核酸生物化学.ppt

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1、核 酸 的 生 物 合 成,主要内容,DNA的生物合成RNA的生物合成,遗传学的中心法则,DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。,反中心法则,在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。,信息分子的复制与表达,DNA,mRNA,蛋白质,反转录,复制,复制,翻译,转录,概念:,复制(r

2、eplication)：指以亲代DNA分子为模板合成出子代DNA分子的过程。转录(transcription)：以DNA分子为模板合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程。,反转录(reverse transcription)：,以RNA为模板将遗传信息传给DNA的过程。,艾滋病“现代瘟疫”,艾滋病的英文缩写AIDS的全称为获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficiency syndrome）。引起艾滋病的元凶是一种人类免疫缺陷病毒(human immune-deficiency virus,HIV),HIV的结构,HIV基因组（RNA）进入人体后,专门识别T淋巴细胞(

3、主要免疫细胞,具有抗感染作用)，在逆转录酶的作用下，以HIV的RNA为模板，产生了与RNA互补的DNA链。再合成DNA互补链,与人染色体基因整合,形成前病毒DNA.(潜伏期)(被激活时)前病毒DNA转录生成新的RNA片段，同时合成衣壳蛋白等，在宿主细胞中，新合成的RNA、逆转录酶及蛋白质等又装配生成更多的病毒颗粒，它们以出芽的方式从宿主细胞中释放出来，又去攻击其他的T淋巴细胞。,被HIV感染的T淋巴细胞,一、DNA的生物合成,（一）DNA的半保留复制1、半保留复制假说的提出：1953年，Watson&Crick在DNA双螺旋基础上提出。,DNA复制的假设：,有3种可能：1）全保留式；2）半保留

4、式；3）混合式。,2、实验证明：,方法：将E.Coli培养在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长；提取其DNA；进行氯化铯密度梯度离心。再移至14N培养基中生长、提取DNA、离心分析。,结果：,证实了DNA复制时，亲代分子分为二个亚单位（两条链），分别构成子代分子的一半，且经过多代仍保持完整性。,3、意义：,1）半保留复制保证了遗传的稳定性；2）DNA是处于不断变异和发展之中。,复制,（二）DNA复制的起点和方向,实验：用3H标记的dT 得到含3H的DNA；放射自显影。推测：若放射性在两端双向；若在一端单向；,实验证明：,细菌染色体DNA是双向复制，大多是一个起点。,1、复制起点：,原核生

5、物：1个起点;真核生物：多起点；2、方向：多为双向,3、复制叉：细菌为环状DNA复制起始于单个位点，双向，半保留，每 个复制泡（眼）包 括2个复制叉(DNA 的两条链在起始点分开形成)。方向：53,复制叉,大肠杆菌E.Coli 大肠杆菌的复制原点叫做oriCoriC起点：,有固定起点；特殊蛋白识别起点；起点为100-200bp的区域;以复制叉形式完成复制。,（三）原核细胞DNA的复制（DNA指导的DNA合成）,1、大肠杆菌的DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)：催化形成新的磷酸二酯键；有外切酶活性。,1)E.COLi DNA聚合酶,需要原料：4种dNTP；DNA模板；与模板

6、互补的一段RNA引物；Mg2+；Zn 2+（酶活性部位）；,DNA聚合酶功能：,催化dNTP加到DNA链的3-OH末端（方向5 3）。5 3外切酶活性，可切除引物；3 5外切酶活性，可纠错；,2)DNA聚合酶:,反应需Mg2+、NH4+；反应同酶1,聚合活力很低；具3 5外切酶活性；3)DNA聚合酶：主要负责DNA链延伸；具3 5外切酶活性；具5 3外切酶活性,DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 亚基数目 1（单体酶）1（多亚基酶）1（多亚基酶）5 3聚合活性+中+很低+很高3 5外切活性+（保护DNA复制的忠实性fidelity）5 3外切活性+-+,主要是对DNA损伤的修复；以及在D

7、NA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,修复紫外光引起的DNA损伤,DNA 复制的主要聚合酶，还具有3-5 外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,E.COLi的DNA聚合酶,功 能 53聚合作用+53外切酶作用+35外切酶作用+聚合核苷酸数/min 600 30 9000分子数/细胞 400 100 10*DNApol主要负责DNA链延伸。,2、双链DNA复制的分子机制（DNA半不连续复制）：,1）冈崎片段和半不连续复制问题的提出：已知DNA两条链反向且都能作为模板；已知DNApol聚合方向53；冈崎等提出DNA的不连续复制模型，认为：3 5走向的DNA是由许多53方向合成的DNA片

