蛋白质化学-第一部分.ppt

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1、第二章 蛋白质化学,第一部分：,第一节:氨基酸的结构与分类第二节:氨基酸的性质第三节:氨基酸混合物的分离,第二部分：,第四节:蛋白质概论第五节:蛋白质的一级结构,第三部分：,第六节:蛋白质的三维结构,第四部分：,第七节:蛋白质的理化性质与分离纯化,第一节：氨基酸的结构与分类,氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位（构件分子）。从各种生物体内发现的氨基酸已有180多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸只有20种，这20种氨基酸称为常见氨基酸或基本氨基酸。,amino acid,aa 或 AA,一、氨基酸的结构,氨基酸的结构通式,或,氨基酸是含有氨基的羧酸，不同氨基酸的R基不同，（除脯氨

2、酸外）都为L-氨基酸。,据R基团化学结构分类,脂肪族A（16种）,芳香族A(Phe、Tyr、Trp),杂环(His、Pro),二、基本氨基酸的分类,甘氨酸（Gly,G）,丙氨酸（Ala,A）,缬氨酸（Val,V）,亮氨酸（Lue,L）,异亮氨酸（Ile,I）,1.侧链只是烃链（5种）,（一）脂肪族氨基酸,2.侧链含有羟基（2种）,丝氨酸（Ser,S）,苏氨酸（Thr,T）,3.侧链含硫原子（2种）,半胱氨酸（Cys,C）,甲硫氨酸（Met,M）,4.侧链含有羧基或酰胺基（4种）,天冬氨酸（Asp,D）,谷氨酸（Glu,E）,天冬酰胺（Asn,N）,谷氨酰胺（Gln,Q）,5.侧链含有碱性基团（

3、3种）,赖氨酸（Lys,K）,精氨酸（Arg,R）,组氨酸（His,H）,（二）芳香族氨基酸,苯丙氨酸（Phe,F）,酪氨酸（Tyr,Y）,色氨酸（Trp,W）,（三）杂环氨基酸,组氨酸（His,H）,脯氨酸（Pro,P）,非极性氨基酸,极性中性氨基酸,带正电荷的氨基酸,带负电荷的氨基酸,三、不常见蛋白质氨基酸及非蛋白质氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是在蛋白质合成后由相应的基本氨基酸衍生而来的。,非蛋白质氨基酸：存在于生物体内，但不组成蛋白质，呈游 离或结合态的氨基酸，约150种，具有多 种生理功能。（1）L-氨基酸的衍生物：L-瓜氨酸

4、和L-鸟氨酸是合成精氨 酸的中间产物。（2）D-氨基酸：D-Ala存在于肽聚糖中，D-Phe是短杆菌肽 S的组分。（3）、-氨基酸：-Ala是泛酸的前体，-氨基丁酸 是传递神经冲动的化学介质。,第二节：氨基酸的性质,一、氨基酸的构型、旋光性和光吸收,1、构型：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原 子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。,以丙氨酸为例：,如含两个手性碳原子，则有种立体异构体，分别称为-,-，别-和别-氨基酸。,L-苏氨酸(L-threonine),D-苏氨酸(D-threonine),L-别-苏氨酸(L-allo-th

5、reonine),D-别-苏氨酸(D-allo-threonine),自然界中组成蛋白质的氨基酸都是L-型，但Gly除外。,2、旋光性：,组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“”号表示。是AA的物理常数，与结构、PH值有关。,消旋,外消旋,内消旋,3、光吸收：,组成蛋白质的氨基酸中，Trp（组氨酸）、Tyr（酪氨酸）和 Phe（苯丙氨酸）对紫外光有一定的吸收；原因：它们分子中含有苯环，而苯环上有共轭双键；这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近。,pH=pI,pHpI,pHpI,

6、带电荷为零,带电荷为正,带电荷为负,完全质子化,完全去质子化,兼性离子,二、氨基酸的两性解离及等电点,(pK1),(pK2),氨基酸是两性电解质；解离程度取决于所处溶液的酸碱度。不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在！,等电点(Isoelectric Point,pI)：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，在电场中既不向阳极也不向阴极移动。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。氨基酸等电点的特点：1.净电荷数等于零，在电场中不移动；2.此时氨基酸的溶解度最小。,氨基酸等电点的确定：,根据pK值计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。p

7、K值:该基团发生二分之一解离时的pH。,氨基酸的酸碱滴定,pI,PK2=4.25,PK3=9.67,PK1=2.19,PK2,PK3,PK1,pI,PK1=1.82,PK2=6.0,PK3=9.17,PK2,PK1,PK3,酸性氨基酸，以Asp为例：,碱性氨基酸，以Lys为例：,1、与HNO2的反应,三、氨基酸的化学反应,2、与茚三酮的反应：脯氨酸产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（0.5-50g/ml）。,3、与甲醛反应：氨基酸的甲醛滴定法,OH,中和滴定,反应特点 A.为-NH2的反应。B.在常温，中性条件，甲醛与-NH2很快反应，生 成羟甲基衍

8、生物，释放氢离子。,应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示 剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1:1）D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,4、与2,4-二硝基氟苯（DNFB）的颜色反应,反应特点（1）为-NH2的反应（2）在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸 应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸，由Sanger首先应用，确定了胰岛素的一级结构。,5、与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应,由Edman于1950年首先提出为-NH2的反应用于N末端分析，

9、又称Edman降解法,胱氨酸,二硫键,-HH,6、半胱氨酸的氧化与还原反应,第三节 氨基酸混合物的分离,一、层析技术 纸层析、薄层层析、离子交换层析、高效液相层析二、电泳技术 纸电泳、凝胶电泳.,一、层析技术,1、概念：层析技术又称色谱技术（Chromatography），是一种根据被分离物质的物理、化学及生物学 特性的差异，使它们在某种基质中移动速度不 同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。,2.层析技

10、术的分类：,根据固定相基质的形式分类：纸层析、薄层层析和柱层析。根据流动相的形式分类：液相层析和气相层析。根据分离的原理不同分类：吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。,吸附层析:以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。分配层析:根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。凝胶过滤层析:以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。,离子交换层析:以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。亲和层析:根据生物大分子和配体之间的特

11、异性亲和力（如酶和底物、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。,原理：组成层析系统的固定相和流动相具有相反的极性。被分析的样品（如aa混合物）中的各组分依据其自身极性 的强弱，与此两相的亲和力不同。与固定相亲和力大者，易留滞于原地，与流动相亲和力大 者，易随流动相移动，因而达到分离的目的。,3.分配层析：,（1）纸层析,单向纸层析,迁移率：Rf,双向纸层析图,（2）薄层层析,4离子交换层析,原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上

12、的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。,离子交换原理及流程示意图,树脂是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯 组成的具有网状结构的高分子聚合物。,洗脱顺序主要与各种离子所带电荷有关，在电荷 相同时，与极性、非极性有关。,基本步骤：装柱 上样 分步洗脱 分步收集,强酸型阳离子交换树脂,pH23，使所有氨基酸带正电荷，正电荷大小顺序：碱性AA中性AA酸性AA,逐步提高洗脱液pH和离子强度,二、电泳(Elctrophoresis),1、氨基酸在pH高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过氨基酸在电场中泳动而达到分离各种氨基酸的技术,称为电泳。2、分离氨基酸混合物常用纸电泳。,Thanks,