《生物技术概论》课程总复习.ppt

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1、1,现代生物技术的概念 技术手段（种类）,第一章 绪 论,2,第二章 基因工程（Gene Engineering）,3,基因工程的一般流程,目的基因的获取载体的构建体外重组导入宿主细胞筛选及鉴定重组子,4,基因工程中常用的工具酶,1.限制性内切酶2.连接酶3.末端修饰酶,5,基因克隆载体的概念：,作为基因克隆载体一般应具备的条件：（1）多克隆位点（2）自我复制；或能整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA同步复制。（3）选择标记基因（4）克隆载体必须是安全的（5）载体DNA分子应尽可能小，插入片段的范围有选择性,基因工程中常用的载体,6,载体类型,严紧型质粒和松弛型质粒,

2、lacZ蓝-白斑筛选,（1）穿梭质粒载体（shuttle vector）：,（2）T克隆载体和U克隆载体,（3）Ti质粒载体,（4）柯斯质粒载体,（5）YAC BAC,7,目的基因片段的获取,1 目的基因的来源2 获得目的基因的途径2.1 限制性酶切法；2.2 PCR法；2.3 化学合成法；2.4 基因组文库或cDNA文库法；,8,模板DNA的变性：95模板DNA与引物的退火(复性)：60 引物的延伸：72,重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。电泳,PCR基本过

3、程（反应步骤）：,9,目的基因导入受体细胞,方法：,转化：通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露DNA进入受体细胞，并整合到受体染色体组，在受体内稳定维持和表达的过程。转染：如果进入受体细胞的外源DNA分子是病毒（噬菌体）的DNA,则把此过程称为转染。转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程。,10,重组子的筛选,筛选方法：（一）根据载体选择标记基因筛选,抗性筛选、蓝白斑筛选,gus 基因、荧光素酶基因luc、绿色荧光蛋白基因gfp，,（二）根据报告基因筛选转化子,（三）根据形成噬菌斑筛选转化子,11,1 根据重组DNA分子特征鉴定重组子 根据重组DNA分子大小鉴

4、定重组子、根据重组DNA分子酶切图谱鉴定、PCR法、DNA杂交、应用DNA芯片鉴定重组子、根据DNA核苷酸序列鉴定重组子,重组子的鉴定,2 根据目的基因转录产物（mRNA）鉴定重组子 Northern杂交 RT-PCR：,3 根据目的基因翻译产物（蛋白质、酶、多肽）鉴定重组子Western,12,基因工程的一般步骤(目的基因未知）,13,第三章 细胞工程,第一节 细胞工程基本知识与基本技术 第二节 植物细胞工程 第三节 动物细胞工程 第四节 微生物细胞工程,14,第二节 植物细胞工程,1.植物组织培养的基本过程：预备阶段：诱导去分化阶段：继代增殖阶段：生根发芽阶段：移栽成活阶段:,2.1 植物

5、组织培养,15,化学或物理法诱导,完全杂合、核质异源,杂合体的鉴别与筛选,酶解（纤维素酶）、分离、洗涤、鉴定,取材与除菌,2.2 植物细胞原生质体制备与融合,16,2.3 人工种子用人工种皮包被植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。,17,人工种子,解决有些植物结子困难、发芽率低、繁殖困难等问题,18,制作过程,胚乳与褐藻酸钠混合后，加入胚状体，滴入到硝酸钙或CaCl2中，2分钟后，表面聚合，形成人工种子,19,1.动物细胞、组织培养技术,生长特点：贴壁生长，接触抑制细胞株 细胞系,第三节 动物细胞工程,20,2.动物细胞融合技术,动物细胞融合的途径：病毒诱导、化学诱导、电激诱

6、导,淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术：单克隆抗体 单克隆抗体的制备过程,3.动物克隆技术,21,22,3.微生物细胞工程,细胞融合技术概括起来主要包括制备原生质体，诱导细胞融合，筛选杂合细胞,23,第四章 发酵工程,24,一、发酵工程概况：现代发酵工程的定义;发酵周期；放罐时间,二、发酵过程：发酵类型：菌体；酶；代谢产物；转化；生物工程菌,第四章 发酵工程,培养基原料 培养基配制 培养基灭菌 菌体,储备菌种 摇瓶 种子罐 生产罐 培养 细胞分离,无细胞上清液 产品抽提 产品精制 产品包装,25,三、液体深层发酵：液体深层发酵的操作方式（分批发酵；连续发酵；补料分批发酵）；各自优缺点；发酵过程主

7、要影响参数,四、发酵设备(发酵罐）：,26,第五章 酶工程,酶反应器,酶的制备技术,酶的纯化与精制,固定化酶(细胞)的优点、固定化方法,酶分子的改造技术,酶反应器基本类型、生物传感器,酶工程的概念和基本过程（酶的分类）,27,第一节 酶的发酵生产提高酶产量的措施 诱导物 阻遏物 表面活性剂 产酶促进剂,28,第二节 酶的分离纯化酶的制备技术(破碎细胞、溶剂抽提、离心分离、过滤、浓缩、干燥);纯化与精制的方法（酶分子大小、电荷性质、专一性结合特性）；第三节 酶分子的改造酶分子的修饰方法,29,第四节 酶的固定化技术固定化酶（细胞）的优点（不溶于水，便于分离；能回收、反复使用；稳定性；生产自动化；

8、但不会持续维持生产能力逐渐提高）酶固定化方法（载体结合、共价交联、包埋）细胞固定化方法（直接法，包埋法，物理吸附法）,30,酶生物合成的模式,通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。,31,蛋白质工程概念，表达体系、设计目标 蛋白质工程研究的技术和方法：蛋白质结晶学（X光衍射技术、核磁共振NMR）；蛋白质动力学（生物信息学、计算机辅助设计）；改变蛋白质结构的核心技术是人工定点突变技术（位点特异性突变技术）,第六章 蛋白质工程,32,目前蛋白质工程研究的主要领域，研究程序一般如下：,（1）分离纯化得到0.11.0mg纯目的蛋白质

9、,（2）测定其部分肽段的一级结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针,（3）利用该探针从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因,33,（4）通过表达载体获得较大量(0.11.0克)该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案,（5）基因进行定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化大量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子,34,蛋白质组学（Proteomics）,“Proteome”最终概念是指：一个基因组，一种生物或一种细胞或组织所表达的全套蛋白质。蛋白质组学（Proteomics)：以蛋白质组为研究对象，研究细胞

10、内所有蛋白质及其动态变化规律的一门科学领域。功能蛋白质组（Functional Proteome)：指在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。功能蛋白质组学（Functional Proteomics）：研究细胞内与某种功能有关或在某种条件下的一群蛋白质。,35,双向电泳技术,第一向等电聚焦（IEF）电泳：利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质的电泳方法。用缓冲液水化 第二向SDS-PAGE：SDS，巯基乙醇，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，样品中的蛋白质成分按照蛋白质分子量的大小加以分离。通过染色，进行蛋白质计算机软件分析。,36,第七章 生物技术的应用领域,7.1 生物技术与人类健康（人生长激素释放抑制剂激素、基因治疗）7.2 生物技术与环境（生物修复）7.3生物技术与能源生物技术在上述各领域的应用或对人类社会的影响,