发酵工程的灭菌与除菌.ppt

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1、1,第四章灭菌与除菌,2,在当前的发酵工业中，绝大多数的发酵过程属于需氧的纯种发酵。发酵过程中需要不断通入无菌空气以满足微生物生长及合成代谢产物的需要。在整个发酵系统内存活的生物体只有需要培养的微生物，如果在发酵系统内除了需要培养的微生物以外，还有其他微生物存活，这种现象称为染菌。染菌会给发酵带来很多负面影响，轻则影响产物的产量，或使产物的提取变得困难，造成产品质量下降或收率降低，重则导致产物全部损失，所以染菌是工业发酵的“大敌”。发酵使用的培养基、发酵设备、空气过滤器、附属设备、管路、阀门以及通入罐内的空气，在使用前均需彻底灭菌或除菌，这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。,3,本章主要

2、内容,第一节 染菌的危害第二节 灭菌和除菌的基本原理第三节 培养基和发酵设备的灭菌第四节 空气除菌,4,第一节 染菌的危害,问题来了杂菌污染会产生哪些不良后果？为防止杂菌污染应采取哪些措施？,5,在工业发酵中，发生杂菌污染会产生以下不良后果：营养物质和产物会被杂菌消耗而损失；杂菌产生的毒性物质和某些酶类会抑制生产菌株的生长；杂菌的代谢产物改变发酵液的某些理化性质(如溶解氧、黏度、pH)，抑制产物的生物合成；污染的杂菌和产生的某些酶类会分解或破坏已经合成的产物；使产物提取变得困难，造成产率降低或使产品外观及内在质量下降；发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败。,6,因此防止染菌是任何发酵的

3、一项重要工作内容，必须牢固树立无菌观念，特别强调无菌操作：发酵设备、空气过滤器、附属设备、管路、阀门应严格密闭，整个系统要维持高于环境的压力，使用前应经过彻底灭菌；培养基和培养过程中加入的物料应经过彻底灭菌；通入罐内的空气应经彻底除菌处理；使用无污染的种子等。这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。,7,第二节 灭菌和除菌的基本原理,有问题吗？词解：灭菌：消毒：防腐：化疗：致死温度：致死时间：热阻：相对热阻：消毒与灭菌的概念及区别?,8,工业生产中常用的灭菌方法有哪些？原理？应用范围？优缺点？湿热灭菌原理？灭菌彻底与否以何为标准？如何计算灭菌时间？对数残留定律的意义有哪些？k值的意义？如何确

4、定灭菌温度？阿累尼乌斯方程式的意义？高温短时灭菌方法的意义？为什么干热灭菌与湿热灭菌相比温度高？时间长？,9,一、常用灭菌方法,第一节 灭菌和除菌的基本原理,10,第一节 灭菌和除菌的基本原理,灭菌：是利用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程。消毒：是采用较温和的理化方法，仅杀死对人体有害的病原微生物的过程。消毒只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢或孢子。除菌：是指用过滤方法除去空气或液体中所有的微生物及其孢子。,11,第一节 灭菌和除菌的基本原理,防腐：就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。如：低温，缺氧，干燥，高

5、渗，高酸度，防腐剂。化疗即化学治疗：是利用具有高度选择毒力（即对病原微生物具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。,12,第一节 灭菌和除菌的基本原理,发酵工业生产中常用的灭菌方法：化学物质灭菌、热灭菌辐射灭菌过滤介质除菌臭氧（O3）灭菌,干热灭菌湿热灭菌,13,高温灭菌,干热灭菌法,火焰灼烧法热空气灭菌法,湿热灭菌法,常压灭菌,高压灭菌,巴氏消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法,第一节 灭菌和除菌的基本原理,高压12115min；低

6、压10530min。,低温长时间(LTLT,6265,30分钟)，现在殆不存在，高温短时间(HTST,7275,15秒)，能杀灭牛乳中之所有病原菌，在欧美主要被使用。超高温加热瞬时法(UHT法，120150、14秒)，而成为今日牛乳杀菌法的主流，此有牛乳中乳清蛋白增进变性之虞。,14,二、高温湿热灭菌1.高温湿热火菌是利用饱和蒸汽直接接触需要灭菌的物品以杀死微生物。原理：蒸汽具有强大的穿透力，冷凝时释放大量潜热，使微生物细胞中的原生质胶体和酶蛋白变性凝固，核酸分子的氢键破坏，酶失去活性，于是微生物因代谢发生障碍而在短时间内死亡。湿热灭菌法是目前最常用的基本灭菌方法，一般的湿热灭菌条件为121(

