核酸体外扩增.ppt

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1、第十一章 核酸体外扩增,1、体内DNA复制 体外酶促基因（DNA）扩增（1）模板 dsss ds（热变性）ss（2）酶 DDDP（II）耐热的Taq酶 有3 5外切酶活性 有5 3外切酶活性 5 3 外切酶活性 无3 5 外切酶活性（3）引物 RNA DNA（4）dNTP（5）Mg2+（6）反应缓冲体系（7）反应温度 37 94，55，70-72,核酸体内扩增和核酸体外扩增,2、PCR引物相关概念,A,B,a,b,5,3,5,3,引物a与A链一致，在5端，与B链互补，所以,a为,上游引物3端引物反义引物左侧引物向前合成引物,反之b为,下游引物5端引物正义引物右侧引物向后合成引物,3、为什么要进

2、行PCR？,为了获得基因诊断的材料。进行基因定量（表达异常）和进行基因定性（结构异常）以及获取研究的材料。,PCR-所谓PCR，又称体外酶促基因扩增，是利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特征，模仿体内DNA的复制过程，在附加的一对引物之间诱导的聚合酶反应。基本原理：在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。,第一节 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),一、PCR的基本原理,PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增

3、DNA片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是ssDNA片段。待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。此时两引物3端相对，5端相背。在合适条件下，由Taq（或其他）DNA聚合酶催化引物引导的DNA合成，即引物的延伸。上述过程是由温度控制的。这种热变性复性延伸的过程就是一个PCR循环（图11-1）。PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。延伸产物经第二循环变性后，亦与引物互补，作为引物引导DNA合成的新模板。因此，第二循环后，延伸的模板由第一循环的4条增加为8条（包括原始模板在内），依此类推，以后每一循环后的模板均比前一模板增加一倍。理论上，扩增DNA的产量是指数上升的

4、，即n个循环后，产量为2n拷贝。图11-1明显指明了扩增片段的末端是由两引物5端限定的。,1、（高温）变性（94）（denaturation）-在摩尔数大大过量的两段寡核苷酸及4种dNTP参入下，对模板DNA进行加热变性，通过加热使DNA双螺旋氢键断裂，双链解离形成单链DNA。（denaturation）。2、（低温）退火（55）（annealling）-将反应混合液冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火。当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物与其互补模板在局部形成杂交链，而模板双链之间互补的机会较少。3、（中温）

5、延伸（70-72）（extension）-在底物4种dNTP及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链按5-3方向进行延伸反应。以上3步为一个循环。在PCR仪（或手动PCR）作用下，如此反复进行变性、退火和延伸循环，从而使产物迅速得到扩增。几十轮反应仅需数小时，介于两个引物之间的特异性DNA片段可得到大量复制，数量可过2106-2107拷贝。有人将这一过程描述成：高温变性，低温退火，中温延伸，cycle，cycle。,PCR是3个反应的有序组合和循环：,基本步骤：变性：加热使双链DNA变为单链 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 延伸：耐热DNA聚合酶按53方向催

6、化以引物为起始点的延伸反应,PCR的基本原理 示意图,二、PCR引物设计原则,在PCR反应中使用的耐热Taq（或其他）DNA聚合酶，相应的缓冲体系及dNTP（核苷三磷酸）已经商品化，可从相应公司购买现成待用的，但有两个关键成份是有待研究人员准备的：第一个是核酸模板（我们放在引物设计原则之后讨论），不能有污染，不能有聚合酶抑制剂。第二个是寡核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成败的关键。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其有效扩增模板DNA序列，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保成功，但遵循下述原则，则有助于引物的设计。,1、

7、待扩增片段必须是已知的（至少2个引物互补序列是已知的），在片断两侧确定引物序列。2、引物长度 一般为15-30个核苷酸，可以据需要设计的更长一些，但至多到50个核苷酸左右。（注：引物的有效长度Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，否则，最适延伸温度会超过Taq聚合酶最适温度，不能保证产物的特异性）。3、碱基的随机分布 引物中4种碱基分布最好是随机的，避免出现嘌呤嘧啶堆积现象，G+C含量为40%-60%。（注：Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定的盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链温度，有效启动温度（Tp）一般高于Tm值5-10。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T），估计引物

