酶工程基本原理.ppt
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1、酶工程,CH 1 绪 论,CH 1.1 酶的基本概念 1 酶是蛋白质 2 酶具有催化活性 3 酶催化反应具有专一性和高效性CH 1.2 酶工程及其主要研究内容CH 1.3 酶的历史沿革,CH 1.1 酶的基本概念,1 酶是蛋白质 酶的化学本质是蛋白质,这一点是被生物化学所证明了的,研究酶的化学本质,可用研究蛋白质的方法进行研究;一般情况下,一个结构完整的酶包括蛋白质和非蛋白质两部分,蛋白质部分称为辅基酶蛋白,非蛋白质部分称为辅助因子,辅基酶蛋白和辅助因子构成一个全酶。辅助因子的化学本质因不同的酶而不同,它可以是小分子量的有机化合物,也可以是无机矿物质离子。,2 酶具有催化活性酶是一种生物催化剂
2、,在催化活性上与无机催化剂类似,酶在催化反应时,其本身不发生化学改变,只是催化反应的进行,此外,酶在催化反应时,仅改变反应述度,并不改变反应的平衡。酶催化反应的动力学机理是降低反应的活化能。酶与一般催化剂的共性 1.用量少,催化效率高 2.不改变化学反应的平衡点 3.可降低反应的活化能,3 酶催化反应具有专一性和高效性酶作为生物催化剂,其催化反应的专一性远远超过无机催化剂,根据酶的专一化程度,可分为绝对专一性和相对专一性。绝对专一性是指一种酶只能催化一种底物进行一种反应,底物的分子结构、空间构型及构象的不同都表现出专一性。酶与一般催化剂的区别酶的特性 1.高效性 2.专一性 结构专一性(相对专
3、一性/绝对专一性)(特异性)立体异构专一性(几何异构/旋光异构)3.不稳定性(要求温和的反应条件)4.可调控性,相对专一性是指一种能够催化一类结构相似的物质进行相同类型的反应,主要是对某一化学键的专一性。例如:胰蛋白酶(Trypsin EC 3.4.31.4)催化含有赖氨酸或精氨酸羰基的肽键的水解反应,凡是具有含赖氨酸或精氨酸羰基酰胺键的底物都能被此酶催化水解。,CH 1.2 酶工程及其主要研究内容,1 生物工程(Biotechnology):又叫生物工艺学,是20世纪70年代开始提出的一个高新技术名词,是指以遗传工程技术为先导的将生物技术与化学工艺、工程相结合并产业化应用的技术领域。包括四大
4、分支领域:遗传工程、细胞工程、发酵工程和酶工程。2 酶工程(Enzyme Engineering):是酶学研究与其应用工程结合形成的一门新的技术领域;是酶学、微生物学的基本原理与化学工程技术有机结合、相互渗透形成的边缘学科。包括上游工程和下游工程:前者包括酶的产生和酶制剂制备;后者主要包括酶固定化技术、酶修饰技术和生物反应器。(1)上游技术:(2)下游技术:,CH 1.3 酶的历史沿革1 酶学研究简史,1 酶的发现:尽管我国早在4000多年前就朴素地应用了酶,但真正对酶的认识还是1833年Payen 和 Person 首先从酒精发酵物中提取到一种活性物质,发现能够促进淀粉分解(发现了淀粉酶);
5、2 酶(Enzyme)的提出:继Payen 和Person之后,德国的Kuhne进一步深入研究了酶,并提出Enzyme这个名词;enzyme 是希腊文,原意是指“在酵母中”我们翻译成酶,日本译成酵素.3 酶学(Enzymology)奠基:在Kuhne 之后,Buchner兄弟从事了从破碎酵母细胞提取酶的研究,获得了能转化糖产生乙醇的粗酶.此后便开始了从酶的提取、酶的性质、酶催化反应等开始了酶的研究。形成了初步的新兴学科。,在酶催化理论方面:1 1894年,E.Fisher提出酶与底物作用的锁钥学说2 1913 年,Michaelis Menton提出了快速平衡学说,建立了AN酶促反应模型,推导
6、出了酶促反应动力学 方程米氏方程。3 1925年,Briggs和Handane,建立了恒态学说,并 对米氏方程的修正。4 1958年,Koshland提出了诱导契合学说,在酶蛋白化学的研究方面1 1926年,Sumner首次获得了脲酶结晶,证实了酶的 化学本质是蛋白质21年后获得了诺贝尔奖。2 1963年搞清了牛胰核糖核酸酶A的一级结构;3 1965年报道了鸡卵清溶菌酶的三维结构;4 1969年首次利用单一氨基酸人工合成核糖核酸酶获 得成功5 1982年Cech小组发现了rRNA具有催化功能,第一 次动摇了酶是蛋白质的概念。(Ribozyme)但蛋白质化学研究与其催化原理及其酶蛋白功能研究始终
7、是互相促进、相互渗透的。,CH 1.3 酶的历史沿革2 酶工程的发展历程,1 酶工程研究的奠基:以工业化酶制剂生产为主要内容的酶工程雏形阶段(50年代);2 酶固定化技术和细胞固定化技术研究始于60年代;3 70年代基因工程崛起,将酶工程技术研究引向深入并赋予了新的内涵;4 1971年第一次国际酶工程会议的召开,标志了酶工程学科和完善的技术体系的形成;5 80年代实现了克隆酶的突破;(Wager将青霉素酰化酶基因克隆到Ecoli菌株 质粒上,获得了高效表达)6 80年代形成了酶固定化技术、细胞固定化技术研究等酶工程的研究热点,并广泛产业化应用.开始了转基因技术和酶化学修饰技术;7 90年代形成
8、了以遗传工程为先导的酶工程技术分支生物酶工程(包括酶基因克隆表达和基因修饰),CH 1.1 酶的结构和功能CH 1.2 酶催化反应的动力学CH 1.3 酶的分类和命名CH 1.4 酶活力概念及活力测定,CH 2 酶学基本原理,CH 2.1 酶的结构和功能(.酶催化功能的结构基础),1.1 酶的活性中心构成酶活性中心的氨基酸在一级结构上,呈分散状态,这些氨基酸是通过酶蛋白的二、三、四级结构使得其在空间上彼此集中,构成一个特定的与酶活性表达有关区域,这个特定区域即酶的活性中心(active center),换句话说,酶的活性中心是酶分子上的与底物结合并催化反应的特定基团或特定区域。酶活性中心包括两
