艾滋病检测技术与应用.ppt

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1、艾滋病检测技术与应用,北京出入境检验检疫局艾滋病确认中心实验室,HIV检测的病毒学基础,人免疫缺陷病毒Human Immunodeficiency Virus HIV,HIV感染的细胞过程的动画演示,HIV的主要结构基因和相应的抗原,HIV-1具有高度变异性,逆转录酶的忠实性较差，缺乏35外切核酸的校读功能，RNA转录为DNA时经常出现错误HIV变异的频率是真核细胞DNA基因组的100万倍。真核细胞DNA多聚酶的错误率大约是10-10-10-9，而HIV-1逆转录酶平均每一个位点的错误率是10-4-10-3估计每一轮HIV-1的复制都会引入10个错误的碱基,HIV的快速复制速率加上高突变率HI

2、V从原发感染时的状态进化为一群遗传差异很大的病毒，每一个成员都保存了生存所必需的基因，但是在不妨碍复制的基因位点上有细小的差异高度分化的病毒群体。每一个复制周期都产生基因序列彼此不同的HIV毒株的混合物，通常称为准种quasispecies）,HIV-1具有高度变异性,估计HIV-1平均每一代的时间大约为2.5天。这意味着病毒复制的速率是每年140代或更多，从HIV感染到诊断AIDS，病毒已经更新了上千代。,HIV 的型和亚型,HIV,HIV-1,HIV-2,O,M,A,B,C,D,E,F,G,H,I,JCRF01-16,Types,Clades,ANT 70,MVP5180,VAU,ROD

3、NIH2,Groups,Guidelines for ClassificationTypes:HIV-1 and HIV-2 50%homology Subtypes/Groups:HIV-1 group M,N and O 60-70%homology Clades:HIV-1 Clades A-J 70%homology,N,名称 参考毒株 重组的亚型CRF01_AE CM240 A、E CRF02_AG IbNG A、G CRF03_AB Kall53 A、B CRF04_cpx 94CY032 A、G、H、K、U CRF05_DF VI1310 D、F CRF06_cpx BFP90

4、A、G、J、K CRF07_BC CN54 B、C CRF08_BC GX-6F B、C CRF09_cpx 96GH2911 尚未发表 CRF10_CD TZBF061 C、D CRF11_cpx GR17 A、G、J、CRF01_AE CRF12_BF ARMA159 B、F CRF13_cpx 96CM1849 A,CRF01_AE,G,J,UCRF14_BG X397 B、G CRF15_01B 99TH.MU2079 CRF01_AE,B CRF16_A2D KISII5009 A2、D 循环重组毒株（Circulate Recombinant Forms,CRF）,全国第二次HIV

5、分子流调不同传播途径HIV-1亚型的分布,HIV检测方法的进展和应用,多种HIV检测方法,检测的目标:HIV抗体、HIV1P24抗原,HIV RNA,HIV基因组 检测的标本:血清/血浆，唾液、尿液 检测的模式：ELISA、WB、IFA、快速法、核酸扩增等 检测的用途：病原学诊断、监测病程和疗效、监测病毒变异,检测HIV抗体,是常规使用的诊断方法方法学:ELISA试剂,快速试剂(金标记,锡标记),家庭用试剂.检测的标本:血清和血浆,唾液,尿液,检测HIV抗体(ELISA法),原理:间接法(第1代,第2代试剂),双抗原夹心法(第3代试剂).判断结果有客观依据(临界值).可自动化操作.可检测多种标

6、本(血清,血浆,唾液,尿液)是使用最广泛的方法,HIV ELISA试剂的发展,重组抗原或合成多肽HIV-1/2/o,HIV ELISA试剂的原理,双抗原夹心法的优点 可以检测HIV不同的抗体亚类，包括IgG、IgA、IgM、IgE等。不需过度稀释标本来保证特异性，使敏感性提高。特异性由双重特异性HIV抗原来保证。,同时检测P24抗原和HIV抗体,第4代试剂包被和标记的分别是P24抗原的单克隆抗体,HIV-1gp160,HIV-1 O gp41,HIV-2 gp36.分别用以检出P24抗原,HIV-1 M群,O群和HIV-2的抗体.检出时间提前大约7天,检测HIV抗原(P24),方法学:ELIS