7、表压约0.1MPa)，维持2030min。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,15,湿热灭菌优点：蒸汽来源方便，操作简单，价格低廉，本身无毒；蒸汽有强的穿透力(能杀死耐热的芽孢杆菌)和很大的潜热，灭菌效果可靠；因此被广泛用于工业生产。注意：将饱和蒸汽通入培养基中灭菌时，冷凝水会使培养基的浓度下降，所以在配制培养基时应扣除冷凝水的体积，以保证培养基在灭菌后保持应有的浓度。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,16,2.几个概念各种微生物都有一定的最适生长温度范围，如嗜冷微生物的最适生长温度为510，常温微生物的最适生长温度为2537，嗜热微生物的最适生长温度为5060，甚至更高。,第一节 灭菌和除菌的基本

8、原理,表几种杂菌适应温度范围,17,当微生物处于其最适生长温度的下限时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最适生长温度的上限时，细胞中的蛋白质会发生不可逆的凝固变性，在很短时间内引起死亡。热灭菌即是利用微生物的这一特性进行的。能够杀死微生物的温度称为致死温度。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,几种杂菌致死温度范围,18,致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。对于同种微生物，在致死温度范围，温度愈高，致死时间就愈短。同种微生物的营养体、芽孢和胞子的结构不同，对热的抵抗力也不同，致死温度和致死时间也有很大的差别。不同的微生物的致死温度和致死时间也有差别。一般无芽孢的营

9、养菌体在60保温l0min即可全部被杀死，而芽孢在100%下保温数十分钟乃至数小时才能被杀死，某些嗜热细菌在121下可耐受20-30min。,19,微生物对热的抵抗力常用“热阻”表示。热阻：指微生物在某一种特定条件下（主要指温度和加热方式）的致死时间。一般来说，灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻大的芽孢杆菌为指标。相对热阻：是指某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。,20,某些微生物的相对热阻及对一些灭菌剂的相对抵抗力(与大肠杆菌相比较),第一节 灭菌和除菌的基本原理,21,2、灭菌时间的选择在灭菌过程中，微生物由于受到不利环境条件的作用而逐渐死亡，其死亡的速率(

10、dN/dt)与瞬间残留的微生物数目(N)成正比，服从一级反应动力学，可以用数学表达式：其中 N：时间t时培养基中残存的活菌数(个)；t：灭菌时间(s或min)；k：灭菌速度常数，或称菌死亡速度常数(1/s或1/min)，与灭菌温度、菌种特性有关；dN/dt：活菌的瞬时变化速率，即死亡速率(个/s或个/min)。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,22,开始灭菌时，即t=0时，培养基中活菌数为N0。积分上式得：,第一节 灭菌和除菌的基本原理,=-,t,t,NO-灭菌开始时原有的活菌数(个)Nt-灭菌结束后残留的活菌数(个),可以由实验测出,此式表明：活菌残留率的对数与灭菌时间呈线性关系，这就是对数残

11、留定律”。,23,对数残留定律 的意义：热灭菌时间(t)取决于污染程度(N0)、灭菌程度(残留菌数Nt)以及热致死速率常数k值。因此配制培养基所用原料要含杂菌少，培养基配制后要尽快灭菌，以减少杂菌的生长。灭菌程度的确定：在对数残留方程式中，如果要达到绝对彻底地灭菌，即Nt=0，所需灭菌时间t为，这实际上是不可行的。因此在生产设计上常采用Nt=0.001 为达到灭菌要求，即，在1000批次灭菌中只允许有1批失败；N0可以参考一般培养基中的活菌数，取为1107 2107个/mL。由此得到的是理论灭菌时间，实际设计和操作时可适当延长或缩灭菌时间。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,24,例：有一发酵罐内

12、装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为2105/ml个耐热细菌芽孢，121时灭菌速度常数为0.03s1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。,解：N0=40106 2105=8 1012(个)Nt=0.001;K=1.8(min1),25,如以活菌残留率的对数 与灭菌时间t的实测值作图，得出的残留曲线在一定的时间范围内为直线，其斜率为-k/2.303，k值随菌株及灭菌温度而异。若温度升高，残留曲线会变陡，也就是k值增加，表明微生物灭菌时容易死亡。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,(log Nt/No),灭菌时间t(min),活菌残留率的对数,大肠杆菌在不同温度下的残留

13、曲线,26,某嗜热芽胞杆菌在104 和131 时的残存曲线,27,k值是微生物耐热性的特征，与微生物的种类和灭菌温度有关。灭菌速度常数k是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。在相同的灭菌条件下，各种微生物的k值是不同的，k值愈小，表明这种微生物的热阻愈大，越耐热。细菌营养体、酵母菌、放线菌、病毒及噬菌体对热的抵抗力较弱，如121 时，k=101010/min。而细菌芽孢、霉菌孢子对热的抵抗力较强。如121 时，k=1/min左右，,28,在121，悬浮于缓冲液中的几种细菌芽孢的k值,29,三、干热灭菌是指在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，使微生物的致死率迅

