干细胞治疗糖尿病及糖尿病足有效性和安全性评价.ppt

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1、1,干细胞治疗糖尿病及糖尿病足有效性和安全性评价,2,糖尿病是一种慢性全身性免疫代谢性疾病。在临床上，糖尿病分为型和型，约占患者总人数10%为型患者要依赖胰岛素治疗；30%的型患者其后期也需要依赖胰岛素治疗。,3,4,5,目前用干细胞治疗糖尿病的方法如下：,(1)自体骨髓干细胞移植：抽取糖尿病患者自身的骨髓干细胞，在体外经过药物的诱导，将骨髓干细胞定向培养、分化成能够产生胰岛素的细胞，再注入患者体内治疗糖尿病。这种方法具有取材容易、价格低廉、疗效稳定、重复性好，无排斥反应等优点，是能够治疗糖尿病的方法。,6,目前用干细胞治疗糖尿病的方法如下：,(2)自体外周血干细胞移植：即采用血液成分分离技术

2、，经过小时以上的反复过滤，将患者自身血液内分散的骨髓干细胞集中起来，在体外经药物的作用，对干细胞的DNA进行修饰、扩增、更新和改造，使其基因重组，变成能分泌胰岛素的细胞，再由灭毒的感冒病毒做载体，输入到患者体内相应的脏器。,7,目前用干细胞治疗糖尿病的方法如下：,(3)人胚胎干细胞移植：胚胎干细胞是一种未分化的多功能细胞，存在于胚胎、骨髓、脐带、胎盘和成人的血细胞中，它可以培养成肌肉、神经、骨、胰岛细胞，以治疗相应的病症。从胚囊中分离出胚胎干细胞，并定向诱导分化为能分泌胰岛素的细胞，再移植到发病部位，就能修复受损的胰岛组织，从而治疗糖尿病。人胚胎干细胞移植具有免疫原性低、排斥反应轻等优点。但此

3、种方法正在动物实验中试用。,8,目前用干细胞治疗糖尿病的方法如下：,(4)脐血干细胞移植：脐血干细胞再生能力强，是成人骨髓干细胞再生能力的1020倍。抽取的脐血可定向培养，从而分化出多种组织细胞以治疗相应的疾病，如糖尿病、类风湿关节炎、白血病等。,9,一、糖尿病足的简介,根据世界卫生组织（WHO）定义：糖尿病足是指糖尿病患者由于合并神经病变及各种不同程度末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和（或）深部组织的破坏。在临床上，由于糖尿病患者由于长期受到高血糖的影响，下肢血管硬化、血管壁增厚、弹性下降，血管容易形成血栓，并集结成斑块，而造成下肢血管闭塞、支端神经损伤，从而造成下肢组织病变。而“足”离

4、心脏最远，闭塞现象最严重，从而引发水肿、发黑、腐烂、坏死，形成脱疽。目前，各大医院对糖尿病足患者一般采取截肢、搭桥或干细胸移植手术。,10,11,糖尿病足患者常表现为四种情况,（1）管腔狭窄早期：行走时出现疼痛为特征的间歇性跛行（2）随着狭窄的加重可出现静息痛甚至丧失行走能力（3）严重肢体缺血致组织溃疡发生（4）组织坏疽,12,13,14,15,16,糖尿病足患者常表现为四种情况,后两种情况预后极差，5年生存率仅为50%或更低。截肢目前被认为是这部分患者最好的治疗选择，但截肢后的总死亡率大约为25%-50%，围手术期的死亡率为5%-20%，二次截肢率大约为30%。由于弥漫性的、多节段的病变和/