8、段连接而成的。,实验：,放射自显影；电子显微镜 观察。冈崎片段：以 5 3 走向DNA为模板合成的小片段。约1000-2000bp。,结论：,DNA是半不连续合成的。前导链（leading strand):以35 链为模板，新生链以53方向连续合成；后随链(lagging strand):冈崎片段:以3 5链为模板链，DNApol以53方向合成小片段DNA即 由冈崎片段连接成的DNA链为后随链。,2）RNA引物,问题提出：已知DNApol只能在3-OH上延伸，什么提供了3-OH？实验证明：DNA合成实验需NTP；新合成的DNA链中有RNA；RNA酶水解证明。,RNA引物酶（RNA primas

9、e),为多聚体；功能：催化引物合成：在DNA一定部位合成并与其互补，合成方向53。,RNA引物（RNA primer),引物酶合成的引物为十几个核苷酸。冈崎片段引物的合成不需要特异的起始部位。,过程：,A、引物酶沿复制叉反方向合成后随链引物。B、DNApol 在引物上延伸（前导链和后随链）。C、完成DNA合成后，DNApol 用其53外切酶活性除去引物。D、DNA连接酶将两个冈崎片段连接起来。,DNApol,DNApol,3）DNA连接酶（ligase）：,作用：催化相邻的二个DNA片段间的连接，条件：两片段相邻；两片段需与同一互补链结合;反应耗能。,后随链生成包括：,起始：RNA引物的合成；

10、延长：从引物3端添加dNTP，合成DNA，终止：切除RNA引物，连接各片段。,4）母本DNA双链的分离,与此相关的酶：,DNA解链酶(DNAhelicase)：使复制叉前方DNA双螺旋解开一小段。每解1个bp需耗2个ATP。单链结合蛋白（Single Strand Bindingprotein,SSB）：几分子的SSB与已分开的DNA链紧密结合，以防两链重新结合。此时，复制酶系统结合在模板链上，进行半不连续复制。,DNA旋转酶（拓扑异构酶,topoisomerase)：,兼内切酶和连接酶活力。DNA拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。有ATP时，可使DNA成超螺旋；反之

11、，呈松弛态；,5）DNA聚合酶的校对作用：,依赖于3个聚合酶的3末端外切酶活性，进行校对和纠错。多种蛋白质参与，从而保证了复制的准确性。,总结：原核细胞DNA的复制,1、合成所需材料：模板DNA原料；合成引物所需NTP；合成DNA所需的dNTP酶和pr：2、合成方向：53；模板链解读方向：3 5,3、合成步骤：,解链：由DNA解链酶催化，SSB与单链 DNA结合，防止双链间氢键再形成；解旋：由拓扑异构酶解除超螺旋；识别起点：由DNA指导的引物酶完成；RNA引物合成：以DNA为模板，在引物酶催化下由DNA转录生成5-10个核苷酸链；,DNA链延长：,在引物3-OH基上，按碱基互补原则经DNA聚合

12、酶（主要是酶）催化DNA链 从53延伸。前导链为连续的；后滞链为不连续的冈崎片段。,由DNA聚合酶（主要是酶）催化，切去RNA引物；按碱基互补原则，沿53方向，补齐缺口。,切除引物，补齐缺口：,连接封口：,由DNA连接酶催化，将补齐缺口的3-OH基与下一个冈崎片段的5-P以磷酸二酯键连接起来（消耗NAD+），最终形成完整的、与模板互补的DNA新链。,校正并修复DNA：,由DNA聚合酶校正并切除错配，再按53方向加上正确核苷酸。至此，原核细胞DNA合成完毕。,如何决定DNA复制的准确性？,、DNA聚合酶具有模板依赖性，复制时dNTP按A-T、G-C碱基配对规律对号入座，使子代DNA与亲代DNA核