14、速增高的过程。常用灭菌条件：160下保温12 h。适用范围：需要保持干燥的器械和容器的灭菌，如培养皿、接种针、吸管等玻璃、陶瓷、金属可以耐高温的物品。灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,30,四、辐射灭菌辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。射线、X射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。X射线、射线，波长0.11.4，含有极高的能量，使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，产生自由基，进一步与氧作用，产生一些具强氧化性的过氧化物，如HO2、H2O

15、2，使细胞内某些蛋白质和酶发生变化，阻碍微生物的代谢活动而导致菌体损伤或迅速死亡。X射线的穿透力极强，但不经济，并且向四面八方辐射，不适于发酵生产使用。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,31,紫外线波长为21003100的紫外线有灭菌作用，最常用的波长2537的紫外线。主要是与菌体核酸发生光化学反应而造成菌体死亡。紫外线对微生物菌体和芽胞均有杀灭作用，有高度致死效果。但紫外线的穿透力很低，仅适用于表面和局部空间灭菌，如台面、洁净室、更衣室等。现在，紫外线常与HVAC相结合用于气相循环消毒。HVAC是Heating,Ventilation and Air Conditioning 的英文缩写，就是

16、空气调节系统，是包含温度、湿度、空气清净度以及空气循环的控制系统。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,32,五、化学物质灭菌原理：某些化学药剂能与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜透性而具有杀菌或消毒的作用。常用的化学药剂：甲醛、氯(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、苯酚、季氨盐(如新洁尔灭)、氯化汞等。适用情况：因培养基里含有蛋白质等营养物质亦易与上述化学物质发生化学反应，同时药物加入培养基之后很难除掉。适合于局部空间或某些器具的消毒，但不适合用于培养基的灭菌。使用方法：根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,

17、33,六、静电除菌静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。原理是，悬浮于空气中的微生物，其孢子大多数带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高压(1000V/cm2)静电场时都会被电离成带电颗粒，受静电场库仑力的作用，向极板移动，吸附在极板上，得到净化的气体排出除尘器外。,34,空气进,空气出,钢丝电晕电极,钢管沉淀电极,+,+,35,优点：阻力小，约0.01MPa；除水、除油的效果好 耗电少，每处理1000m3的空气每小时仅耗电0.20.8KW。缺点：静电除菌效果不是很高，一般在8599%之间；当捕集的微粒积聚到一定厚度时，极板电压下降，微粒的吸附力减弱甚至随气流飞散，这时除菌

18、效率很快下降。一般当电极板上尘厚1mm时，就应该用喷水管自动喷水清洗，洗净干燥后重新投入使用。对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘灭菌对很小的微粒效率较低。设备庞大、一次性投资较高。,由于除菌效率不高，往往需要与高效空气过滤器联合用于洁净工作室空气除菌；或用于洁净工作台。,36,七、臭氧（O3）灭菌臭氧是一种强氧化剂，灭菌过程属生物化学氧化反应。原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气（O2）和单个氧原子（O）；后者具有极强的氧化作用，能氧化分解细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏

19、其细胞膜，将它杀死；直接与细菌、病毒作用，破坏它们的细胞器和DNA、RNA，使细菌的新陈代谢受阻，导致细菌死亡；作用于细胞外膜的脂蛋白和内部的脂多糖，使细菌发生通透性畸变而溶解死亡。,37,我国在GMP验证过程中人们大力推荐臭氧灭菌方法。臭氧灭菌有许多特点：O3为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角，浓度分布均匀。臭氧灭菌为溶菌级方法，杀菌彻底。杀菌能力与过氧乙酸相当，高于其它消毒剂。杀菌广谱，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等，并可破坏肉毒杆菌毒素。另外，O3对霉菌也有极强的杀灭作用。臭氧制备是利用我们周围的大气制取(现有成型产品：臭氧发生器），现制现用，不需储藏设施，节省原料储储所

20、需的占地面积。,38,臭氧分解形成的单个氧原子（O）则会自行重新结合成为普通氧分子（O2），不存在任何有毒残留物，没有二次污染，故称无污染消毒剂(绿色消毒剂)。臭氧灭菌在药品生产中具有广泛的用途。对管道容器的灭菌；与HVAC相结合，利用中央空调净化系统对洁净区的灭菌；对原辅助材料和工作器具的灭菌；对密闭空间的灭菌；对药厂用水的灭菌处理。,39,八、介质过滤除菌要去除液体或气体中的微生物以达到无菌要求，可以使用适当的材料进行过滤，这种方法只能用于澄清流体的除菌。工业上主要用于热敏性物质(氨水、丙醇等)和空气的除菌。按过滤除菌机制不同而分为两者原理是不同的，绝对过滤介质间的空隙小于颗粒直径，是靠表

