的拉丁学名是由Phala（蛾蝶）和Opsis（模样）组成，意指花外形似蛾蝶。该属植物约有4个原生种，主

2、要分布在南北纬度23度之间，从喜马拉雅山经印度、缅甸、中国南部、马来西亚、菲律宾、澳大利亚和新几内亚。我国云南南部、西藏南部、广东南部、海南和台湾一线为该属植物的最北分布界限。,蝴蝶兰属热带气生兰植物，原生种有70多种，原产于我国台湾、菲律宾、印度尼西亚等地。蝴蝶兰是单茎性气生兰，植株很少发育侧芽，花似蝴蝶，色泽丰富，形态美妙，花期长达3-4个月，深受各国人民欢迎。,蝴蝶兰,蝴蝶兰的繁殖,蝴蝶兰是单茎性气生兰，植株上极少发育侧枝，比其他种类的兰花更难于进行常规无性繁殖。组织培养是建立蝴蝶兰快速繁殖无性系的重要手段。,为了大量繁殖，实现大规模的商业化生产，采用蝴蝶兰的组织培养。取用蝴蝶兰新鲜、侧

3、芽饱满的花梗进行无菌培养，产生单株小苗。再进行试管苗茎尖培养，诱导为原球茎体。经原球茎培养，继代扩大增殖，可培养成蝴蝶兰小植株。,蝴蝶兰种子的无菌培养,材料选择和消毒,花梗消毒和接种,初代培养,继代增殖,生根培养,花梗侧芽培养,壮苗培养,诱导原球茎,花梗侧芽的消毒与培养,自来水冲洗，洗衣粉液浸泡57min，自来水反复洗 外植体的选择预处理灭菌接种 75%酒精 浸泡30s左右，0.1%升汞消毒1020min，无菌水冲洗3次 培养基:MS+BA 3-5mg/l+胰蛋白胨2g+椰乳30g+糖35g+琼脂12g/L，温度:2528；光照1012h；光强15002000lx。,培养1、选材与消毒:75%

4、酒精30S，0.1%升汞5min种子：MS+BA0.5/L+NAA0.1/L+3%蔗糖。60天。花梗：1/2MS+BA5.0/L+NAA0.5/L培养基。4周2、初代培养种子：MS+BA5.0/L 培养基上。60天，4cm高实生苗花梗：MS+BA5.0/L 培养基上。4w苞叶处丛生小芽,3、继代培养与育苗 将原球茎切成数块转移到新鲜的初代培养基上，附加15%椰乳、0.5/L+LAA6.0/L腺嘌呤。4、试管苗的移栽与管理技术 试管苗的出瓶移栽技术与大花蕙兰相同。,蝴蝶兰花梗组织培养,蝴蝶兰腋芽萌发,叶基部、叶中段、叶尖部,MS+BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+苹果汁80g/L+蔗糖3

5、0g/L+琼脂10g/L+活性炭1g/L为好。培养条件：25，600lx，pH5.45.6以基部0.51.0cm，上表面朝上平放为好,试管苗茎尖的培养,材料:试管苗茎尖0.3mm左右培养基:MS+BA 36mg/l+椰乳温度:2528光强:光照时间810h/d14d后茎尖膨大，呈浅绿色半球状，3个月后，可诱导原球茎。,原球茎培养,原球茎诱导 试管苗的嫩叶：MS+BA 46mg/l+IBA 0.51mg/l+胰蛋白胨2g/l+椰乳40g/l 2528，15002000lx，光照10h/d，逐渐出现愈伤组织状的早期原球茎。原球茎继代培养 将原球茎切割长数小块，继代培养5060d转接一次，增殖倍数为

6、1012，实现蝴蝶兰生产的工厂化育苗。,生根与炼苗,生根：MS+IAA0.5 70多天后，具45条根 的小苗，可出瓶种植。炼苗：置于室温710 d后，打开瓶盖2天，取出小苗假植于水苔上。,商业化生产,1如何选择蝴蝶兰外植体？2什么是原球茎？3什么是胚状体的发生？4什么是人工种子？,如何选择蝴蝶兰外植体？蝴蝶兰进行组织培养快速繁殖常用的外植体主要有茎尖、茎段、叶片、根尖、根段、花梗腋芽、花梗节间切段、幼胚、种子等。各个外植体培养成功的难易程度不同，诱导率不同，适于的诱导培养的途径不同。,茎尖是较容易诱导培养、成功率较高的部位,但蝴蝶兰为单茎性植物,摘取其茎尖就有可能损失母株,造成浪费。叶片作为外