13、苷酸顺序相同，但有大约10-4的错配。、DNA聚合酶I、均有35的外切酶活性，有纠正错配的校正作用，使错配减至10-6。、再经错配修复机制，使错配减至10-9以下。,（四）真核细胞DNA的复制：（DNA指导的DNA合成）,真核生物与原核类似，但更复杂，不同之处：1、DNA模板上有多个起点，即真核细胞 DNA复制由多个复制子共同完成。,2、有5种DNA聚合酶，各具功能；,复制DNA：后滞链；前导链；修复DNA：、；复制线粒体DNA：；引物合成：,在真核细胞内有五种DNA聚合酶（与细菌DNA聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核3-5外切-+酶活

14、性功能,引物 合成,修复作用,线粒体DNA的复制,核DNA的复制,修复作用,（五）反转录作用：（RNA指导的DNA合成）,反转录（逆转录 revers transcription）：以RNA为模板，4种dNTP为底物，合成与模板互补的DNA的过程。这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称。反转录酶：RNA指导的DNA聚合酶（RNA-directed DNA polymerase),催化逆转录反应的酶。,HIV的复制,反转录作用的生物学意义：,1）发展了中心法则；,2）有助于对RNA病毒致癌机理的了解；3）有助于研究疾病的起因、寻找防治途径；4）反转录病毒可改建成理想的信息载体

15、，用于肿瘤和遗传病的基因治疗；5）用于分子生物学的研究：合成基因、测序。,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),组成,功能,提供RNA模板催化逆转录,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,母链反折，有利于下游复制延伸,DNA聚合酶完成末端双链的复制,母链延长至一定长度后，

16、端粒酶脱离母链，母链以其3-OH反折，同时起引物和模板的作用,（六）DNA的损伤与修复,概念：1、DNA的损伤：一些理化因素：UV（紫外线）、电离辐射和化学诱变剂可使细胞DNA受到损伤而引起生物突变或致死。,UV造成的基因改变嘧啶二聚体的形成,2、细胞的修复机制：,1）光复活修复：可见光激活了光复活酶，它能分开由于UV照射形成的嘧啶二聚体，而恢复原来状态。,2）暗修复(切除修复)：,在一系列酶作用下，将DNA受损部分切掉，并以完整链为模板，合成被切部分，从而使DNA恢复正常。,3)重组修复,含有嘧啶二聚体或其他结构损伤的DNA在修复前仍可进行复制,但在新合成的子链中与模板损伤部位对应的地方因复

17、制受阻而留下缺口.在重组酶的作用下,带缺口的DNA与完整的姐妹双链进行重组交换,用相应的DNA片断填补子链上的缺口.而在另一条亲链产生的缺口则由DNA聚合酶以与其互补的完整子链为模板进行修复合成,最后由连结酶将缺口封好.,（七）细菌的限制-修饰系统：,1、限制性核酸内切酶（限制酶）：特异性强，可在DNA特异位点切开；DNA杂交允许特异核酸序列被删除；测序中可很快确定DNA序列。如：,2、细菌碱基修饰：,概念：在DNA特定短碱基序列上产生某专一性修饰，在整个细胞周期中保持完整，使得内切酶可识别而不能断裂。如：修饰甲基化酶。,意义：,可用以保护自身DNA，而外源DNA被分解；被修饰的碱基可逃避宿主

18、限制酶作用。应用：用于分子生物学研究：碱基测序、制定基因图谱的工具；用于基因重组。,利用限制酶进行基因重组,（八）基因重组与DNA“克隆”,1、基因重组：将不同DNA片段按设计方案定向地连接起来，并在特定受体细胞中与载体一起复制表达，使受体细胞得到新性状。,2、DNA克隆：,将目的DNA插入基因载体后，在细菌细胞中生长而扩增百万倍以上.这种以单一DNA片段复制成许多相同DNA片段的过程称。,二、RNA(ribonucleic acid)的生物合成,储存于DNA中的遗传信息需通过转录和翻译而得到表达。转录的产物有：信使RNA（messenger RNA,mRNA）核糖体RNA（ribosome

19、RNA,rRNA）转移RNA（transfer RNA,tRNA）,转录方式,1.对称转录-DNA两条链都作为模板.2.不对称转录-DNA一条链作为模板,另一条链不作为模板3.反向转录-以RNA作为模板合成DNA,（一）转录（DNA指导下的RNA合成）,1、概述：1）转录与DNA复制的相似之处：均以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；都是生成3，5磷酸二酯键；合成的方向都是5 3；遵从碱基配对规律。,2）模板：,模板链：(大多数情况)DNA双链中只一条链可做转录模板(拷贝），此链称或有义链。编码链：无转录功能的DNA链称为或反义链。,转录的不对称：,即转录的可选择性。包括：一条链可转录，另一