8、Tm值，则有效引物Tm为55-80，其Tm值最好接近72以便复性条件最佳）。4、引物自身和引物之间 引物自身不应存在互补序列，（避免引物自身成发卡结构或引物本身复性，这种二级结构会因空间位阻效应影响引物与模板复性结合，若人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp）。引物之间不应有互补性，尤应避免互补重叠，（以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个碱基的同源性或互补性）。,5、引物的3端 与模板DNA一定要配对，（引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰）。有资料表明3端末位碱基在很大程度上影响Taq酶延伸效率，当末位为A时，即使错配，也能引发链的合成，（A：A错配使产量下降至1/20；

9、A：G和C：C错配下降至1/100）。而末位为T时，错配引发效率会大大降低，因G或C居中间，所以3端末位碱基最好选T、C或G，而不选A。6、引物的5端 5端界定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，末端碱基无严格限制，甚至可不与DNA模板匹配呈游离状态，但末端碱基最好是G或C（3对氢键），使PCR产物的末端结合稳定。7、引物5端修饰 引物与模板结合时，最多可以游离十几个碱基而不影响PCR扩增的特异性，因此，5端可以被修饰，引物5端修饰包括：1）引入酶切位点，可使PCR产物克隆效率更高；2）引入突变位点，起始密码子或终止密码子；3）标记生物素，地高辛，荧光素等；4）使用T4噬菌体多核苷酸激

10、酶使末端为平端的PCR产物使其磷酸化克隆到通用载体上。8、引物中引入酶切位点 注意5端上游不应少于3个核苷酸，否则切不开，有些酶（如Hind）至少需要7个核苷酸，5GGGTGACAAGCTT3 如有可能，最好把位点放在引物的中间，将引物设计为25-30个核苷酸。,PCR引物设计原则要点 1.长度为1530个核苷酸 2.碱基随机分布，G+C的含量为4555%3.避免发夹结构的形成，引物的存在连续互补序列不超过3bp 4.引物之间不应存在互补序列，避免3 端互补重叠 5.引物的碱基序列与非扩增区域无同源性 6.引物3 端碱基一定与模板配对，最佳碱基选G和C 7.引物5 端可以修饰，如加酶切位点，突

11、变位点，起始密码子，终止密码子等。,三、模板制备,模板的取材主要依据PCR扩增对象及各学科的专业知识而定。模板（或PCR的标本）经适当处理方可使用。因为处理：1、使待扩增DNA暴露，能与引物复性；2、去除抑制TaqDNA聚合酶杂质，在制备RNA模板时要防止RNA降解。,（一）DNA模板制备 1.去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸 2.水煮沸溶解细胞 3.要求并不严格 4.模板用量低，哺乳动物基因组DNA1g，质粒DNA0.1ng,（二）RNA模板的制备 1.RNA提取试剂盒 2.酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法 3.异硫胍氯化铯密度梯度分离法 4.SDS-酚-氯仿法,（三）模板的取材 模板（PCR样

12、本）可来源于病原微生物，组织细胞，血迹精斑，羊水尿样等。关于模板DNA或RNA制备请参看实验讲义。1.病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等 2.病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等 3.法医学标本：血斑、精斑、毛发 4.考古标本,四、PCR的基本反应,在此处仅列出一般PCR操作过程，具体各种影响因素的优化（PCR反应条件的控制）将在下面讨论，每一具体操作前都要进行必要的优化。,（一）以DNA为模板的反应,反应体积：50100l缓冲液引物底物：4种dNTP模板：102105拷贝TaqDNA聚合酶矿物油,50mmol/L kcl 10mmol/L TrisHcl mmol/L

13、（室温PH8.3）1.5mmol/L Mgcl2 100g明胶或BSA 引物1.2各0.25mol 4种底物（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）各200mol 模板DNA0.1g Taq聚合酶2.5单位 模板DNA的用量需根据分子的大小加以调整，一般需含102-105拷贝的DNA，封上矿物油，防止高温反应时液体挥发，以防污染。反应条件94变性30s，55退火30s，70-72延伸30-60s，共进行30次左右的循环。,1、标准的PCR（反应体积50-100l）,2、按实习讲义操作PCR,1）按以下顺序，将各成分在0.5ml无菌离心管混合：无菌水 30l 10Buffer 10l 4种dN

14、TP，每种浓度为1.25mmol/L 16l 引物1（5pmol/l）5l 引物2（5pmol/l）5l 模板DNA0.1-1.0g（）l 加水至终体积 100l 2）将溶液混匀，15000rpm10s。3）95加热混合液7分钟，使DNA完全变性。4）将0.5l（2.5单位）Taq酶加入混合液中（也有先加酶）。5）封上矿物油100l。6）按下述条件PCR：循环 变性 退火 聚合首轮循环 945Min 501Min 721Min后续循环 941Min 501Min 721Min末轮循环 941Min 501Min 727Min 7）末轮循环后不再变性，15000rpm2Min，将反应转入另一小管