5、或远端流出道闭塞，或者由于存在并发症，糖尿病足患者在围手术期存在死亡的风险。尽管微创接入技术和外科干预技术发展很快，大约40%的患者不符合进行血循重建的指征或进行血循重建不能得到有益的反应，而且目前又缺乏有效的药物治疗。因此，探索缺血肢体血循重建的新的治疗策略对于减少患者截肢，提高其生活质量具有非常重要的临床意义。,17,二、干细胞治疗糖尿病足的机理,干细胞治疗糖尿病足等缺血性下肢血管病是国内外学者关注的一项新技术，近年来经过大量实验研究和动物实验，国内外已有数家医院进行了2000例左右患者的临床研究。其理论基础是干细胞具有多向分化潜能，在特定环境中可分化为各种机体组织细胞，包括成血管细胞和血

6、管内皮祖细胞（EPC)，进一步形成新生毛细血管。动物实验表明，对缺血肢体行骨髓干细胞（BMSC）、外周血干细胞（PBSC）和内皮祖细胞移植后，可分泌诸如血管内皮生长因子（VEGF）等促进血管生成因子，形成新的血管内皮细胞及血管。将干细胞移植到下肢和足部缺血部位，可从先前存在的血管床发芽生成新的毛细血管，它能给血管狭窄或闭塞的患者提供一个治疗性生物“旁路”，称之为细胞性血管搭桥手术。,18,19,20,三、国内外研究现状,21,三、国内外研究现状,2002年Eriko等报告采用自体骨髓单个核细胞移植治疗缺血性下肢血管病变取得满意疗效。2003年黄平平等采用自体外周血单个核细胞移植治疗1例下肢动脉

7、硬化闭塞症，使该例患者避免了截肢致残的后果。此后，采用干细胞疗法治疗糖尿病足的报道不断增加，PubMed检索已达百余篇。资料显示干细胞疗法疗效显著：一般冷感疼痛缓解率为83%100%，ABI改善率为44%92%，保肢率为78%85%。最常采用的是成人自体骨髓单个核细胞移植和成人自体外周血单个核细胞移植的方法。,22,四、干细胞治疗糖尿病足临床研究,（一）病人的选择 1、干细胞移植适用于一下几种情况（1）动脉血管闭塞在下肢末端，动脉流出道差的患者，如腘动脉、腓动脉、足背动脉血管闭塞的病人（2）血管闭塞在股动脉及以上部位，但因年龄、基础疾病、身体情况差而不能耐受血管搭桥、介入相关治疗者(3)血管闭

8、塞较为广泛，不但存在高位动脉闭塞，同时有流出道差的患者，外科治疗较难进行者(4)上段动脉行介入治疗后，配合膝关节以下干细胞移植，将得到更好的治疗效果（5）血栓闭塞性脉管炎往往累及上肢，多见肱动脉以下血管闭塞，给予行干细胞移植，效果良好。,23,24,以下情况不适宜干细胞移植1.足部急性缺血，常见原因为上段血管内栓子脱落，随血流下行，闭塞下端官腔较细的动脉，导致该动脉供血区急性缺血；或动脉内急性血栓形成，闭塞血管，导致急性缺血，该两种情况表现为肢体急性缺血，足部发凉、皮肤颜色变暗发展较快，疼痛严重2.足部缺血病变严重，多个足趾和部分足部坏疽3.足部破溃合并感染4.较严重心脑血管病变不稳定期，如患

9、者3个月内曾发生脑梗塞、心肌梗塞5.存在较为严重的基础病变，如慢性心功能不全、肾功能不全等6.存在肿瘤疾病,25,（二）干细胞移植术前准备1.病人的准备 对于适合干细胞移植的患者，在入院后常规检查心电图、胸片、化验血象、肝肾功能、血脂等各项，同时对其基础疾病如高血压、高血糖积极治疗，如以上检查无明显异常，并血糖、血压控制在较好的范围后，可以给予治疗。,26,（二）干细胞移植术前准备2.干细胞来源的选择 目前应用于临床的干细胞有自体骨髓干细胞、自体外周血干细胞、脐血干细胞、脐带间充质干细胞。（1）自体骨髓干细胞是经骨髓穿刺获得干细胞；（2）自体外周血干细胞来源于患者外周血，但在正常外周血中，干细