21、面拦截作用除去菌体；而深层过滤介质间的空隙远大于颗粒直径。是靠微生物微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、扩散、重力沉降及静电吸附等作用，将其中的尘埃和微生物截留、捕集在介质层内，达到过滤除菌体目的。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,绝对过滤深层过滤,40,1、绝对过滤绝对过滤最常用的过滤材料是微孔滤膜。选择孔径为0.2m或0.45m的滤膜就可达到除菌的目的。对动物细胞血清培养基选用0 1m孔径的滤膜来除去支原体的污染。滤膜材料可以是醋酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚丙烯等。绝对过滤易于控制过滤后空气质量，节约能量和时间，操作简便。由于绝对过滤介质的拦截负荷大，所以滤膜的使用寿命短、处理量小，对预处理的

22、要求高。在空气过滤之前应设预过滤器将空气中的油、水除去，以提高微孔滤膜的过滤效率和使用寿命。,41,2、深层过滤（介质过滤）空气中的微生物大多数是细菌和芽孢，还有一定数量的霉菌、酵母和病毒。细菌的大小为零点几微米至几微米，这些微生物在空气中极少单独游离存在，基本都是附着在灰尘、液滴等微粒的表面上。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,微生物 细胞(m)宽*长 孢子(m)宽*长金黄色小球菌 0.511.0产气杆菌 1.01.5 1.02.5蜡样芽孢杆菌 1.32.0 8.125.8普通变形杆菌 0.51.0 1.03.0巨大芽孢杆菌 0.92.1 2.010.0 0.61.2 0.91.7霉状分枝杆菌

23、 0.61.6 1.613.6 0.81.2 0.81.8枯草杆菌 0.51.1 1.64.8 0.51.0 0.91.8酵母菌 35 519 2.53.0病毒 0.00150.225 0.00150.28,42,43,介质过滤除菌就是把空气中的各种微粒和游离微生物捕集起来，从空气中除掉。为适用于大量的空气净化处理，可用较大孔隙的纤维介质等滤材组成深层过滤层，来去除极微小的悬浮微生物。采用空气过滤器制备大量的无菌空气，滤材要求能耐受高温高压，不易被油水污染，除菌效率高，阻力小，成本低，易更换。常用的滤材介质有棉花、棒状活性炭、石棉板、超细玻璃纤维纸、烧结玻璃、粉末烧结金属、硝酸纤维酯类物质、多

24、孔陶瓷、聚四氟乙烯薄膜、聚砜、尼龙膜等。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,44,介质过滤除菌的原理与绝对过滤除菌的原理是不同的，介质过滤介质间的空隙往往远大于颗粒直径。如棉花纤维直径一般为1620m，充填系数(空气过滤器内过滤介质的体积占过滤器总体积的百分率)为8%时，棉花纤维间形成的空隙为2050m。球菌的直径一般在0.52m，杆菌一般长1-5m，宽0.5lm。带微粒的空气流过纤维滤层时，悬浮于空气中的微生物菌体何以能被过滤除去呢？,45,当气流为层流时，气体中的微粒随空气做平行运动，接近纤维表面的微粒(指在流动空气宽度b内的微粒)被纤维捕获，而宽度大于b的气流中的微粒绕过纤维继续前进。因为过

25、滤介质层是由无数的纤维纵横交错组成的，形成的网格阻碍气流前进，使气流无数次地改变运动速度和运动方向，这些改变引起空气中微粒的惯性冲击、拦截、扩散、重力沉降和静电吸附等作用，于是大大增加了微粒被纤维捕获的几率。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,46,（1）惯性冲击截留作用：撞上去被吸附；灰尘微粒有一定的质量，因而在运动时有一定的惯性。当灰尘微粒随气流前进遇到过滤介质时，气流突然改变流向，而微粒由于惯性力的作用仍然沿直线向前运动，与纤维碰撞而被吸附于纤维的表面上，此微粒就被捕集。这种惯性冲击作用的程度取决于微粒的动能、纤维阻力、气流速度。惯性冲击作用的强弱与气流流速成正比，空气流速大时，惯性冲击就起