15、中，-20保存。8）从反应物取出扩增DNA凝胶电泳，southern杂交或测序分析。,（二）以mRNA为模板的反应（RT/RCR）,逆转录反应体系体积：20 l缓冲液底物：4种dNTP引物：digo(dT)1218模板：RNA逆转录酶其他试剂：RNA酶抑制剂，MgCl2.DTT.牛血清白蛋白PCR反应体系同以DNA模 板的反应体系,（1）将无菌Eppendorf管置冰上，混合：mRNA（1g/l）10.0l Oligo（dT）12-18（1g/ml）10.0l 1mol/Tris-cl（PH7.6）2.5l 1mol/kcl 3.5l 250mmol/L Mgcl2 2.0l 4种dNTP，每

16、种浓度均为5mmol/L 10.0l 0.1mol/L DTT 2.0l RNA酶抑制剂 25.0单位 加水至 48l 可用10-50pmol用于PCR扩增上游寡核苷酸引物（被3引物或向前合成引物）代替Oligo（dT）作引物，上游引物与初始mRNA互补，下游引物与（5引物或向后合成引物）与cDNA第一链互补。,1、逆转录，以mRNA为模板合成cDNA,（2）加入逆转录酶（MMLV）（Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶），轻轻振荡，免泡沫产生，因MLV逆转录酶含TritoX-100，必要时可离心片刻去泡沫。（3）37温育1h，（逆转录）。（4）955分钟，灭活逆转录酶。（5）在无菌0.5ml

17、Ep管中混合下液：无菌水 30l 10Buffer 10l 4种dNTP，每种浓度为1.25mmol/L 16l 上游引物（5pmol/l）5l 下游引物（5pmol/l）5l 逆转录反应混合液 5l 加水至终体积 100l,2、按以DNA为模板方法PCR,附普通PCR 与 RT-PCR区别 1、反应步骤 一个阶段（DNAPCR）分两个阶段（逆转录、cDNAPCR）2、反应体系（1）模板 DNA mRNA，cDNA（2）引物 上、下游引物 上、下游引物（3）酶 TaqDNA聚合酶 逆转录酶、Taq酶（4）底物 4种dNTP 4种dNTP（5）缓冲体系 离子浓度和溶液 PH有区别 酶保护剂 BS

18、A DTT 关于引物摩尔数计算 PCR反应中，引物以pmol数表示，合成引物后，引物量以OD值表示，换算如下：OD为1的引物为33g 引物的分子量=碱基数330 引物pmol数=OD值33100000/碱基数330=OD值10000/碱基数33,（三）PCR产生的积累规律,PCR是酶促核酸体外扩增，扩增过程遵循酶催化动力学原理，反应初期，DNA量指数增加，随着场物积累，引物-模板-酶达到一定比例时，酶催化反应趋于饱和，DNA增加减慢进入相对稳定状态，出现“停滞效应”，这种效应称“平台期效应”，平台效应可能与下述因素有关：1、dNTP、引物浓度降低；2、随产物增加，酶与模板比例下降；3、变性温度

19、（93-95）和温度循环使酶活力和dNTP稳定性下降；4、非特异产物或引物二聚体与反应物竞争；5、产物在高浓度变性不完全，影响引物的延伸；6、产物高于10-8mol/L时，可影响Taq酶延伸和加工能力；7、酶与PCR产物结合，酶分子减少。Taq酶特异性，忠实性较好，一般用Taq酶。若进入平台期（一般难避免），产物仍不够用（一般够用）可稀释产物DNA样品103-104倍后，进行新的PCR。,PCR产物的积累规律,1.模板核酸2.引物0.10.5mol/L3.1050mmol/L Tris-C4.1.5mmol/L5.20200 mol/L6.Taq DNA聚合酶7.温度循环参数,五、PCR反应条

20、件的控制（PCR条件的优化）102-105拷贝的靶序列,PCR必需具备的基本条件是：1、模板（DNA或RNA）102-105拷贝的靶序列；2、人工合成寡核苷酸引物；3、缓冲体系；4、Mg2+；5、dNTP；6、Taq酶；7、温度循环参数（变性、复性、延伸温度及循环数；8、其他因素如加BSA、DTT、矿物油等等，下面我们分别讨论这些反应条件对PCR影响。,（一）模板核酸,前面三，我们已提到模板据PCR扩增对象及各学科专业知识而定，模板可以DNA需先逆转录cDNA才能进行正常PCR循环。1、不同来源模板DNA或RNA制备请参考实验技术书。2、模板核酸纯化的要求，尽可能纯化，不含DNA酶聚合抑制剂，

