疾病的基因治疗.ppt

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1、疾病的基因治疗复旦大学 遗传学研究所薛京伦2003，10,基因治疗几个发展时期1980-1989 准备期 技术、宗教，伦理，法律1990-1995 狂热期公众，媒体1996-至今 理性期出现临床结果,人体基因治疗是一个多环节的复杂过程基因导入靶器官、靶组织、靶细胞间的交流基因表达水平和时空调控基因表达产物生物活性载体安全性还存在许多迷惑和问题,早期期望值过高，目前理论研究和技术的发展水平均还不能满足成功临床试验的需要，安全性问题还一直没有彻底解决。然而，目前对许多疾病分子机制和对基因载体的研究取得了长足的进步，为基因治疗较大范围临床试验开展打下了坚实的基础。,选择 在治疗上合适的基因已知其在某

2、特定疾病中的病理、生理作用适当的基因导入系统病毒或非病毒载体临床前试验的有效性和安全性评价临床实验的有效性检测手段,一、基因治疗主要病种：主要为对人类健康威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如AIDS、类风湿等）。,a,a,a,a,a,a,Disease,transferred function,Clinical Results,Classical SGT models and strategies,additional popular and emerging examples:Morbus Gaucher,Morbu

3、s Parkinson,Crigler Njiar,OTC deficiency,Duchennes MD,Restenosis control,二、遗传病基因治疗1.第一个基因治疗的遗传病(1990):腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症。ADA缺乏症是一种罕见的遗传病，患者ADA基因缺陷，不能产生功能性ADA酶。ADA缺乏的孩子一出生就有严重的免疫缺陷，十分容易受感染，需要在几乎无菌的环境中生存。ADA缺乏症能用PEG-ADA治疗，但这种药物十分昂贵（60,000美元/年），而且必须通过持续静脉注射来维持疗效。,ADA缺乏症被选为第一个基因治疗试验有以下几点原因：单基因遗传病，功能清晰，基因小基因调

4、控简单，只要“开启”状态ADA酶量无需精确调控：很少量的酶也可使患者受益，酶量很多也能耐受。,2、血友病B基因治疗的实践与发展 血友病B（Hemophilia B）是一种由于凝血因子IX基因（hFIX）发生突变而引起的出血性疾病。其症状表现为自发性出血，严重者可因关节出血导致关节变形和残废甚至死亡。该病为X染色体连锁，在男性中发病率大约为1/100,000。,血友病目前的临床治疗方法：蛋白替代法：输血、输凝血酶原、注射重组FVIII，FIX，能有效地改善出血症状和延长生命，但是昂贵，且存在感染HIV，HBV（乙肝），HCV（丙肝）风险,蛋白替代法可导致抑制物产生，从而使治疗失效血友病A 有10

5、-40%的人群产生抑制物血友病B 有5%的人群产生抑制物这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越的基因治疗的原因之一！,血友病是目前SGT最有希望达到理想疗效的遗传病病种现行血友病B治疗手段、效果不理想单基因遗传病不需要精确的表达调控，无需所有细胞表达表达广谱理想的动物模型（二个狗品系，3个小鼠品系）疗效易于评价血友病A：100-200ng/ml血友病B:5000ng/ml,血友病B基因治疗靶细胞选择ex vivo:In vivo:皮肤成纤维细胞直接、连续注射角质细胞内皮细胞上皮细胞成肌细胞造血干细胞骨髓基质细胞支持细胞,尽管人体天然的FVIII和FIX都是由肝细胞产生的。然而，实验证

6、明，由非肝细胞如CHO产生的重组凝血因子与人体天然的凝血因子在活性和免疫原性上没有差别，到目前为止没有发现非肝细胞产生的凝血因子有不同寻常的翻译后修饰。因此，肝细胞不一定是血友病基因治疗必然的靶细胞。,1）1991年，复旦大学反转录病毒介导的ex vivo途径临床试验取得了安全有效的结果,反转录病毒载体,XLIX,5LTR FIX cDNA Neo S Ori P Ori 3LTR,N2CMVIX,5LTR Neo CMV FIX cDNA 3LTR,2）2003年，以AAV-2/hFIX介导的直接肌肉注射，基因治疗血友病B方案已被批准临床试验（国家药品监督管理局药物临床批件，2003L004

7、03）,ITR CMV hFIX minigene PA ITR,ITR CMV mFIX PA ITR,pAVChFIXmpAVCmFIXpAVChFIXmR,重组AAV载体,ITR CMV hFIX R338A PA ITR,Transient Expression of pAAV-hFIXs in Cell Lines,In vitro Expression of AAV/mFIX,mFIX level(ng/106cells/24 h),Expression of rAAV-hFIXR338A in Mice:,Expression of mFIX in Hemophilia B Mo