26、主导作用。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,47,(2)拦截截留作用：速度太慢动能不足被吸附；当气流速度较低时，微粒的运动轨迹与空气流线相似。气流改变力向时，微粒的流向随之改变，与纤维表面接触时就被捕集，这种作用叫拦截。微生物微粒直径很小，质量很轻，当随低速气流流动靠近纤维时，微粒所在的主导气流流线受纤维阻碍而改变力向，绕过纤维前进，并在纤维的周边形成一层边界滞留区。滞留区的气流速度更慢，进入滞留区的微粒慢慢靠近纤维并接触纤维而被黏附捕集。微粒被捕集的位置为90o，空气流速较小时，拦截才起作用。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,90o,48,(3)布朗扩散截留作用：不规则运动增强了接触机会；直径很

27、小(1m)的微粒在很慢的气流中能产生不规则的直线运动称为布朗运动。结果使较小的微粒聚集成为较大的微粒，增加了与纤维接触的机会，当与纤维接触时就被捕集，这种作用叫做扩散。布朗扩散的运动距离很短，在较大的气速、较大的纤维间隙中是不起作用的，但在很慢的气流速度和较小的纤维间隙中布朗扩散作用大大增加微粒与纤维的接触滞留机会。由于布朗扩散截留作用的存在，大大增加了纤维的截留效率。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,49,(4)重力沉降作用：对大颗粒有效；空气中的灰尘微粒所受的重力大于气流对它的支持力时，微粒就会沉降。直径50m以上的颗粒沉降作用比较显著，小颗粒只有在气流速度很慢时才有沉降作用。一般重力沉降是

28、与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦截的捕集效率。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,50,(5)静电吸引作用：异性相吸。空气在非导体物质中间进行相对运动时，由于摩擦会产生诱导电荷，特别是纤维更为显著。悬浮在空气中的微生物颗粒大多带有不同的电荷。有人曾测定，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌约有75%的孢子带负电荷，15%的孢子带正电荷，其余10%的孢子是电中性的。带电荷的微生物通过过滤介质层时，可被具有相反电荷的纤维介质吸引，而被吸附捕集；也可能是纤维介质被流动的带电荷的粒子所感应，产生相反的电荷而将粒子吸引。此外表面吸附也归属于这个范畴，如活性炭的大部分过滤作用是表面吸附的

29、作用。,第一节 灭菌和除菌的基本原理,51,在过滤除菌中，有时很难分辨上述各种机理各自所做出贡献的大小，多是五种作用的综合结果。随着参数的变化，各种作用之间有着复杂的关系，目前还未能作准确的理论计算。一般认为惯性冲击、拦截和布朗扩散运动的作用较大，而重力沉降作用和静电吸引的作用则很小。上图是纤维过滤除菌总效率与气流速度Vs的关系。过滤效率就是滤层所滤去的微粒数与原有微粒数的比值，它是衡量过滤设备过滤能力的指标。当气流速度较大时(大于0.1m/min)，以惯性冲击作用为主。当气流速度低于一定值时，以拦截作用和扩散作用为主，并可认为惯性冲击不起作用，此时的气流速度称为临界速度(Vc)。,第一节 灭

30、菌和除菌的基本原理,Vc,52,临界速度与纤维直径df、微粒直径dp以及气体的物理性质有关。空气温度20，微粒重度p=1.0g/cm3时，通过不同直径的纤维过滤层的空气的临界速度(Vc)见右图,第一节 灭菌和除菌的基本原理,53,第一节 灭菌和除菌的基本原理,空气过滤后的微粒数与过滤前的微粒数的比值称为穿透率P，则 P=式中N0过滤前空气中的微粒含量(个)；Nt过滤后空气中的微粒含量(个)。介质过滤效率是指被捕集的微粒数与空气中原有的微粒数的比值，是衡量过滤设备过滤能力的指标。=1-=1-P,Nt N0,N0-Nt N0,Nt N0,54,第一节 灭菌和除菌的基本原理,空气过滤器的过滤效率与微

31、粒的大小、过滤介质的种类和纤维直径、介质的填充密度、介质层的厚度以及空气通过介质层的气流速度等因素有关。1）纤维直径：在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高。2）介质的填充厚度与密度：对于相同的介质，填充厚度和密度越大则过滤效率越高，但同时流速也越小。3）空气流速：在空气流速很低时，过滤效率随气流速度增加而降低；当气流速度增加到临界值后，过滤效率随气流速度增加而提高；气流速度高达一定值后，过滤效率再降低，所以要通过实验方法来摸索最适流速。,55,第一节 灭菌和除菌的基本原理,空气在一定的条件下，通过单位高度介质层后，杂菌数目的减少量与进入此介质层的杂菌数量成正比，即：-=K N式中N