21、参考实验技术书籍。3、模板核酸在PCR反应中加入的量，一般为102-105拷贝的靶序列，下述参数供您参考：1g人基因组DNA相当于3105个单拷贝靶分子 10ng酵母 DNA相当于3105个单拷贝靶分子 1ng大肠杆菌DNA相当于3105个单拷贝靶分子 1%M13噬菌体人基因组DNA相当于106个单拷贝靶分子 扩增不同拷贝数的靶序列时，加入含靶序列的DNA量亦不同，如：真核rRNA基因有200-500拷贝，反应中仅需加入0.5-2ng人基因组DNA即可。以质粒DNA与以染色体DNA为模板扩增最适条件是不同的。前者所需量少，循环少，温度不如染色体DNA要求严格。扩增染色体DNA至少需要25-30

22、个循环，如在第15循环后补加一些Taq酶获得更好的扩增效果。扩增靶序的长度根据不用目的而不同。用于检测目的扩增片段长度一般为500bp以内，以100-300bp为最好。用Taq聚合酶在合适条件（较长延伸时间）下，可扩增长达10-20kb的片段。,（二）引物,PCR扩增产物的大小是由特异引物限定的，因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。,1、引物合成的质量 合成引物须PAGE和HPLC纯化，因为合成引物中含有相当数量“错误序列”其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异性扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高、且

23、需纯化。冻干引物-20至少保存12-24个月，液体状态-20可保存6个月。引物不用时应-20保存。2、引物的设计原则 参前述二、逆循基本原则、借助微机帮助有助于PCR成功。3、引物的用量及其计算 一般PCR反应物终浓度为0.2-1mol/L（讲义P217为0.1-0.5mol/L）在此范围内，PCR产物量基本相同。但引物低于0.2mol/L时，则产物量偏低。过高会促进引物引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体形成，二者与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。（引物浓度可按下述公式计算：摩尔淬灭系数（Em）是1cm光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在UV260nm

24、下的光密度（OD）值。Em=a（16000）+b（12000）+c（7000）+d（9600）abcd代表寡核苷酸中A、G、T、C的个数。例：一纯化的20mer寡核苷酸溶于0.1ml水中，取10l稀释至1.0ml，测其OD为0.76，原液OD为76，若AGTC均为5，代入公式Em为223000，76/223000=340nmol/L,（三）耐热DNA聚合酶,自从耐热Taq酶引入PCR后，又有许多耐热DNA聚合酶（VENT和Tth等）用于PCR、以Taq酶（PE-cetus公司）多用。该酶75-80时具有最高生物活性，温度过低，过高，酶活性下降。后者还与引物-模板稳定性有关。在92.5，95，9

25、7，其活性半衰期分别为130min、40min、5min具有良好的热稳定性。100l反应体系中加入0.5-5单位Taq酶，过高，琼脂糖凝胶电泳会出现非特异扩增带，过低，靶序列产量低。PCR后可通过1、99-100加热10min；或2、加入EDTANAa2至10mmol/L螯合Mg2+；或3、酚、氯仿抽提，乙醇沉淀PCR产物灭活Taq酶。Taq酶有53,而无3 5外切酶活性，因此它不具有大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow酶的3 5“校对活性”，它的忠实性较后者差。（DDDPI-分子量109KD，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解成两个片段，一个片段为76KD，有聚合酶，3 5外切酶活性，即Klenow

26、片段，另一为34KD，有53外切酶活性。聚合作用-以DNA为模板，将dNTP逐一按碱基配对原则加在引物3-OH末端；3 5外切酶活性-能识别清除错配的引物末端，有校正功能；53-从5切除DNA链，产生5单核苷酸，可能参入切除RNA引物，跳过几个核苷酸切除错配核苷酸，在DNA损伤修复中起作用）。（缺口平移标记32PDNA探针DNA酶I）。PCR产物整体用作探针或直接测序，偶然错配则无关紧要。假若需要克隆单个DNA分子（如突变DNA分子），则需要来自至少两个独立扩增系统或进行确证性测序加以印证。,（四）镁离子浓度,Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必须的。Mg2+浓度除影响酶活性和忠实性外，也影响