8、use,血友病小鼠经rAAV基因治疗后,FIX凝血活性提高,出血症状改善,3.2 40ul APTT 20,30 430ul APTT 100,7.5 50ul APTT 34,Bleeding Assay,采用Western dot-blot分析表明，于肌肉注射rAAV/hFIX病毒子后第15天，小鼠血液中即开始出现抗hFIX抗体，血浆中hFIX水平亦开始下降.经Bethesda分析,未发现抗小鼠IX因子抗体.,0天 3天 15天 27天 39天 阳性对照,抗IX因子抗体分析,肌注FIX后，抗体在7天后开始明显增加，15天时达到最高，约为正常对照的8倍左右，到60天时抗体的量开始减少，为正常

9、对照的5倍，此后到120天，抗体的量基本不变。,抗AAV抗体检测,建立了复制型AAV病毒检测的巢式PCR方法以及HSV病毒检测方法,提高了灵敏度。研究了肌肉注射重组AAV在体内的分布，分散程度与注射剂量成比例，主要分布在注射肌肉组织,经过半定量PCR发现肌肉中的载体数是其它组织的1,00010,000倍。鼠类使用AAV毒性研究,病毒注射后血浆没有发现血清肌氨酸激酶水平的上升，体重没有改变，未见血清的化学参数或血液参数的改变。仅发现少量由淋巴细胞浸润导致的感染,无结构改变。,安全性,以高剂量AAV病毒肌肉注射老鼠试验中，未引起组织毒性,所有动物脾大小正常，未发现囊泡区的增生。在注射区的骨骼肌仅有

10、中等或轻微的慢性感染，感染仅限于肌束膜组织，无肌肉纤维解剖学上的改变。rAAV注射后,小鼠体内AAV抗体滴度增高.rAAV病毒随机整合问题,3）以其他载体系统进行血友病B基因治疗微小腺病毒载体介导hFIX小基因离体表达,ELISA方法检测微小腺病毒(miniAd)及第一代腺病毒(firstAd)介导cFIX在血友病B小鼠血浆中的表达,VSVG假型RV介导的hFIX cDNA在血友病B小鼠中的基因治疗 VSVG假型RV滴度高，与传统RV比较抗补体灭活效应高，不同剂量病毒上清液腹腔注射新生血友病B小鼠，小鼠凝血功能改善，凝血活性提高3%以上，表达持续 120d以上。,重组慢病毒载体介导人凝血IX因

11、子的表达及宫内基因治疗,重组慢病毒载体 FUXW FAXW感染离体细胞293T、L-02、BHK 72h后的hFIX蛋白表达,重组FAXW.FUXW病毒在血友病B小鼠体内表达hFIX的时效曲线,HIV是基因组结构及基因调节机制最为复杂的逆转录病毒之一,基于HIV的重组反转录病毒载体，能广泛感染各种非分裂细胞,也保留了能够整合在宿主染色体上的特点.且免疫反应小,重组HIV是一个很有发展潜力的病毒载体,ABP肝特异性启动子指导人的凝血因子IX的重组HIV载体：重组慢病毒载体质FUXW,FAXWD等,宫内胎鼠基因治疗,非病毒途径导入基因：尾静脉大容量快速注射法尾静脉大容量快速注射裸DNA能够介导外源

12、基因在动物肝内高效表达，我们以凝血因子（hF）为报告基因建立了尾静脉液压法裸质粒转移体系。,人F在小鼠体内的表达小鼠尾静脉大容量快速注射10g CMV-hFIX 质粒 DNA()，注射后不同时间采血，通过ELISA检测血浆中hF的水平。示Ringers液注射组。,血友病基因治疗进展与展望 进展 展望新的AAV 血清型 和慢病毒载体已成功 改进慢病毒,gutless Ad和不同血清用于FVIII、FIX生产研究 型AAV正在开展除了肝脏外，其他器官也可以用于产生 基因修复、RNA修复（Trans-FVIII、FIX slicing）提供新的方案设计思路内源性因子合成和病毒载体引起的免疫 以外周内

13、皮源细胞实施基因修饰的反应是血友病基因转移的潜在威胁 可能具有发展前景血友病临床试验正在开展 以干细胞治疗实施的基因修饰将成（RV，AAV，或ex vivo皮肤成纤维 为可能细胞）,4）总结 血友病基因治疗需要安全、有效、无免疫原性的转移系统，并要求持续表达，且必须优于蛋白替代法。血友病具有很好的的动物模型,Hem A,HemB均有 小鼠和狗模型，能模拟、预测临床症状、评价有效性和安全性，有助于临床前制定策略。目前已开展病毒和非病毒转移系统研究，病毒的工作占多数，但非病毒系统的工作可能更具魅力：可在无细胞系统中装配 免疫原性小杂合非病毒载体系统 将病毒某些成分加入系统，以提高基因转移效率，对血