10、胞含量很少，为了得到大量干细胞，应用重组人粒细胞集落刺激因子刺激骨髓中的干细胞释放入外周血中，该过程称之为干细胞动员。研究发现，经动员的自体外周血中干细胞含量数量高，得到的干细胞数量较采集骨髓的多。（3）目前高龄、自体骨髓干细胞活性差、不宜进行骨髓采集的年老体弱患者采用脐带血、脐带间充质干细胞移植，取得较好疗效。,27,（三）干细胞制备,28,（三）干细胞制备,1.自体骨髓血干细胞采集分离 骨髓干细胞采集一般穿刺点选择在双侧髂后上棘，患者俯卧位，暴露穿刺点，严格无菌操作，局部麻醉，穿刺成功后缓慢抽取骨髓，为减少混血及保证干细胞含量，给予换部位多点穿刺，结合年纪、体重、需要移植范围决定采集量。,

11、29,30,（三）干细胞制备2.自体外周血干细胞动员和采集2.1 自体外周血干细胞动员 用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）进行干细胞动员，5-10ug/kg/d,分早晚两次皮下注射，连续动员5天，动员期间每日监测外周血WBC计数。动员5天后，绝大多数患者外周血WBC计数均可达30 x109/L以上，此时行干细胞采集，获取的CD133+、CD34+细胞较多，基本满足治疗要求。,31,（三）干细胞制备2.自体外周血干细胞动员和采集2.2外周血单个核细胞（MNC）采集利用细胞分离机行MNC采集，取双侧肱静脉为穿刺点，循环800010000毫升血量，采集约100120毫升MNC悬液，取样进行计数检测，

12、根据统计资料显示该细胞悬液中单个核细胞总数为6.08.6x1010,使用流式细胞仪检测显示其中CD34+细胞含量为（0.321.1）%、CD133+细胞含量为（0.130.35）%。,32,33,（三）干细胞制备3.脐带间充质干细胞制备 取自足月剖宫产健康产妇。脐带采集时留血进行艾滋病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、谷丙转氨酶、支原体等检测，全部合格后方可进行制备。脐带采集后用植块法进行培养，待贴壁细胞呈梭形或多角形条索状融合大约90%即可进行传代培养。,34,（三）干细胞制备4.干细胞移植的方法 干细胞治疗缺血性下肢血管病的移植方法为自体缺血部位的肌肉内种植。在无

13、菌手术室进行，一般选择全凭静脉全身麻醉术，常规消毒手术野，结合其血管闭塞情况选择手术范围，双下肢局部种植选择在膝关节以下到足部，将采集的干细胞悬液按3cmX3cm间距进行肌肉注射，每点注射1毫升，足部按1cmX1cm间距注射，每点注射0.3毫升，按患者干细胞数量及移植范围具体情况一般注射点数在100左右。,35,36,（三）干细胞制备5.疗效评估方法5.1主观症状评估指标 行走距离、疼痛评分、冷感评分。1.行走距离：以米为单位，测定患者术前无疼痛行走距离，术后定期随访测定无疼痛行走距离，对照分析；2.疼痛评分为0-10分，0分为无痛、10分为最痛，术前后随访对照；3.冷感评分0+，0分为无发凉

14、、4+为最凉，术前后对照分析。,37,38,（三）干细胞制备5.疗效评估方法5.2客观检查评估指标 应用经皮氧分压、踝肱指数、皮温测定、足底深感觉测定及动脉CT、MRI成像进行疗效评估。1.经皮氧分压，使用多导联经皮氧分压测定仪测定足背皮下组织氧含量，治疗后，随着局部毛细血管网形成，循环改善，其经皮氧分压将逐渐上升；2.踝肱指数，在动脉供血状态改善后，其踝肱血压比值将有一定程度上升3.皮温测定，对其足踝部、踝背、足趾等处使用皮温仪测定皮温，治疗后足部皮温往往是最先改善的指标4.足底感觉测定，足部血运改善，使局部神经功能得到一定改善，足底感觉测定也是一评估缺血状态改善的一重要指标5.动脉CT、M