27、引物退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体形成等，过低，酶活力降低，过高，酶催化非特异性扩增。酶需要的是游离的Mg2+浓度，PCR模板DNA原液中如含EDTA螯合剂，引物和dNTP的磷酸根均可与Mg2+结合降低Mg2+浓度。最好对每种模板，每种引物组合都要进行Mg2+浓度优化，办法是：实验中模板、引物、dNTP，设定循环参数，Tris-cl和Kcl相对固定，Mg2+以0.5mmol/L开始以0.5mmol/L浓度递增，电泳EB染色确定各扩增产物量，确定Mg2+的最佳浓度。Mg2+浓度一般为之间，常用1.5mmol/L（对应dNTP浓度为200mol/L左右）,（五）dNTP

28、s,（六）缓冲液,储备dNTP液具有较强的酸性，应以NaOH将PH调至，分装-20保存，避免过多冻融会使dNTP降解。其浓度为20-200mol/L，高，增加错误掺入率，加快反应，低，提高实验精确性，使反应速度下降。,目前最为常用的缓冲液组成为10-50 mmol/Ltris-Hcl（PH8.3室温，72PH7.2），50mmol/LKcl,1.5mmol/LMgcl2。Tris是双极性离子缓冲液，20Pka8.3，在实际PCR变化在之间，加大Tris浓度（如至50mmol/L），改变反应液缓冲能力（PH8.9），有时会增加产量。50mmol/L以内Kcl有利于引物退火，大于此浓度则抑制酶活性

29、，加入BSA、DTT（明胶或Tween20）有助于酶稳定。,（七）温度循环参数,1、变性温度和时间 一般94-9530-60s可使各种复杂DNA分子完全变性（变性不完全会导致PCR失败），过高，时常会影响Taq酶活性，简单办法先变性，如977-10min，再加酶，过低过短时间，变性不完全。2、复性（退火）温度与时间 复性温度决定PCR的特异性，一般为45-55，低，易退火，但特异性低；高，退火较难，但特异性高。引物复性温度和时间取决于引物碱基组成，长度。扩增引物在PCR条件下真实Tm值-5是合适的复性温度，Tm=4（G+C）+2（A+T）（Tm-A260达到最大值1/2，即变性DNA达到DNA

30、总量1/2时的温度）。退火时间30s足以使引物和模板结合 3、延伸温度与时间 引物延伸温度一般为72，不适合温度会影响产物特异性及产物。延伸时核苷酸掺入速度取决于缓冲体系，PH，盐浓度和DNA模板性质。延伸时间取决于靶序列的长度和浓度，721min对于长达2kb的扩增片段是足够的，3-4kb需要3-4min，时间过长会导致非特异性扩增带，对很低浓度底物，时间要长些。4、循环数 不管模板浓度多少25-30次循环是比较合理次数，因20-25次循环，PCR产物积累可达最大值，每次虽不能不能达到100%，但25-30次应该足够了。,六、PCR实验中应注意的事项,（一）防止污染,由于PCR强大扩增能力与

31、检测敏感性，极微量污染便可导致假阳性结果，采取如下措施，有助于防止污染。1、小量分装试剂。2、使用一次性吸头及试管。3、分开样品制备，PCR，PCR产物分析操作区。4、样品制备按无菌操作进行，避免样品间交叉污染。5、使用专用微量可调加样器用于PCR。（带一次性手套）,（二）实验中的对照,每次实验都要设置严格对照，（以监测或追踪污染源和判断实验结果等）阳性对照：阳性模板。阴性对照：阴性模板。试剂对照：除模板外所有组分，监测试剂是否（PCR产物）残留污染等。,（三）扩增反应总是阴性结果（很少或没检测到产物的对策）,（四）出现非特异性产物对策,1、取10扩增混合液作模板再次PCR扩增。2、增加Taq

32、酶量。3、增加靶DNA量。4、若模板为粗制品，纯化样品。（样品可能存在抑制物）5、增加循环数。6、适当降低退火温度。,1、增加退火温度。2、减少Taq酶浓度。3、减少退火及延伸时间。4、减少引物浓度。5、减少循环次数。,第二节 PCR技术的扩展,自从Mullis80年代发明PCR技术以来，该技术得到了广泛应用和扩展，PCR技术扩展很多，就以下几种，我们予以简单的介绍。,一、多重PCR(multiple PCR),用多对引物扩增同一模板的几个区域,多重PCR（multipler PCR）-是在一次反应中加入多种引物，同时扩增1份DNA样品中不同的序列。每对引物所扩增的序列长短不同。根据不同长短序