20、条链不能转录；模板链可不在同一链上；按细胞需要“开放或关闭”。,3）RNA聚合酶（RNApolymerase,RNpol):,作用条件：4种NTP；Mg2+或Mn 2+的存在；DNA模板；反应方向：53,催化的反应：,不需引物,在单核苷酸的3-OH上逐个加核苷酸。,原核细胞的RNA聚合酶,4种亚基组成，各亚基功能不同；同一种酶催化3种RNA的合成。,原核生物的RNApol全酶与DNA的结合,全酶：具有2亚基的RNApol。核心酶：没有亚基的RNApol。,真核细胞的RNA聚合酶,3种酶，亚基复杂。,大肠杆菌的DNA聚合酶和RNA聚合酶有哪些重要的异同点？,DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化多核

21、苷酸链向53方向的聚合。二者不同点为：DNA聚合酶以双链为模板而RNA聚合酶只能以单链为模 板；DNA聚合酶以dNTP为底物，而RNA聚合酶以NTP为底物；DNA聚合酶具有35以及53的外切酶活性RNA聚合酶没有；DNA聚合酶可参与DNA的损伤修复而RNA聚合酶无此功能；二者的结构也是不相同的。,4）转录产物结构特点：,5端和3端有不编码序列；,2、原核细胞的转录,包括：起始、延伸、终止,1）起始：,A、启动子：DNA上的一段序列，为转录开始的位点。包括：上游的-35序列和-10(Pribnowbox)序列。图中+1为DNA模板上被转录成RNA的第一个核苷酸，即转录起始位点。,B、起始过程：,

22、三步：A、全酶与启动子结合；B、DNA局部解开双螺旋；,C、形成磷酸二酯键。,RNA链从5端开始，在全酶作用下ATP或GTP与第2个NTP间形成磷酸二酯键。,2）延伸：,a、合成开始后,亚基释放，然后都由核心酶催化。b、核心酶沿模板移动，选择NTP，暂时形成DNA-RNA杂交链。,c、RNpol向前移动，DNA解链酶向前推 进，RNA链延长。,d、方向：,RNpol沿模板链3 5,RNA合成方向5 3。速度：25-50b/s。,3)终止：,终止信号：富含GC的回文序列和随后一段富 含AT的结构。RNpol到达终止位点，聚合反应停止。,A、不需因子的终止,a、发夹结构的形成：DNA上的回文序列使

23、RNA产物3 端自身碱基互补，形成发夹结构，杂合链趋于解体。b、产物的寡聚U片段促进RNA从DNA上脱落：杂交链中A-U间氢键相对较弱，新生RNA易从模板上脱落，不需因子即可终止。,回文结构DNA序列中以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同的双螺旋结构。即对称轴一侧的片段旋转180后，与另一侧片段对称重复。回文结构能形成十字结构和发夹结构,不需因子的终止,b、需因子终止,因子是一个6聚体蛋白，其功能：1）终止因子；2）NTPase活性：3）解旋酶活性。过程：1）在RNA存在下，水解NTP产能，使因子与 RNApol结合；2）解旋酶活性使RNA：DNA杂合链拆开，释放RNA，

24、酶和因子一起从DNA上脱落下来。,需因子终止,3、真核细胞的转录作用,1）特点；其基因家族是多拷贝的基因 重复组成，故一个基因上可同时进行多个转录过程，产生多条RNA链。蛋白质编码基因多是不连续的，编码部分（外显子）被不编码基因（内含子）隔断。,多起点转录,南非爪蟾的卵母细胞rRNA的合成,2）转录过程：,A、起始：启动子：具-25的TATA框（TATA box）；有些无TATA框，以看家基因（housekeeping genes)起始转录。转录因子(transcription factor，TF)：由多种蛋白质组成，与启动子 装配成复合物，协助聚合酶结合，起始转录。,TF与启动子结合；各种T

