工业微生物NADH的代谢调控.ppt

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1、1,姓名：李波,学号：092408139,工业微生物NADH的代谢调控,梗概,引言1 NADH 生理代谢功能2 基于生化工程的NADH 代谢调控 2.1 添加外源电子受体调控NADH 代谢 2.2 添加不同还原态底物对NADH 代谢的调控 2.3 NAD+合成前体促进胞内NAD(H/+)代谢 2.4 环境条件对NADH 代谢的调控 2.5 氧化还原电势(ORP)的改变对NADH 代谢的调控3 基于代谢工程的NADH 代谢调控 3.1 过量表达NADH 代谢相关酶调控NADH 代谢 3.2 缺失竞争利用NADH 途径调控NADH 代谢 3.3 引入外源代谢途径调控NADH 代谢4 结论与展望,引

2、言,NADH 是碳代谢和氮代谢的关键辅因子。借助于基因工程手段直接操纵NADH 等辅因子，比改进代谢网络中若干节点处的酶活性对碳代谢流的影响更为有效，但在NADH 层面上调控碳代谢流的策略,形成了代谢工程的一个重要分支辅因子工程，即采用分子生物学的手段,改造细胞内辅因子的再生途径,调控微生物细胞内辅因子的形式和浓度,定向改变和优化微生物细胞代谢功能,实现代谢流最大化、快速化地导向目标代谢产物。本文从生化工程和代谢工程两个方面详述NADH、NAD+含量及其比率的调控策略。,1 NADH 生理代谢功能,NADH的分子结构式,NADH参与的各类代谢活动有300多个,NADH生理代谢功能,1)调控能量

3、代谢:NADH 通过线粒体内的电子传递链,利用氧作为最终电子受体,产生大量ATP;2)调节微生物胞内氧化还原状态:NADH/NAD+比率反映了微生物细胞内的氧化还原状态;3)调控碳代谢流:NADH 通过自身或所产生的ATP 激活或抑制代谢途径中关键酶的活性，实现对碳代谢流流向及其通量的调控;4)调节线粒体功能:NADH 通过影响线粒体通透性、控制线粒体膜上的电压依从性阴离子通道和增加线粒体膜电位等途径改变线粒体活性;5)调控细胞生命周期。,2 基于生化工程的NADH 代谢调控,2.1 添加外源电子受体调控NADH 代谢2.2 添加不同还原态底物对NADH 代谢的调控2.3 NAD+合成前体促进

4、胞内NAD(H/+)代谢2.4 环境条件对NADH 代谢的调控2.5 氧化还原电势(ORP)的改变对NADH 代谢的调控,2.1 添加外源电子受体调控NADH 代谢,醛、酮、酸、分子氮或硝酸盐均能作为外源电子受体,加速NADH 氧化,维持细胞处于最佳氧化还原状态(NADH/NAD+）比率。在利用异型发酵乳酸菌发酵己糖生产有机酸的过程中,添加一定的外源电子受体，有效地加速了NAD(P)H代谢速度,降低副产物赤藻糖醇和甘油的积累,显著加速乳酸菌的生长。,2.2 添加不同还原态底物对NADH 代谢的调控,碳源根据其在代谢过程中所产的NADH量不同而分为1、0 和+1 氧化态。美国Rice 大学San

5、KY 研究小组在一定稀释率的恒化厌氧培养系统中发现,随着碳源氧化态的增大,NADH/NAD+比率，从0.51(葡萄糖酸)增加到0.75(葡萄糖)和0.94(山梨醇),导致中心代谢流产物乙醇(消耗2 mol NADH)对乙酸(不消耗NADH)的比率随之改变。,2.3 NAD+合成前体促进胞内NAD(H/+)代谢,微生物细胞利用自身合成的或从培养基中吸收的烟酸、烟碱作为前体,在磷酸核糖转移酶的作用下经3 步反应合成NAD+，从而为提高胞内NADH 和NAD+含量提供了新的思路。光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸过程添加8 mg/LNAD+合成前体烟酸,使葡萄糖消耗速度和丙酮酸产量分别增加了48.4%和29

6、%。,2.4 环境条件对NADH 代谢的调控,微生物细胞所处的外部环境条件,如溶氧、温度的变化导致与之相关的NADH、ATP 合成和消耗,从而使微生物细胞内的物质代谢途径发生显著变化。在高溶氧的条件下,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸酶和依赖NADP+的异柠檬酸脱氢酶活性和表达量明显上调,而TCA 循环中合成NADH 的相关酶的活性明显抑制。在高浓度溶氧条件下添加外源电子受体乙醛对细胞的碳和能量代谢并不产生影响。温度调控胞内NADH方面,有研究发现较低的发酵温度能维持较高的胞内NADH/NAD+水平。,2.5 氧化还原电势(ORP)的改变对NADH 代谢的调控,氧化还原电位通过影响电子传递链中具

7、有金属活性位点的关键酶活性,影响NADH/NAD+比率,进而影响微生物代谢途,3 基于代谢工程的NADH 代谢调控,3.1 过量表达NADH 代谢相关酶调控NADH 代谢3.2 缺失竞争利用NADH 途径调控NADH 代谢3.3 引入外源代谢途径调控NADH 代谢,3.1 过量表达NADH 代谢相关酶调控NADH 代谢,在促进NAD+合成方面，pncB基因编码的烟酸磷酸核糖转移酶催化生成烟酸单核苷酸(NAMN)的反应是NAD 回补途径中的关键限速步骤。过量表达pncB基因,导致胞内NAD+、NADH 和总NAD+分别提高，而NADH/NAD+比率降低。在过量表达依赖于NAD+的脱氢酶方面，在酿

8、酒酵母中过量表达编码胞质依赖NAD+的乙醛脱氢酶基因ALD3,实现了NADH高效再生。,3.2 缺失竞争利用NADH 途径调控NADH 代谢,在葡萄糖发酵生产甘油的过程中，采用了维持1,6-磷酸果糖激酶和磷酸丙糖异构酶活性、削弱与甘油竞争NADH 的代谢途径和加强线粒体基质氧化分解速度等策略,以及添加甲酸促进胞质NADH 生成速度,使酿酒酵母生产甘油产率突破理论值。,3.3 引入外源代谢途径调控NADH 代谢,调控胞内NADH 代谢的另一重要策略是在微生物细胞内引入外源氧化还原代谢相关酶,改变胞内NADH 生成或氧化途径,从而改变NADH/NAD+的比率,实现微生物细胞内氧化还原状态的调控。胞质NADH 需通过“穿梭”途径进入线粒体,实现NADH 再氧化。如能在胞质中表达形成水的NADH 氧化酶,可直接将胞质中的NADH 氧化为NAD+,提高NADH 氧化速度和效率。,4 结论与展望,将调控胞内NADH/NAD+作为技术手段以优化微生物细胞生理代谢功能以促进微生物合成目标产物的代谢流最大化和快速化或合成新的代谢产物的研究则较其他方法少些。已公布的650 株微生物的全基因组序列(以及不断增加的模式微生物的转录组数据、蛋白质组数据和代谢组数据,为从功能基因与蛋白、网络、调控、适应等方面透彻理解微生物代谢与调控网络,提供了丰富的背景信息。,