7、植体既可减少对母株的伤害,且取材不受季节限制。利用花梗及花梗芽作为外植体进行培养就是代替蝴蝶兰茎尖培养的一种方法，是目前进行蝴蝶兰组培快繁最常选用的外植体。,什么是原球茎？原球茎最初是兰花种子发芽过程中的一种形态学构造。种子萌发初期不出现胚根，而是原胚的萌动和膨大，种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状，称作原球茎。以后原球茎顶端产生突起，出现鳞片状叶原基，形成子叶。也可理解为缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。,一、概念：,1、胚胎发生:胚的发育过程。,2、体细胞胚胎或胚状体，简称体胚。,在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生、发育过程形成双极性的胚状结构。,含义：

8、不同于合子胚，它不是两性细胞融合的产物；不同于孤雌胚或孤雄胚，它不是无融合生殖的产物；不同于组培中器官发生途径形成的茎芽和根；它是一个与合子胚的发育过程相似、具有双极性的胚状结构。,什么是胚状体的发生？,合子经过短期的休眠后进行不均等分裂，产生一个较大的基细胞和一个较小的顶端细胞。顶端细胞经若干次分裂后形成原胚，再依次经过球形期、心形期、鱼雷形期和成熟期最终成为成熟胚.,胚状体概念：体细胞胚或花粉胚是指在植物组织培养中起源于1个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构，通称胚体。,二、体细胞胚的发生过程：,胚性愈伤组织诱导；体胚诱导；体胚早期分化发育；体胚成熟；体胚再生。,Comp

9、arison of moncot and dicot and gymnosperm somatic embryosA.Somatic embryo of orchardgrass growing from an embryogenic callus:coleoptile and notchB.Somatic embryo of grape growing from an embryogenic callus:two flattened cotyledons and subtending hypocotylC.Somatic embryo of Norway spruce:multiple co

10、tyledons and elongated hypocotyl.,三、胚状体发生的方式：,体细胞胚胎发生的方式有直接、间接两种：从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚，中间不经过愈伤组织阶段。外植体首先发生脱分化，然后由愈伤组织细胞分化为胚。后者较为常见。间接发生方式一般要有胚胎发生丛与胚状体发育两个过程。胚胎发生丛是指细胞质浓、体积小常常聚集丛生、且高度分化的一些愈伤组织细胞。,小麦幼胚愈伤组织诱导,四、影响器官和胚状体形成的因素,1、培养基成分外源激素的种类、激动素与生长素的比例、激素的种类与浓度调控着细胞培养方式及器官发生的类型。无机物与有机物：PO4-3促进芽的分化。水解酪

11、蛋白加强激素诱导芽分化作用,水解酶蛋白能促进根的生长。氮素含量与生长素的比例、以及氮的形式与体胚的形成有关。维生素：硫胺素与肌醇。培养基的物理性质，如液体/固体、pH值、渗透压的大小、糖的浓度等等。,2、培养材料的类型及生理状态,3、愈伤组织的生理状态及遗传特征的影响,愈伤组织在增殖培养基上生长过久，致使组织衰老，往往会推迟器官的分化或不分化。处于旺盛生长时期的愈伤组织作为诱导器官分化的材料较好。经长期继代培养，在培养基中无需再加入生长物质就可维持生长，这种现象称为“自发生长”或组织的“驯化”。这些愈伤组织虽然能自发生长，但分化能力降低。,愈伤组织的分化，不同植物之间有很大的差异。,在愈伤组织

12、的长期培养中，常见细胞的染色体组发生变化，而表现出遗传上的不稳定性。,胚状体与不定芽的区别,胚状体和不定芽在组织学上的三个不同特征：最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。,胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：胚状体产生数量比不定芽多 胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株

13、。这些对 组织培养应用于育种是十分有利而重要的。,胚状体与合子胚的比较,知识拓展,大花蕙兰,大花蕙兰为蕙兰属植物，原生种产于喜马拉雅山、印度、缅甸、泰国等地，后经人工杂交选育而成。植株及花均大，特别是四倍体植株，花朵大而优美，花瓣肥厚，花色丰富多样，花期长，而且具有较强的耐寒性。它是第一个用茎尖进行试管快繁获得再生植株的兰科植物。,1、选材与消毒 在2-4月间，选取大花蕙兰假鳞茎上新生侧芽，从基部与假鳞茎相接处切断。长5-10cm，在70%的酒精中蘸一下3-4s，立即投入0.1%升汞溶液中灭菌20min，最后按无菌操作要求，剥出5mm左右的茎尖，放入0.05%升汞溶液中再次灭菌2min，将消毒