32、进入介质层的菌的数目(个)；L介质层厚度(m)；K过滤常数或除菌常数(1/m)；dN/dL单位高度过滤介质层所除去的菌的数目(个/米)。,dNdL,56,第一节 灭菌和除菌的基本原理,将上式移项积分，得：=-L=ln上式称为“对数穿透定律”，表示进入过滤介质滤层的菌数与穿透过滤介质滤层的菌数之比的对数与滤层厚度成正比。如果要将杂菌完全除尽，即NL=0，滤层厚度需要无穷大，事实上是不可能的。,1K,N0 Nt,57,第一节 灭菌和除菌的基本原理,这说明介质过滤不可能长期拥有100%的除菌效率，在分批发酵过程中，介质过滤除菌的实质是通过介质的作用，大大延长了空气中的微生物在过滤介质中的停留时间，在

33、整个发酵周期内阻止空气中的杂菌进入发酵罐导致染菌。当气流速度达到一定值或过滤介质使用时间太长，介质中滞留的杂菌微粒就有可能穿过，所以过滤器必须定期灭菌。,58,培养基的灭菌1.分批灭菌2.连续灭菌发酵罐的灭菌1.空消2.实消物料管路的灭菌倒种管路的灭菌补料液的灭菌消沫剂的灭菌,第二节 培养基和发酵设备的灭菌,湿热灭菌效果好，具有经济、快速的特点，广泛用于工业生产，适用于培养基、发酵罐、附属设备(油罐、糖罐等)、管道以及其他耐高温物品的灭菌。,59,问题怎么这么多？,连消与实消各有何优缺点？影响培养基灭菌因素有哪些？如何计算培养基灭菌时间？怎样做到既要灭菌目的又要保护培养基营养成分最少破坏？实消

34、的过程要点和控制参数？连消的过程要点和设备组成？,60,一、温度和时间对培养基灭菌的影响 用湿热灭菌方法对培养基灭菌，在杀灭微生物的同时，也会对营养成分造成破坏。在高压加热的条件下，会使糖液焦化变色、维生素失活、醛糖与氨基化合物反应、不饱和醛聚合、一些化合物水解等。,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死亡程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响,61,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,62,因此，选择既能达到灭菌要求又能减少营养成分破坏的灭菌温度和时间，是提高培养基灭菌质量的重要内容。将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数Nt(10-3)，需要多高

35、的温度、多长的时间为合理。灭菌温度和时间的确定取决于：（1）杂菌孢子的热灭死动力学；（2）反应器的形式和操作方式；（3）培养基中有效成分受热破坏的可接受范围。,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,63,首先，培养基的绝大部分营养成分的破坏属于一级分解反应，其反应动力学方程式为：式中：C-反应物浓度(mol/L)；t-分解反应时间(s)；k-分解反应速度常数，与温度和反应物种类有关(1/s)化学反应中，在其他条件不变的情况下，分解反应速度常数k与温度T的关系用阿累尼乌斯方程式表示：式中：A-分解反应的阿累尼乌斯常数(1/s)R-气体常数8.314J/(mol K)；T-热力学绝对温度(K)；E-分

36、解反应所需的活化能(J/mol)；,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,64,热灭菌致菌体死亡也是一级动力学反应，热致死速度常数与温度的关系也可用阿累尼乌斯方程式表示：式中A-灭菌反应的阿累尼乌斯常数(1/s)E-灭菌反应所需的活化能(J/mol)；前两式取对数，则得：,营养成分的破坏方程式,菌体死亡方程式,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,k,k,65,阿累尼乌斯方程式的意义：反应了反应速度常数k 和热致死速度常数k与灭菌温度T的关系。以lnk(lnk)对1/T作图，可得一直线，如图，由此直线的斜率和截距可 分别求得E(E)和A(A)值。一般E杀死微生物营养体=200270kJ/mol E杀死

37、微生物芽孢 400kJ/mol E酶或维生素分解 80kJ/mol,孢子死亡和营养成分降解中活化能影响,k,k,66,部分微生物的致死活化能E和营养成分破坏的活化能E,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,E,E,67,为灭菌温度和灭菌时间的选择提供依据和指导 由，加热灭菌时，灭菌温度发生变化，热致死速度常数 k 值和培养基成分分解反应速度常数 k 值都会变化情况，当温度由T1升至T2时，则：k1k2and k1k2阿累尼乌斯方程经推导得出下式：,E：菌体死亡所需活化能E：营养成分破坏所需活化能,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,k1,k2,k,k,68,由于杀死微生物的E营养成分破坏的E，因此，

38、即随温度上升，灭菌反应速度常数的增加倍数大于培养基营养成分破坏速度常数的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升，微生物死亡速率大于培养基成分破坏速率。,E：菌体死亡所需活化能E：营养成分破坏所需活化能,k1,k2,k,k,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,69,温度升高对反应速度常数的影响用Q10来表示，Q10为温度升高10时的反应速度常数与原温度时的反应速度常数的比值。一般 化学反应的Q10为1.52.0，杀灭微生物营养体反应的Q10为510，杀死细菌芽孢的反应的Q10为35左右。在灭菌过程中，当温度升高时，两种反应过程的速度都在增加，但微生物死亡的速度增加值超过培养基营养成分破坏的速度增加值。采