15、RI成像，通过对于干细胞治疗前后的患者肢体进行计算机断层血管造影（CTA）或核磁共振血管造影可发现治疗前后细小血管网和侧支持循环增加。,39,40,（三）干细胞制备5.疗效评估方法 5.3干细胞移植效果分析 自2003年以来，应用干细胞移植技术治疗556例糖尿病足及各种下肢血管病患者，总效率达87.6%。在这556例疾病中，糖尿病足206例（37.0%），血栓闭塞性脉管炎199例（35.8%），下肢动脉硬化闭塞症151例（27.2%）。有效率依次为：血栓闭塞性脉管炎92.1%,下肢动脉硬化闭塞症87.6%，糖尿病足85.0%。干细胞来源方面：自体外周血干细胞移植372例（66.9%），自体骨髓

16、干细胞移植168例（30.2%），脐带间充质干细胞移植16例（2.9%），有效率依次为：外周血干细胞移植91.7%，骨髓干细胞移植83.8%，脐带间充质干细胞移植80.4%。无效患者占12.4%，因足部坏疽、股动脉严重闭塞、下肢广泛性血管闭塞、急性下肢动脉血栓形成、全身性严重疾病等干细胞治疗无效，最终接受截肢手术。,41,（三）干细胞制备,5.疗效评估方法5.3干细胞移植效果分析 临床研究结果显示，我国北方地区高发的、截肢率很高的血栓闭塞性脉管炎，干细胞移植可作为本病的首选方案。糖尿病足的干细胞治疗受到很多因素干扰，疗效较其他疾病稍差。干细胞来源的选择方面，自体外周血干细胞疗效优于骨髓和脐带间

17、充质干细胞移植，但应说明的是，选择骨髓和脐带间充质干细胞移植方案的患者病情和年龄均差于外周血干细胞移植患者。3例患者在干细胞动员期间出现心、脑血管病变，经处理后痊愈，无移植相关性死亡病例。对254例患者随访一年以上，远期疗效稳定，一部分决定行截肢手术的患者保住肢体，避免了致残的严重后果。,42,（三）干细胞制备6.干细胞移植不良效果及处理,6.1干细胞动员和采集 自体骨髓干细胞治疗是经穿刺抽取骨髓液分离干细胞，尽管给予充分的局部麻醉，患者仍会出现局部疼痛，但一般均可耐受，无特殊处理。采集后部分患者可出现轻度的乏力、精神不振、但经休息后能恢复。外周血干细胞移植需用G-CSF进行动员，部分患者出现

18、流行性感冒样症状、肌痛、发热、和骨痛，不需特殊处理。动员期间因“高白细胞血症”，血液粘稠度上升，可能出现心慌、胸闷等症状，一般经给予吸氧等简单处理后均能缓解。少数严重者可有呼吸困难或诱发严重心脑血管意外，高龄或心脑血管病变的患者多不采用外周血干细胞治疗。,43,44,（三）干细胞制备6.干细胞移植不良效果及处理6.2干细胞移植技术 糖尿病足患者接受干细胞局部肌肉内移植，均采用全凭静脉麻醉。局部肌肉注射过程中，因短时间注射多点，偶尔出现小的皮下血肿，一般术后3-5天吸收，无特殊处理。,45,（三）干细胞制备6.干细胞移植不良效果及处理6.3干细胞移植后 因干细胞注射于局部肌肉中，患者在术后感觉注