33、列存在与否，检测是否有某些基因片的缺失与突变。如杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种致死的X-连锁阴性遗传病，患者5岁前即出现骨骼肌无力，12岁时卧床不起，20岁左右死于呼吸或心脏衰竭，在男婴中达1/3500，其病因是X染色体短臂2区1带抗肌萎缩蛋白基因缺失或突变导致该蛋白缺失或功能异常。该基因全长2000kb，有70多个外显子，基因缺失集中于9个易发热点区，位于4、8、12、17、44、45、48、51等9个外显子内。已有人设计了9对引物，一次加入反应液，电泳观察相应区带（9条，分别为196、268、288、300、331、416、459、5

34、06、547bp）是否缺失，几h内可完成，比分子杂交简单，要快，它可检测出80%DMD。（外显子-结构基因编码成分，因其产物要送到胞浆中去，故名；内含子-插入结构基因内而不编码顺序。Exon、intron）。,二、筑巢法PCR,巢式PCR和半巢式PCR(nested primer PCR)1.设计一对外测引物和一对内测引物 2.先用外测引物扩增含目的DNA的大片段 3.再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的DNA片段 一般外侧引物扩增30个循环，取10%反应产物加入新试管，加内侧引物，反应液再30个循环，此法的特异性很高，因为模板必须与4个寡核苷酸引物结合才能获得阳性结果。,三、二次PCR,

35、又称Boster PCR，分二期执行PCR。第一次先扩增DNA模板中少量拷贝，然后再用一对引物做二次PCR。,四、中断性PCR,也是一种两期PCR法，第一期PCR产物作第二期反应的模板。第二期包括原来1条引物和互补扩增产物中心内侧另一条引物，这种PCR特异性强，常用于检测重排的基因。,五、共享引物PCR,（shared primer PCR）利用3条引物来扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物可与两种DNA序列互补结合,共享引物PCR示意图,共享引物PCR（shared-primer PCR）是利用3条引物来扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种DNA序列都互补，并与另外两条引物分别组成

36、两对PCR引物，这种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。,六、不对称PCR,(asymmetric)不对称PCR是在扩增循环中，两条引物采用不同的浓度，获得单链DNA进行序列测定。两引物浓度比为50-100：1,七、彩色PCR,（color complementation asay)用不同荧光染料分别标记PCR引物，采用多重PCR扩增同一DNA的不同区域，显示不同颜色，用于基因诊断。,又称互补着色性检测，是标记引物PCR一种，是利用荧光染料标记引物的5端。不同荧光标记的引物同时参加反应，扩增后的目的基因会分别带有引物5 端的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可以根据不同荧光的色泽

37、判断目标基因是否存在及扩增基因的类型。一般彩色PCR仅需二种不同颜色的引物，一种作为基因检测的引物，另一种作为控制实验条件的内对照，即可检测基因缺失，染色体易位或感染某种病毒。检测多种点突变，几种可疑的病毒感染、HLA位点分析等都可用彩色PCR同时检测多个位点，这大大方便了临床应用。,八、反向PCR,（inverted PCR)用限制酶消化基因组DNA，用连接酶将各片段连接成环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序列设计3端引物和5 端引物，扩增未知序列。,又称染色体步移，是指将含有核心区的DNA用合适的限制酶消化后，产生合适于PCR扩增大小的片段，将该片段两端连接起来，成为环状分子。PCR引物

38、与核心区引物两侧的顺序同源，但这对引物的方向延伸是环状分子的未知顺序区而不是分隔两个引物的核心区。可以说，常规PCR是扩增两引物之间的DNA片段，反向PCR是利用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，该技术可对未知序列扩增后进行分析，它不必构建克隆，就可以在侧接区域步移成百上千个碱基对，筛选DNA文库，确定插入支部位的遗传成分和其它中等大小的重复序列，是一种省时、省力的PCR方法。,九、锚定PCR（anchored PCR)以mRNA为模板经RT合成cDNA，末端转移酶在cDMA3末端加上poly(dG)尾。Poly(dC)锚定引物与poly（dG)尾互补结合引导合成未知DNA序列,十、

39、原位PCR（in situ PCR）固定组织细胞内的DNA或RNA，以其为模板进行PCR反应的过程,十一、定量PCR（quantified PCR）1.以mRNA为模板合成cDNA2.加入参照基因，待测基因，参照引物，待测基因引物3.PCR扩增4.以参照基因的扩增产物为基础，观测待测基因产物的相对量。,十二、差异显示PCR（differential display PCR）1.将两种mRNA逆转录为cDNA第一链2.加入锚定引物，随机引物3.PCR扩增，以扩增引物代表相应mRNA4.分析两种基因表达的差异,十三、重组PCR（recombinant PCR）PCR参与的体外基因突变或基因融合过程