7、A抗体夹心法比抗体检出时间提前大约1周,进一步缩短窗口期用途:婴儿或窗口期HIV感染的诊断 献血员筛选 监测疗效和病程进展,HIV 感染的窗口期,第一代 HIV Ab:6-8 星期,第二代 HIV Ab:4-5 星期,第三代 HIV Ab:3 星期,第四代 HIV Ab/Ag:2 星期,不同检测方法缩短窗口期的效果,检测HIV抗体(快速法),原理:间接法和双抗原夹心法标记物:胶体金或胶体硒优点:出结果快,操作简便,不需要复杂的实验室设备适用于需要尽快得到结果的情况,如门诊,急诊,追踪意外暴露的传染源等等,HIV抗体确认,目的是排除初筛的假阳性有多种方法,如免疫印迹法(WB),免疫荧光法(IFA

8、)和放射免疫沉淀法检测的是不同HIV抗原的抗体结论:HIV抗体阳性(Positive),HIV抗体阴性(Negative),HIV抗体可疑(Indeterminate),先初筛,后确认,初筛:发现所有的阳性者,不漏检.初筛试剂的敏感性必须好.确认:剔除假阳性,确定真正的阳性者.确认试剂必须具有高度的特异性.,HIV抗体确认的标准,阳性:二条env带或一条env带加一条p24带阴性:无任何条带不确定:有一个或几个条带但又不满足阳性标准,HIV抗体不确定(Indeterminate),原因:HIV感染早期 非特异反应,与其他病原体的交叉反应在正常人群中的发生率较高,10-15%处理方法:随访3-6

9、个月 和 检测HIV的其他指标,如P24,HIV RNA等,抗体检测的特殊问题,窗口期:HIV感染后,尚未产生抗体.HIV(+),HIV抗体(-)HIV阳性母亲的婴儿:从母体被动获得HIV抗体,有可能HIV(-),HIV抗体(+)用针对病毒本身的检测方法:P24抗原,HIV RNA,HIV DNA等随访,出生以后有从母体被动获得的HIV抗体，诊断新生儿的HIV感染不能依赖抗体检测 大约出生12个月以后，来自母亲的抗体消失，以新生儿自身免疫系统为基础的抗体才开始产生 新生儿只有在18个月以后才能用抗体检测方法进行诊断 采用病毒学检测方法对婴儿HIV感染做出早期诊断,HIV DNA PCR实验是婴

10、儿HIV感染诊断首选的方法38感染的孩子在出生后48小时HIV DNA PCR就可呈现阳性在出生后第二周，检测的敏感性大幅度上升，14天时阳性率达到93。28天时阳性率是96，并且具有很高的特异性（大约99）,HIV-1 病毒载量(Viral Load)HIV-1病毒载量指体内复制的病毒的数量一般以血浆HIV RNA的拷贝数表示,抗病毒治疗目的,反应水平,月,感染时间（年）,CD4+T细胞数,血浆病毒载量,急性HIV感染的症状,检测限,病毒载量测定的意义,预测疾病的进程:高病毒载量预示病程快速发展监测疗效:何时开始治疗以及治疗的效果，有效的抗病毒治疗应该能够显著降低病毒载量 HIV急性感染的辅

11、助诊断,有效的抗病毒治疗 28周病毒载量下降1个log以上 1624周病毒载量降到最低检测限以下，否则应考虑改变治疗方案,常用的病毒载量测定方法,分枝DNA信号放大系统 HIV-1 Quantiplex(bDNA)逆转录PCR系统 Amplicor HIV-1 Monitor（RT-PCR）核酸序列扩增系统 NucliSens HIV-1QT（NASBA）,三种病毒载量测定方法的比较,方法 QuantiplexHIV-1RNA AmplicorHIV-1Monitor NucliSens HIV-1 QT 原 理 bDNA RT-PCR NASBA检测范围 50-500000cp/ml 400

12、-750000cp/ml 50-3000000cp/ml 50-75000cp/ml（超敏）检测亚型 A-G A-G A-G标本量 1ml 0.2ml 10l-2ml 0.5ml（超敏）优 点 FDA批准，不需要RNA FDA批准，应用广泛 FDA批准可以 提取和纯化，需时间 检测组织和体液 短、出结果快 中的病毒载量，最大的检测范围,HIV病毒载量有生物学意义的变异,商品化试剂盒的重复性是大约0.2-0.5个log（1.7-3倍），在检测不同的动态区域有所不同。临床稳定的病人每天病毒载量的自然变化是大约个log（2-2.5倍）。病毒载量的变化超过0.5个log10RNAcp/ml（大约是3倍