39、用高温快速灭菌方法，既可杀死培养基中的全部有生命的有机体，又可减少营养成分的破坏。,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,70,下表列出的是达到完全灭菌(以杀灭细菌芽孢为准)的灭菌温度、时间和营养成分维生素B1破坏量的比较，可以清楚地说明这一问题。,一、温度和时间对培养基灭菌的影响,71,二、影响培养基灭菌的其它因素,1、培养基成分培养基中的油脂、糖类和蛋白质增加微生物的耐热性，使微生物的热致死速率变慢，这主要是因为有机物质会在微生物细胞外形成一层薄膜，阻碍热的传入，因此应提高灭菌温度或延长灭菌时间。相反培养基中高浓度的盐类(如8%以上NaCl溶液)、色素会减弱微生物细胞的耐热性，一般较易灭菌。在

40、固形物含量高的情况下，灭菌温度要高些。培养基成分对大肠杆菌灭菌影响,72,二、影响培养基灭菌的其它因素,2、培养基的pH值pH对微生物的耐热性影响很大。在pH6.08.0范围内微生物最耐热，pH6.0时，氢离子极易渗入细胞内，从而改变细胞的生理反应促进其死亡，故pH愈低，灭菌所需的时间愈短。一般微生物生长对培养基的pH都有一定的要求，在不允许调节pH的情况下，就要考虑适当延长灭菌时间或提高灭菌温度。温度 孢子数 灭菌时间(min)()(个/ml)pH=6.1 5.3 5.0 4.7 4.5120 10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 16 13 13110 10000

41、 70 65 35 30 24100 10000 740 720 180 150 150,73,二、影响培养基灭菌的其它因素,3、培养基的物理状态培养基的物理状态对灭菌有极大的影响。固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长，如果100时液体培养基的灭菌时间为1h，同体培养基则需要23h才能达到同样的灭菌效果。其原因在于液体培养基灭菌时，热量传递是由传导作用和对流作用完成的，而固体培养基只有传导作用而没有对流作用。此外，液体培养基中水的传热系数要比固体有机物质大得多。越浓稠的培养基灭菌所需时间越长。,74,二、影响培养基灭菌的其它因素,4、泡沫泡沫中的空气会形成隔热层，使传热困难，对灭菌极

42、为不利。对易产生泡沫的培养基进行灭菌时，可加入少量消泡剂。5、培养基中的微生物性质与数量不同成分的培养基中含菌性质与量是不同的。培养基中微生物数量越多，达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中的含菌量远比化工原料的含菌量多，因此灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌和霉菌孢子多的培养基，要适当提高灭菌温度或延长灭菌时间。,75,二、影响培养基灭菌的其它因素,6、冷空气排除情况高压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件，而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出。因为冷空气导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品。降低蒸汽分压使之不能达到应有的温度，如果灭菌器内冷空气排

43、除不彻底，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽的压力，还有空气的分压，罐内的实际温度低于压力表所对应的温度，造成灭菌温度不够，检验灭菌器内空气排除度，可采用多种方法，最好的办法是发酵罐同时装有压力表和温度计。空气排除程度与温度的关系蒸汽压力 罐内实际温度/Mpa 未排除空气 排除1/3 排除1/2 排除2/3 完全排除空气 0.03 72 90 94 100 109 0.07 90 l00 105 109 115 0.1 l00 109 112 115 121 1.3 109 115 118 121 126 1.5 115 121 124 126 130,76,工业生产中对于大量的培养基和发酵设

44、备的灭菌，最有效、最常用的方法是蒸汽灭菌(即湿热灭菌)。培养基的灭菌包括分批灭菌：将配制好的培养基输入发酵罐内，经过间接蒸汽预热，然后直接通入饱和蒸汽加热，使培养基和设备一起灭菌，达到要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。全程包括加热、维持、冷却三个过程。,三、培养基分批灭菌,分批灭菌连续灭菌,77,78,进行实罐灭菌前，通常先把空气分过滤器灭菌并用空气吹干。将配制好的培养基送至罐内，开动搅拌以防料液沉淀。加热：包括预热和升温。预热：培养基在搅拌状态下，排放夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，在夹套或蛇管内缓慢通入蒸汽以预热料液，当发酵罐的温