14、后的茎尖切成2mm1.5mm的组织块，接种到一准备好的培养基上。每瓶最好只接种1块外植体，减少相互感染的机会。,2、初代培养 在Fonnesbech基本培养基中加入KT1.0/L+6-BA5.0/L+NAA0.5/L和10%椰子汁，将培养物置于摇床上，转速为160rpm,进行液体振荡培养。适用温度25度，每天光照12小时，光照强度2000lx。2周左右，可观察到外植体膨大，6周左右形成绿色原球茎。,3、继代培养与育苗 在原球茎分化出茎叶之前将其取出切成数小块，转移到增殖培养基上（与初代相同）。用液体振荡培养可大大加速繁殖速度。每30-40d分割原球茎一次。将已出现叶原基或长出幼叶的原球茎转移到

15、含有10%的香蕉匀浆的Knudsone固体培养基后，3个月左右长成10-20cm的完整植株。,4、试管苗的移栽及管理技术 试管苗生长至3-5cm，根2-3条，即可移栽。炼苗3-4d，取出试管苗后用自来水冲洗掉根部的琼脂培养基，再定植。置于散光下，温度20左右，湿度90%以上，通风好。,文心兰,1.茎尖培养 从母株上切取茎尖进行表面消毒,再切割0.5-1大小的茎尖接种在MS+NAA0.2mg/L+椰子汁20g液体培养基上,黑暗静置培养20d,然后置于光下培养,待外植体转绿后,移入诱导培养 基:MS+BA6mg/L+IBA0.5mg/L+香蕉汁40g+苹果汁30g+马铃薯汁30g，固体培养。培养温

16、度25-28,光照度为1500lx,每天光照10-12h。大约30d左右,外植体开始膨大并形成原球茎。,2.原球茎增殖 将原球茎取出,分割成小块,转入诱导培养基进行增殖培养,原球茎逐渐长大,并长出新的原球茎,45d后,原球茎可增殖3倍左右。原球茎增殖的同时,部分原球茎开始分化,逐渐形成幼苗。,3.生根与炼苗 将幼苗切割开,分开转入MS+NAA0.2mg/L的培养基中,20d后小苗基部可分化出1左右的根。文心兰炼苗与蕙兰炼苗技术相同。,石斛兰,石斛（Dendrobium nobile）是兰科石斛属植物的总称，为兰科中最大的属。石斛兰不仅具有观赏价值，而且许多品种药用价值极高，是中药单方或复方中的

17、重要成份。,石斛兰 石斛兰是种类最多而栽培最广泛的兰科植物，原生种达1600余种。原产中国、日本、泰国、印度、菲律宾、澳大利亚和新西兰等国家，大多数种类为热带气生兰。,石斛兰生长快易繁殖，花的形态各异、优美、花色艳丽多彩，花多而且花期长达数月，深得世界各地人民的喜爱。许多国家利用组织培养技术大量生产石斛兰盆花及鲜切花，泰国、新加坡、马来西亚等过已成为石斛兰的生产国和出口国。,1、采芽与消毒 将新生芽或带侧芽的假鳞茎，先冲洗干净，在8%的漂白粉清夜中浸15-20min，再用无菌水冲洗干净，在超净工作台上切下顶芽和侧芽，长度2-3进行接种。2、继代培养在MS培养基中加入15%椰乳，以160r/min速度做液体振荡培养，10天左右换入新鲜培养液。温度26左右，24小时连续照明，光照强度2000lx，三个月后进行继代培养。,3、继代培养及育苗 继代培养可仍用初代培养基。以液体振荡培养为好。状苗培养基可用附加有5%香蕉匀浆的MS固体培养基，一般2个月后长成小苗出瓶移栽。4、试管苗的移栽与管理技术,芽增殖：MS+NAA0.1-0.5+6-BA0.5-2,生根：1/2MS+IBA0.1,原球茎培养过程,由母株上诱导的试管花,谢谢！,