定量检查法标准操作规范.ppt

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1、细菌内毒素定量检查法 天津大学药品生物制品 检测技术研究开发中心 易泰实验室,第一部分 细菌内毒素定量检查法基础知识,一.细菌内毒素标准品二.鲎试剂（TAL）三.细菌内毒素检查用水,一.细菌内毒素标准品,细菌内毒素国家标准品（RSE）：批号：981 效价：9000 单位：EU细菌内毒素工作标准品（CSE）：细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。,革兰氏阴性菌细胞壁结构,细菌内毒素化学结构(脂多糖LPS)：1.O-特异性多糖链(亲水端)2.核心多糖 3.类脂A（生理活性中心）(疏水端),细菌内毒素在水溶液中的状态：,！2000版和2005版中国药典在“细菌内毒素”检查法中

2、都注明：细菌内毒素溶液要混旋15min和30s。,革兰氏阴性菌、某些球菌、病毒、螺旋体、立克次体、支原体,内毒素,单核巨噬细胞、多形核白细胞,产生,特异性与非特异性结合,肿瘤坏死因子白介素-1白介素-6白介素-8等细胞因子,单核巨噬细胞,瀑布样反应,前列腺素血小板激活因子一氧化氮等炎症介质,全身炎性反应综合征 脓毒症 脓毒性休克 多器官功能衰竭 死亡,内毒素致病机理：,二.鲎试剂（TAL）,鲎试剂定义(部颁标准):鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品.,细菌内毒素和鲎试剂生化反应原理：,细菌内毒素（脂多糖LPS）1,3-(d,)-葡聚糖 C因子 C+B因子 B+G+G 凝固酶原

3、凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶）,三.细菌内毒素检查用水 1.药典规定：凝胶法：0.015Eu/ml 定量法：0.005Eu/ml 2.注意:要使用和鲎试剂同一厂家的检查用水,第二部分 细菌内毒素定量检查法标准操作规范,一.标准曲线制作二.样品检测 1.干扰预实验(回收率实验)2.日常检测,一.标准曲线制作,1.溶解细菌内毒素工作标准品2.稀释细菌内毒素工作标准品3.溶解、分装鲎试剂 4.加样5.生成标准曲线,1.溶解细菌内毒素工作标准品 取效价为100EU的内毒素工作标准品1支（工作标准品为中国药品生物制品检定所研制、标定、分发），开启，加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，然后用封口膜封闭

4、瓶口，在混旋器上混合15分钟，混旋后得到100EU/ml的内毒素工作标准品溶液。,2.稀释细菌内毒素工作标准品 等比例稀释内毒素标准品浓度溶液，每一步稀释前要充分振荡30秒后再进行下一步稀释。例：把浓度为100EU/ml的工作品稀释为10，1，0.1，0.01EU/ml四个浓度，可按下图稀释：100EU/ml 10EU/ml 1EU/ml 0.1EU/ml 0.01EU/ml,3.溶解、分装鲎试剂 取2支鲎试剂（装量为0.6ml），分别加入0.6ml细菌内毒素检查用水，静置，待其充分溶解后，将它们混合在一支内混匀、待用。取10支仪器定量专用小试管，按2支1组放于试管架上，分别加入0.1ml鲎试

5、剂（注意不要产生气泡）。,4.加样 取稀释好的四个内毒素溶液10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml、0.01EU/ml0.2ml分别加入含有鲎试剂的小试管中，每个点2个平行管，注意加样前应混旋内毒素溶液30秒，且每个溶液应更换加样头。取细菌内毒素检查用水0.2ml加入含有鲎试剂的小试管中，做2个平行管，作为阴性对照。每个浓度在加完样后应立即用封口膜封口，放入测定仪中，开始检测。,10Eu/ml,1Eu/ml,0.1Eu/ml,0.01Eu/ml,0.2ml,0.2ml,0.2ml,0.2ml,0.2ml,检查用水,0.1ml鲎试剂,5.生成标准曲线 到达一定时间后，用鼠标点击细菌内毒素

6、软件，则计算机对数据进行计算，自动生成标准曲线。,标准曲线的一些注解说明：1.标准曲线成立的条件:a.符合药典规定：n 3 平行管 2b.相关系数 IrI 0.98c.平行管间的变异系数要小于10%(建议值)d.阴性对照管的内毒素反应时间要大于标准曲线的最低浓度的反应时间,阴性对照管的含义：是否有外来内毒素影响标准曲线实验。1.细菌内毒素检查用水 2.实验器材 3.环境 4.操作过程,2.标准曲线更改的条件：试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时,需进行标准曲线的可靠性试验。a.鲎试剂批号改变的时候b.操作人员改变的时候c.内毒素批号改变的时候,3.标准曲线存储的条件：在相同的条件下，连

7、续3天做三条合格的标准曲线，最后拟合成一条合格的标准曲线，这条标准曲线在符合不更改的条件下，即可一直使用。相同：试剂、仪器、地点、操作者、时间,二.样品检测,1.干扰预实验(回收率实验)2.日常检测,1.干扰预实验(回收率实验)0.1ml鲎试剂+0.2ml供试品2倍稀释液0.1ml鲎试剂+0.2ml供试品2倍阳性液 供试品2倍阳性液（PPC管）：供试品2倍稀释液 含有内毒素浓度0.5Eu/ml 回收率 R=x100%(50%-200%),Ct,Cs,Cs-Ct,m,样品阳性管（PPC管）的制备-互溶法：1ml样品原液+1mlCSE溶液（1Eu/ml）2ml样品2倍稀释液（CSE溶液0.5 Eu

8、/ml）,供试品稀释倍数：2倍 4倍 8倍 16 倍 回收率 R：46%51%85%97%回收率实验目的：1.单一稀释倍数：看Et是否真实可信2.梯度稀释倍数：寻找最小不干扰稀释倍数,2.日常检测,0.1ml鲎试剂,+0.2ml供试品8倍稀释液（Et）,+0.2ml检查用水-阴性对照,1.Ct L 则供试品为不合格产品2.Ct L 则供试品为合格产品或边缘产品,回收率实验更改的条件：当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,需重新进行干扰试验。1.样品的工艺流程改变的时候2.样品的原料来源改变的时候,第三部分 细菌内毒素定量检查法原理-动态浊度

9、法,0.2mlCSE溶液10Eu/ml,0.1ml鲎试剂,OD值=-lg(It/Ie)名称：光密度含义：浊度,10Eu/ml,OD值,t,0,OD值,t,0,10Eu/ml,1Eu/ml,0.1Eu/ml,0.01Eu/ml,OD值,t,0,10Eu/ml,1Eu/ml,0.1Eu/ml,0.01Eu/ml,0.02,OD值,t,0,10Eu/ml,1Eu/ml,0.1Eu/ml,0.01Eu/ml,0.02,T1,T3,T2,T4,t,C,lgt,lgC,lg10,lg1,lg0.1,lg0.01,lgT4,lgT3,lgT2,lgT1,0,OD值,t,0,10Eu/ml,1Eu/ml,0.1Eu/ml,0.01Eu/ml,0.02,T1,T3,T2,T4,Ts,lgt,lgC,lg10,lg1,lg0.1,lg0.01,lgT4,lgT3,lgT2,lgT1,lgTs,lgCs,赵惠明谢谢大家！,