19、射部位酸胀疼痛不适，活动时加重，但可耐受，约3-7天自行缓解。目前尚无因局部移植干细胞而引起肢体红肿、溃烂、缺血加重等情况。,46,五、存在问题1.适应症和禁忌症 同其他疾病治疗手段一样，并非所有糖尿病足患者、在疾病的任何阶段都适合接受干细胞移植治疗。如患者足部一旦发生坏疽，应进行截肢治疗，否则会危及生命。目前有些医生对干细胞治疗糖尿病足的适应症和禁忌症掌握宽严不当，影响这一技术的发展。,47,五、存在问题2.干细胞数量和质量问题 干细胞的数量和质量是决定疗效的重要因素，没有高数量、高质量的干细胞就没有患者的满意疗效。获得高数量、高质量干细胞的前提是要建立GMP实验室，配置分离、培养干细胞的各

20、种设备和仪器，配置血细胞分离机获得外周血干细胞，配置流式细胞仪检测细胞的免疫表型和数量，配置细胞安全检测系统确保产品无污染，制定严格的SOP体系等。还要有经验的细胞实验员完成细胞产品的制备工作。,48,五、存在问题3.疗效评估问题目前所有应用干细胞移植技术治疗血管病的医疗机构对患者术前后随访观察项目均是疼痛、发凉程度、无痛行走距离等主观指标和皮温测定、经皮氧分压测定、臂踝指数测定等客观指标，较好的还做到术前后动脉血管CT、MRI造影的对照研究，但这些均是宏观上的观察，对一些基础项目，如局部肌肉血管的病理学检查、细胞分化的示踪、血管结构成分的分析以及局部微环境细胞因子变化等，均难以进行深入的研究

21、。,49,五、存在问题4.安全性问题4.1致瘤性 干细胞是未分化的细胞，存在潜在的致瘤性问题。在临床研究中，有两个研究报道干细胞移植后，8例移植患者发生恶性肿瘤。虽然目前的文献报道有关肿瘤发生很少，且两者之间并未发现有明显额因果关系，但这些研究随访时间均不长，因此随着干细胞移植术后的时间延长，是否肿瘤发生率还要增加尚不可而知。对于脐血干细胞和脐带间充质干细胞，尽管种研究均显示为免疫缺陷细胞，排斥反应极低，但因目前临床应用病例更少，其长远应用安全情况在观察中。,50,五、存在问题4.安全性问题4.2免疫排斥性 异体干细胞移植的临床应用，如脐带间充质干细胞，尽管多种研究均显示为免疫缺陷细胞，排斥反

22、应极低，但因目前临床应用病例较少，其远期应用安全情况仍在观察中。,51,五、存在问题4.安全性问题4.3全身不良事件 目前绝大多数研究没有恰当的设计来评估与对照组相比的安全性，检索文献资料报道，全身不良事件罕见。,52,六、前景展望,53,六、前景展望,由于干细胞是未分化细胞，移植干细胞是否会在移植部位分化为其他组织，如骨组织，或出现肿瘤样生长，这些全方面的问题均得到密切关注。此领域的研究有赖于以下几个方面的发展：不同分子生物学技术的发展，如基因组、蛋白组和转基因小鼠等；组织工程和一载体系统的发展，如人皮肤组织工程、纳米材料、腺病毒和慢病毒等；从活检和动物模型中发现新的分子病理学机制将更好地找

23、到治疗靶点；分子靶向技术治疗的发展，如反义寡核苷酸、小干扰RNA、单克隆抗体等；干细胞研究的突破。这些技术均将可能应用于糖尿病足的治疗，整合并协调这些资源应用于临床，是一个从分子和细胞水平发展的系统工程。,54,六、前景展望,目前，干细胞移植技术治疗各种疾病仍处于临床试验阶段，若要真正将干细胞 技术用于普遍的临床治疗，仍有大量技术难题需要解决。我国研究人员和临床医生在干细胞移植治疗糖尿病足等缺血行下肢血管方面做了大量工作，付出了艰辛努力，取得了可喜成绩。但必须认识到，在基础研究方面与国外有一定的差距，还应加强在这一领域的研究，指导临床进一步提高疗效将是一个发展方向，既转化医学模式:基础研究临床应用新的基础研究完善临床应用。还需要进行大规模、长时间的随机对照试验，明确地回答尚未解决的问题，最终造福于广大患者。,