45、度预热至8090，关闭夹套或蛇管蒸汽阀门。作用：使物料糊化、溶胀并均匀受热；减少冷凝水的生成；减轻蒸汽流冲击发酵液产生的噪音。如果一开始不预热就直接导入蒸汽，由于培养基与蒸汽的温差过大，会产生大量的冷凝水，使培养基稀释；直接导人蒸汽还容易造成泡沫急剧上升，使物料外溢。,三、培养基分批灭菌,79,升温：培养基加热至90，关闭夹套或蛇管蒸汽阀门后，由空气进口取样管放料管通入蒸汽对培养基直接加热。开启排气管阀进料管(补料管)接种管排气阀消泡剂管排气。,三路进汽,四路出汽,80,保温：当发酵罐内温度升至110左右，控制进出蒸汽阀门直至温度达121、压力为0.1MPa时，开始保温。生产中习惯采用的保温时

46、间为30min。在保温阶段，凡开口在培养基液面以下各管道都应通蒸汽，开口在培养基液面以上的各管道则应排蒸汽，与罐相连通的管道均应遵循蒸汽“不进则出”的原则，才能保证灭菌彻底，不留死角；各路蒸汽进入要均匀畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要激烈；各路排气也要畅通，但排气量不宜过大，以节约蒸汽；维持压力、温度恒定直到保温结束。,81,冷却降温：为了减少营养成分的破坏，多采用快速冷却方式。保温到时间后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内压力降至0.05 MPa左右(注意罐压必须低于空气过滤器压力)时，迅速向罐内通入无菌空气，以维持发酵罐降温过程中的正压；开启冷却系统，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基快速降

47、至所需温度。,82,实罐灭菌主要是在保温阶段起作用，在升温阶段后期也有一定的灭菌作用。灭菌时，蒸汽总管道压力要求不低于0.3MPa，使用压力(通入罐中的蒸汽压力)不低于0.2MPa。培养基分批灭菌时，发酵罐容积越大，加热和冷却时间就越长。这两段时间实际上也有一定的灭菌作用，所以分批灭菌的总时间为加热、维持和冷却所需要的时间之和。如果知道加热和冷却所需要的时间，合理设计维持时间，能够减少灭菌过程中培养基营养成分的破坏。,加热,冷却,维持,三、培养基分批灭菌,83,优点：设备要求低，不需要附加专门的加热和冷却设备，投资少；操作简便，灭菌效果可靠；对蒸汽的要求较低，一般0.2-0.3 MPa即可满足

48、要求。,缺点加热和冷却时间较长，营养成分有一定的损失；罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺；在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大；冷却水用量大。,培养基分批灭菌的优、缺点：,84,培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内，这种工艺过程称为连续灭菌。培养基连续灭菌前，发酵罐应先进行空罐灭菌，以容纳经过灭菌的培养基。连续灭菌设备加热器、维持罐和冷却器也应先行灭菌，然后才能进行培养基连续灭菌。连续灭菌工艺的优点是：可采用高温快速灭菌方法，营养成分破坏少；组成培养基的耐热性物料和不耐热性物料可分开在不同温度下灭菌，以减少物料的破坏；,四、培养基连续灭菌,85,

49、也可将糖和氮源分开灭菌，以免醛基与氨基发生反应，防止有害物质生成；发酵罐非生产占用时间短，容积利用率高；热能利用合理，适合自动化控制；蒸汽用量平稳。缺点是：蒸汽压力一般要求高于0.5MPa；不适用于黏度大或固形物含量高的培养基的灭菌；需增加一套连续灭菌设备，投资较大；增多了操作环节，增加了染菌的几率。,四、培养基连续灭菌,86,配料,输料,加热,保温,冷却,灭菌的发酵罐,预热,1、连续灭菌(工艺/设备)流程,连续灭菌以采用的设备和工艺条件分类，有3种形式。1.连消-喷淋冷却连续灭菌流程 2.喷射加热-真空冷却连续灭菌流程 3.板式换热器连续灭菌流程,四、培养基连续灭菌,87,第一种：连消一喷淋

50、冷却连续灭菌流程,为最基本的连消方法。培养基配制后，经预热，用连消泵送入连消塔底部，被直接蒸汽加热到126132，再由连消塔,顶部排出，进入维持罐，在110130 保温57 min，由维持罐上部侧面流出，经冷却器冷却至发酵温度，送入灭菌发酵罐,四、培养基连续灭菌,88,(1)预热目的：减少冷凝水产生和避免料液与蒸汽温度相差过大在加热器中产生水汽撞击声。设备：配料罐兼做，或用专门的预热交换器。要求：一般预热至65-75左右。其后：预热的物料用泵泵入连消装置。,四、培养基连续灭菌,89,常用输料泵：,旋涡泵,往复泵,螺杆泵,四、培养基连续灭菌,90,(2)加热目的：物料泵入加热器，培养基与高温蒸汽