40、,十四、PCR技术的应用（一）遗传性疾病的基因诊断，例地贫的产前诊断。,（二）检测癌基因PCR与寡核苷酸探针杂交结合检测ras基因点突变PCR扩增包含ras基因12、13和61位密码子的DNA片段寡核苷酸探针与PCR产物杂交放射自显影，检测点突变发生的类型和部位,（三）检测病原微生物 PCR检测HIV、HBV、巨细胞病毒、人乳头状瘤病毒、肠道病毒、肺炎支原体等。,（四）PCR在法医学上的应用 亲子鉴定 个体识别,（五）PCR技术在分子生物学中的其它应用DNA克隆,重组PCR,引入点突变，缺失或插入,DNA序列测定,双链直接测序,双链克隆后测序:双链PCR产物加热变性为单链，与某一个方向的引物退

41、火，用双脱氧链终止法可测定一定长度的DNA序列 基因扩增转录测序:在PCR时，使用1个5带T7启动子序列的引物，T7RNA聚合酶以扩增产物为模板合成mRNA,然后以mRNA为模板，用逆转录酶进行测序 不对称PCR产生单链测序：用两种不同浓度的引物进行PCR反应，当低浓度引物耗尽时，高浓度引物介导合成单链DNA，然后以单链DNA为模板用双脱氧链终止法测序,第三节 扩增大片段核酸的PCR,普通PCR反应体系难以一次扩增3-5kb长的核酸片段。如果要扩增大片段核酸（如30-50kb），则需大片段PCR的方法，称为LA-PCR（long or accurate-PCR）。,一、影响大片段核酸扩增的因素

42、,（一）DNA链3端错配,普通PCR所用DNA聚合酶（如Taq酶）没有35核酸外切酶活性，无法消除扩增片段3端与模板错配，这是限制大片段核酸扩增机制之一。聚合酶在错配处停止不能过去。,（二）模板DNA链的损伤,模板DNA由于反应体系PH降低脱嘌呤和脱嘧啶造成本身损伤，而Taq酶不能通过该损伤部位，并且低PH值还可以使新合成的DNA链中的核苷酸间的连接键断裂，形成缺口而阻止链的延伸。,（三）其他因素,影响大片段核酸扩增其他因素还包括PCR添加剂（甘油-有助于PCR反应的复制过程；DMSO-有变性DNA的作用）。PCR循环参数，扩增模板的完整性等。Taq酶作用时间持久性，反应一定时间后，酶会自动从

43、DNA模板上滑脱，也影响扩增。,二、LA-PCR条件的优化,（一）DNA聚合酶,有十多种不同的耐热DNA聚合酶可用于PCR扩增，使用这些酶时，应考虑聚合酶能力，忠实性和热稳定性等因素，往往以双聚合酶战略消除合成中出现的3端错配，或采取合成能力更强的TH聚合酶（因为聚合能力强，35外切活性不能不强）。最好应用厂商或文献推荐方法,（二）缓冲液,常规PCRTris缓冲液对温度的依耐性较强，ponce micol建议使用对温度不敏感的Tricine缓冲液，提高PCR缓冲液体系PH稳定和缓冲能力，从而减少碱基脱嘌呤。,（三）Mg2+和K+,LA-PCR中Mg2+K+均低于普通PCR以增加酶的校正功能和活

44、力。,（四）PCR添加剂,添加甘油和DMSO可分别降低变性温度，保护模板DNA少受损伤，甘油还可以增加酶的热稳定性。,（五）引物,常规PCR引物设计原则及其浓度也适用于LA-PCR最佳的引物设计在扩增特异性和效率之间求得平衡，引物特异性非常重要，其次是引物复性温度Tm应60，使退火，延伸温度更接近，利于扩增特异性和效率。,（六）模板,降解的，有缺刻的，未纯化的DNA在常规PCR有成功的报道，LA-PCR需要高质量，高纯度，完整的模板。模板浓度需要优化，考虑特异性和效率，有人从0.1ng-100ng进行过研究。,（七）温度循环参数,变性温度时有赖于模板-引物特性及PCR仪而定，但温度尽可能低，时