13、）就超出了实验和每天的正常变化，应被视为有确定的生物学意义。,接近检测下限的变化需特别注意,方法的误差大 如病毒载量由150 cp/ml下降到LDL，是抗病毒治疗的效果，还是方法的变异？需慎重下结论,测定病毒载量须注意不要在感染和预防接种4周内检测始终在同一个实验室使用相同的方法有生物学意义的变化应超过3倍（0.5log）,HIV病毒载量测定的临床指征Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1 Infected Adults and Adolescent,急性HIV感染,辅助诊断（抗体阴性或不确定）,确诊HIV感染时,决定是

14、否开始治疗,未治疗的病人每34个月,监测病程进展，决定是否治疗,启动治疗后28周,评价治疗效果,启动治疗后34个月,是否取得最大的病毒抑制,治疗过程中每34个月,监测疗效，确定是否需要改变治疗方案,临床改变或CD4细胞数显著下降,决定继续或改变治疗方案,HIV病毒载量测定的临床指征Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1 Infected Adults and Adolescent,HIV耐药性毒株检测方法及其应用,HIV的耐药性由于HIV的基因发生突变，导致病毒对药物的敏感性下降是抗病毒治疗失败的主要原因,HIV耐药性是

15、怎样产生的？耐药株是在病毒自发的、高频率的基因突变中产 生的，在药物选择性的压力下优势复制的结果,内因：HIV基因组的高突变率（每个复制周期产生一个突变点）病毒的高复制速率（每天109 1010 个新病毒）每个新的HIV RNA拷贝至少包含一个突变 外因：药物选择压力（耐药毒株完全取代药物敏感株只需14 至28天）,怎样检测HIV的耐药性？基因型耐药性检测：检测HIV基因组中与耐药性相关的基因突变 表型耐药性检测：检测病毒在药物存在的情况下复制和生长的能力，是药敏试验,基因型耐药性检测,针对特定基因突变,针对病毒基因序列,杂交法：LiPA等,测序法：TruGene 等,基因型耐药性检测优点：简

16、便快速、经济缺点：间接定性测定耐药性 解释结果往往困难 没有临床临界值（Cut-off）不能立刻检测对新药的耐药性条件：病毒载量500-1000cp/ml 突变株占病毒准种的20以上,耐药性突变的表示方法野毒株的氨基酸氨基酸的位置突变后的氨基酸K103N一级突变（Primary Mutation）：自身就可导致病毒对药物的敏感性降低二级突变（Secondary Mutation）：与一级突变结合导致病毒对药物的敏感性降低或提高了一级突变毒株的复制适应性,主要耐药性突变举例,I54/V/T/L/M 对蛋白酶抑制剂的高度耐药性M46I/L 对蛋白酶抑制剂的高度耐药性M184V/I 对Lamivud

17、ine的高度耐药性Q151M 对NRTI的中度耐药性K103N/R 对NNRTI的高度耐药性V106V/M 对NNRTI的高度耐药性G190A 对NVP的高度耐药性,表型耐药性检测优点：直接定量测定耐药性 结果容易解释 有临床临界值（Cut-off）可立即检测对新药的耐药性缺点：操作复杂、价格昂贵、耗时长,ELISA检测的质量管理,试剂盒选择,检定合格、贴有防伪标签、批批检合格。进行全面的质量评价。灵敏度：1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力。特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力（无假阳性），取决于包被抗原（体）及标记抗原（体）的纯度及特异性

18、。精密度：ELISA试剂一般指其批内CV，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围,试剂盒选择,稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间，一般采用破坏性试验即将试剂存放于37保存，定期测定其灵敏度，特异性和精密度等指标，直到其质量指标开始下降为止，通常认为37每稳定一天相当于410保存一个半月。简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性试验中结果判断简单明了，）定量试验结果计算也应简单。安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本而市场价格比较合理。,试剂盒选择,对试剂的质量进行考察包被物的组成，如原