25、F辨认拼接；与RNpol结合，形成起始前复合物（PIC）。顺序：TATA PIC,起始过程：,D A B 酶/F E,B、延伸；,与原核类似：以有义链为模板；RNApol催化RNA3-OH对新进入的NTP的磷酸基进行亲核攻击，RNA以5 3合成。产物称原始转录产物,C、终止,转录终止与转录后修饰密切相关。,4、转录过程的抑制剂：,1）放线菌素D：插入DNA的dG-dC间，与G形成氢键，使DNA变形、失去模板功能，从而阻止RNpol沿模板链移动而抑制RNA延长。此为原核和真核生物RNpol的专一抑制剂。,放线菌素D,2）口丫啶acridine:,为具扁平芳香族发色团的染料，可插入双链DNA相邻b

26、p间，使DNA复制时缺失或增添一个核苷酸，从而导致移码突变，也可抑制RNA的起始和质粒DNA的复制。,3）利福平（利福霉素B的衍生物）：,与RNpol的 亚基结合，抑制原核细胞RNA的合成。,4）-鹅膏蕈碱：,分离自鬼笔鹅膏的一种八肽化合物，通过RNpol 抑制真核生物RNA合成。,5、转录产物的加工：,在专一酶作用下，切除多余部分或修饰，才成为“成熟的”RNA。此过程称为转录后加工。涉及：帽化、聚腺苷酸化、RNA剪接、碱基修饰等过程。,1）mRNA的加工：,原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。,

27、多顺反子:为多条多肽链编码的mRNA.单顺反子:为一条多肽链编码的mRNA.,真核mRNA的加工：,5-5磷酸二酯键,A、帽化；5端加上甲基化的鸟嘌呤帽。意义：免遭核酸酶水解；pr合成起始中发挥作用。,B、聚腺苷酸化：,过程：切去转录生成的过长的一段RNA；由多聚腺苷酸聚合酶以ATP为前体，在3 端加上约100-200个腺苷酸尾巴(polyA)。意义：免遭核酸酶水解；增加翻译效率。,C、剪接：,即精确切除内含子序列的过程。snRNA：富含u，部分序列与剪接点 处序列互补，可识别剪接点。这些为催化性RNA，称核酶。snRNP：snRNA与几种辅助蛋白组成。分别命名为 U1,U2.剪接体：snRN

28、P与hnRNA组成。,过程：,剪接体形成；2，5磷酸二酯键形成，释放外显子1。外显子1的3-OH亲核攻击外显子2的5-P，形成磷酸二酯键，释放套索。,2）核糖体RNA前体的加工：,A、原核rRNA加工：30S前体甲基化；断裂生成17S、25S中间产物；RNA酶剪切形 成16S、23S rRNA。,B、真核rRNA加工,甲基化剪切,核酶,发现：四膜虫rRNA剪接不需任何蛋白质；线性rRNA具有许多反向互补序列，可形成局部双螺旋。,核苷酸断裂点,核酶的槌头结构,意义：,对研究生命起源和进化有重大意义；发展了酶的概念；可人工设计酶。,用途：,用于核酸剪切；用于破坏RNA病毒；破坏对人类不利的基因。,

29、3）tRNA前体的加工：,不同tRNA的加工方式不同，一般经：A、除去3、5多余核苷酸；B、有些在3加CCA序列；,（二）RNA复制（RNA指导的RNA合成）,在某些生物中，RNA还可是遗传信息的携带者，并可通过复制合成与自身相同的RNA分子。有以下方式：1、反转录病毒的RNA合成：RNADNARNA 2、以病毒RNA为模板的RNA合成：RNARNA 在依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA复制酶）催化下完成。,（三）多核苷酸磷酸化酶（无模板的RNA合成）,以一种NDP或4种NDP为底物，在多核苷酸磷酸化酶（与RNA合成有关的酶系）作用下，合成类似RNA的聚合物，同时放出磷酸的过程。酶特点：1）只在细菌中发现；2）是与RNA合成有关的酶，3）以一种NDP或4种NDP为底物；4）在细胞内的功能可能是分解RNA。,应用：,在实验室制备各种RNA聚合物。1）研究核酸结构和特点；2）推断各aa的密码；3）设计核酶。多核苷磷酸化酶nNDP(NMP)n+nPi,作业,1名词解释基因、转录、翻译、模板链、编码链2RNA和DNA有何异同？3如何决定DNA复制的准确性？,