45、间尽可能短，以使效率增加，退火和延伸温度可采用合二为一的办法，如60-70退火延伸5-20min，提高特异性。,（八）其他因素,PCR仪,第四节 连接酶链式反应,连接酶链式反应（ligase chain reaction，LCR）又称连接扩增反应（LAR），此反应是以DNA连接酶将其一DNA链的5磷酸与另一相邻DNA链3羟基连接起来为基础循环反应。LCR可用于检测点突变等。如在遗传性疾病和肿瘤的诊断，细菌和病毒基因分型及致病力鉴定领域应用等。,一、LCR反应的原理,LCR需要两对引物A、B和A、B。其中引物A与A，B与B互补，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板变性。复性后引物A与A的3

46、端分别与引物B与B的5端紧邻。若引物与模板完全互补，则在耐热连接酶作用下，可使相邻两引物5磷酸3羟基形成磷酸二酯键而连接，此连接产物在变性后又可以作为引物模板参加反应。经20-30次循环，检查连接反应的产物。若引物A的3和引物A5端所对应的模板DNA发生了碱基突变，或引物B的5和引物B3端所对应的模板DNA发生了碱基突变，都会使引物末端不能与模板配对结合，则引物之间就不能连接和扩增。,二、LCR产物的检测,核素标记引物：放射自显影检测LCR产物 荧光素标记引物：荧光DNA测序仪与基因扫描仪联用检测LCR产物 地高率标记引物：Southern印迹杂交，检测LCR产物,LCR的基本原理,32P标记

47、上游引物3 端，用变性凝胶电泳分离LCR产物，再用放射自显影检测LCR产物，也可用荧光素标记或生物素与32P双标记。（变形胶-用于纯化ssDNA片段，这类PAG是在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）存在情况下聚合而成的，DNA的迁移率和碱基组成及序列无关，故可用于同位素标记的探针，S1核酸酶的产物和DNA测序等。主要用于测定dsDNA长度和回收寡核苷酸。非变性胶-用于分离纯化双链DNA片段，缺点是在未变性PAG受碱基组成的影响，同等大小DNA分子可能由于空间结构不同使迁移率相差10%，故不能用于确定dsDNA大小，用于SSCP）。,三、影响LCR反应的重要因素,（一）引物,应足够长（20-2

48、5个核苷酸），确保引物与模板DNA特异性杂交，杂交温度在引物Tm值左右可增加扩增特异性。,引物：长度 2030bTm 68723末端碱基GC为宜提高LCR反应温度，避免非特异连接,（二）LCR反应条件,四、LCR的扩展,反应条件：1.反应体系：引物、模板、DNA pol、缓冲液、50l体积2.循环条件：94 15秒1分；6065 46分 循环1030次3.缓冲液4.引物浓度:0.55nmol/L之间,第五节 RNA的体外扩增,RNA的体外扩增，本节称为RNA-PCR（不是RT-PCR），同类名有转录依赖的扩增系统（TAS）或自主序列复制（3sR）系统等。它是模仿逆转录病毒RNA基因组成的。复制

49、机理，通过cDNA中介使RNA复制的。此反应是由逆转录酶，RnaseH和DNA依赖的RNA聚合酶协同完成的。,一、基本原理,整个过程是以cDNA为中介体，通过连续的逆转录与转录反应使RNA靶序列扩增。1、引物A与模板RNA特异复性。引物的5端带有T7RNA聚合酶结合位点，因此，逆转录产物cDNA就可以成为转录模板。2、引物A复性后，由逆转录酶催化合成cDNA第一链。,3、RnaseH可特异地水解RNA：cDNA双链中的RNA。4、这样，引物B即可与cDNA复性。5、RT催化由引物B介导的cDNA第二链合成。6、带有T7RNA聚合酶结合位点的dscDNA就可作为T7RNA聚合酶的催化底物，转录合

50、成反义RNA（和有义RNA，因为第一条dscDNA中的T7RNA聚合酶结合位点一端为双链，另一端为单链，所以开始以反义RNA为主）。7、转录的反义RNA可与引物B复性（引物A则可与有义RNA复性）。8、重复上述2-6步。RNA聚合酶可以转录出10-103RNA拷贝。,二、产物的检测,用葡聚糖珠杂交法检测。,三、优点与应用,优点：1、扩增效率高，以10的指数递增15min可将模板扩增105倍，扩增时间短，而PCR扩增同等程度需85min。2、特异性高，由于各酶依次反应“循环”次数，因此错掺率低，比PCR低80%。3、操作简单，无须特殊仪器，反应在37恒温中进行。4、不必防止DNA污染。应用：筛选