19、料来源（基因工程或合成多肽），片段的组合（按比例混合或化学合成），片段的长短等；室间质评评价报告中对试剂的评价结果根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。,仪器质控,移液器：利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在10%以内；水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有1的误差；洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；酶标仪 经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。,标本的采集和保存,体液（如血清，血

20、浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）一般使用血清。尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，可造成假阳性；长菌的标本同样的道理易产生假阳性。抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4冰箱5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。,检测过程中的质控,ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏，强特异的优点。因此,应建立实验项目的标准

21、操作程序(SOP)。,加样,用微量移液器按规定的量加入微孔板的下1/3处，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。每次加样应更换吸头，干吸头预先在血清中抽吸三次。样本稀释，先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂。,温育,ELISA边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种是放在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处，不可将板条叠加放置。,洗涤,ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质

22、的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。手工洗涤一般采用浸泡方法：1）甩去孔内反应液；2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动；4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。重复以上操作至少5次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道，避免堵孔。,显色,HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37C，10-1

23、5分钟）恒定反应后终止或根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间.,用酶标仪判读结果,显色反应终止后应立刻比色（30分钟内）。常见的显色系统有OPD和TMB二种，TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。OPD终止后显棕色，测定波长为490nm；TMB终止后显黄色，测定波长为450nm，二种底物的校正波长均用630nm。使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。,钩状效应（HD-HOOK）,在夹心ELISA中，其剂量反应曲线的高剂量（HIGH DOSE，HD）区段，线性走向不是呈

24、平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（1974）根据此现象写实性地称之为“HD-HOOK”效应。产生该现象的分子机理有“分子变构说”和“浓度效应”等推论。一步法和二步法均存在，只是前者出现的更早些，大多数是高值低吸光度，很少阴性结果。,钩状效应（HD-HOOK）,实验室管理“国家实验室认可和计量认证”要求生物安全“生物安全实验室的通用要求”艾滋病检测“全国艾滋病检测技术规范”要求,艾滋病检测实验室的管理,主要内容,样品采集和处理 HIV抗体检测 HIV核酸定性检测 HIV RNA定量检测 CD4/CD8T淋巴细胞检测 HIV抗原检测艾滋病实验室安全防护和

25、职业暴露预防艾滋病实验室质量管理艾滋病实验室质量考评办法 HIV诊断试剂临床质量评估办法,HIV检测样品采集 HIV抗体检测:血清、血浆、唾液或尿液 HIV病毒载量测定：血浆，EDTA抗凝 CD4/CD8细胞检测：抗凝全血,HIV检测样品保存和运送用于抗体检测的血清或血浆样品应存放于-20以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2-8。用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20以下，进行病毒 RNA检测的样品如长期（3个月以上）保存应置于-80。样品运送：注意生物安全,HIV抗体检测结果报告,筛查（-）：出具“HIV抗体阴性”报告 筛查（+）：出具“HIV抗体待复查”报告 不能出阳性

26、报告 确认（-）：出具“HIV抗体阴性”报告”确认（+）：出具“HIV抗体阳性”报告 确认结果不确定：出具不确定报告，随访,检测质量考核试剂质量保证检测试剂考评国家级评估，省级评估实验室质量保证实验室考核确认实验室考核，筛查实验室考核盲样检测，问卷调查，现场抽查人员培训与考核：国家级培训，省级培训,艾滋病检测实验室的规范化要求：实验室内部管理:取得实验室资格：制定实验室制度：环境设施的维持：样品管理：使用有效试剂/仪器设备：资料数据管理：保密工作：,全国艾滋病确认实验室(截止2004年12月),Urumchi,Lhasa,Huhehaote,Haerbin,Changchun,baoding,Beijing,Tianjin,Taiyuan,Chengdu,Chongqing,Xining,Jinan,Haikou,Guangzhou,Kunming,Nanning,Fuzhou,Guiyang,Shanghai,Hangzhou,Zhengzhou,Wuhan,Changsha,Nanchang,Hefei,图例 防疫站 35 检疫局 11 医院 3 医科院 2 军科院 1 参比室 1,Tianjin,Lanzhou,Yinchuan,Xian,Lanzhou,Nanjing,Shenyang,祝工作取得更大成绩谢谢！,谢 谢！,