9、部分,其一是底物结合部位,其二是催化部位。例如溶菌酶:由129个AA构成,而构成活性中心的AA有:Glu35,Asp52,Try62,Asp101(Gly101)构成.,1.2酶作用高效性机理-影响酶高效性的因素 1.邻近定向效应 2.应变效应 3.亲核催化/亲电催化(共价催化)4.酸碱催化 5.微环境的影响 邻近效应 是指A和B两个底物分子结合在酶分子的结合部位上,两分子的反应基团相互靠近,从而降低了两分子进入过渡态所需要的能量,或说增加了两分子反应基团的发生反应的空间机率。定向效应 A、B两个分子进入过渡态,两分子的反应基团需要按一定的方向重叠或交叉,这一方向稍有偏离,反应就难以进行或增加
10、很大能量才能进行,这种酶活性部位赋予底物的这一方向性即定向效应。,1.3 别构酶 酶分子表现其活性是以完整的结构为基础的,某些酶除其活性部位外,还有一个别构部位影响酶的活性,这些酶又称为别构酶或变构酶。别构酶多为代谢 代谢调节酶,由别构部位的变构改变酶的活性,别构部位的变构也是通过与一个配体结合来实现的,但其与酶的活性部位不同,别构部位结合的配体不是底物,而是一个调节酶活性的效应物。,CH 2.1 酶的结构和功能(2.酶催化专一性基本学说),2.1 锁钥学说(lock and key theory)1894年,E.Fisher提出酶与底物作用的锁钥学说,以解释酶与底物之间的专一性问题,其基本含
11、义是:酶与底物分子或底物分子的一部分之间,在结构上有严格的互补对应关系,当底物与酶结合时就象钥匙和锁那样契合对应。.2 诱导契合学说(induced-fit hypothesis)1958年,Koshland提出了诱导契合学说,其主要内涵是:当酶与底物分子接近时,酶蛋白受底物分子的诱导,其构象发生有利于与底物分子结合或催化的变化,酶与底物在此基础上互补契合,以发挥酶的催化功能。,锁 钥 学 说,诱导契合学说,丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中,口袋的大小以及口袋内的微环境(疏水性、电荷性质)决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性,胰凝乳蛋白酶:口袋较大,主要由疏水氨基酸残基围成,开口较
12、大(由两个Gly组成),因此需要底物有一个疏水基团(芳香环Phe、Tyr、Trp及大的非极性侧链)定位。裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键胰蛋白酶:口袋较大,底部有Asp,利于 Lys.、Arg结合,裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键 弹性蛋白酶:口袋较浅,开口较小(由Val,Thr组成)只能让Ala等小分进入,裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser-His-Asp催化三联体(电荷中继网)。电荷中继网:Ser195His57Asp102氢键体系。通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。没有底物时,Ser195His57Asp102形成一个氢键体系,H
13、is57是去质子化状态,Asp102的COO-通过氢键定位并固定His57。结合底物时:His57从Ser195接受一个质子,增加了Ser195羟基氧原子对底物的亲核攻击性,Asp102的COO-稳定过度态中His57的正电荷形式。,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制第一阶段:酰化Ser195-OH 中的氧攻击肽键的羰基碳(共价催化),酶的His57咪唑H+与底物中的-NH形成氢键(酸碱催化),形成四联体过渡态(Ser195O-、底物的羰基C、底物的-NH、His的咪唑H+),肽键断裂,氨基产物释放,底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。第二阶段:脱酰电荷中继网从水中吸收一个质子,结果产生的OH-
14、攻击连在Ser195上底物的羰基C原子,形成四联体过渡态,然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子,底物中的酸成分从Ser195上释放。,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶 1.胰凝乳蛋白酶结构,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶2.胰凝乳蛋白酶的电荷接力网,四.酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶 2.胰凝乳蛋白酶的催化过程,A.酶与底物结合,形成米氏复合物(ES),B.形成四联体过度态中间物,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶,E.形成包括水分子的四联体过度中间物,F.羰基产物形成,酶游离,CH2.2 酶催化反应的动力学(.酶催化反应的初述度),2.1 Michaelis-Menten
15、迅述平衡学说 及Henri-Michaelis-Mentwen方程 单底物酶促反应模型:k1 kp E+SESE+P-k1 迅述平衡学说对上述反应模型有两点假定:酶与底物结合形成酶底物复合物的述度很快。整个反应述度取决于酶底物复合物释放出游离酶和形成产物的反应述度。,CH2.2 酶催化反应的动力学(2.底物浓度对反应述度的影响),反应述度 v=kpES.(1)Ks=ES/ES(Ks是ES的分解常数).(2)ES=ES/Ks.(3)如果我们设反应体系中酶的总浓度为E0,当反应达到平衡以后,酶分子以下列两种形式存在:E0=E+ES.(4)将3式分别和1式4式加以整理便得:v=KpES/Ks.(5)
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