14、友病基因治疗很有吸引力,三、肿瘤的基因治疗,目前，进入临床试验的基因疗法有70%是针对癌症的，虽然大多数尚未被肯定疗效，但代表了癌症治疗的方向。恶性肿瘤基因治疗方案中，所用的治疗基因大致可归为三类：细胞因子类；杀伤性基因类，以疱疹病毒I型胸苷嘧啶激酶（HSV/TK）为代表；以p53为代表的抑癌基因及反义癌基因类。,2003年10月16日，全世界第一个基因治疗药物p53腺病毒注射液由中国国家药品监督管理局颁发新药证书！,常见癌症治疗方案外源性基因替补疗法 输注外源性抑癌基因p53可抑制或杀灭癌细胞。抗原基因导入疗法 将组织相容复合体MHC基因转移给肿瘤细胞，MHC II型分子在肿瘤细胞表面大量表

15、达，与肿瘤抗原结合形成复合抗原，从而暴露出“靶点”被免疫细胞识别和消灭,反义基因疗法 以癌基因DNA的有义链为模板合成出反义链，将其转入肿瘤细胞内，形成的双链核酸阻断癌基因表达和癌细胞增殖。自杀基因疗法 将自杀基因（又称前药转换酶基因如胸苷激酶tk基因和胞嘧啶脱氨酶CD基因等）,导入癌细胞内，使癌细胞死亡。细胞因子基因导入疗法 将白细胞介素II、干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子基因导入肿瘤细胞内，所产生的细胞因子可引起癌细胞死亡；也可将这些细胞因子基因导入肿瘤组织中淋巴细胞内，增强这些细胞的抗癌作用。,我们的部分工作腺病毒载体介导的TK/ACV对大鼠脑胶质瘤离体/活体的杀伤作用,目前癌症基因治疗

16、的研究大多是在观察毒副反应为主的期临床试验，极少数进入/期临床试验，结果有待进一步观察。目前的临床研究进程很慢，这与癌症复杂的发病机制和有效载体的研发有关，虽然动物实验的结果不断涌现，但并不能完全代表人类，只有临床试验具有决定性的作用。就目前的研究成果来看，基因治疗可能会在手术、放疗和化疗以外，成为一种新的肿瘤治疗手段，特别可能对提高化疗、放疗的敏感性，减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个较为重要的组成部分。,四、传染病的基因治疗,（1）病毒性肝炎的基因治疗 病毒性肝炎基因治疗研究虽然取得了一系列的进展，但是，由于病毒性肝炎的发病机制还没有完全了解清楚

17、，目前基因治疗在病毒性肝炎治疗中的应用远未达到最高水平。病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治疗技术本身发展的速度和状态，另一方面也取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入程度。,病毒性肝炎基因治疗最近部分工作Xu R et al”Molecular therapeutics of HBV”Curr Gene Ther.2003 Aug;3(4):341-55.病毒学杂志.2003 Mar;17(1):81-4.Ding CL et al“Expression of HBcAg in eukaryotic cells by retroviral vector mediated gene tran

18、sfer”中华实验和临床病毒学，2003 Mar;17(1):81-4.Klein C et al“Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA”Gastroenterology.2003 Jul;125(1):9-18 Han JQ et al“Approach to transforming hepatitis B virus as a gene therapeutic vector”中华肝脏病杂志 2003,Jun;11(6):344-6.,（2）AIDS 基因治

19、疗-近期一些工作Zhang D et al:“Optimization of ex vivo activation and expansion of macaque primary CD4-enriched peripheral blood mononuclear cells for use in anti-HIV immunotherapy and gene therapy strategies”J Acquir Immune Defic Syndr.2003 1;32(3):245-54.Ananthalakshmi Poluri et al“Genetic therapy for HIV

20、/AIDS”Expert Opinion on Biological Therapy.2003,vol.3,no.6,pp.951-963 Fanning G et al“Gene therapy for HIV/AIDS:the potential for a new therapeutic regimen”J Gene Med.2003 Aug;5(8):645-53 Akkina R et al“siRNAs,ribozymes and RNA decoys in modeling stem cell-based gene therapy for HIV/AIDS”Anticancer

21、Res.2003 May-Jun;23(3A):1997-2005.,（3）SARS 基因治疗反义技术？在“反义”技术领域潜心耕耘了23载的AVI公司一直不为外界所知，直到非典出现，该公司一鸣惊人。事实上，AVI公司只花了几天时间，就把对付田鼠冠状病毒和企鹅西尼罗河病毒的“反义”技术“改造”成了对付非典病毒的武器。是否成功有待证明 但是，一些专家对AVI公司成功对付非典的可能性表示怀疑。纽约阿尔伯特爱因斯坦医学院的赛斯滕博士说，他要看更多的数据。这位被称为“反义技术之父”的博士还强调，他的领域充满了失败，“我们的了解不多，（这一技术）实在太复杂”。“反义”技术之复杂在于，一是它除了能切断有害基

22、因及其编码的蛋白质之间的信号传播，也会影响与疾病没有关系的其它基因和蛋白质；二是它有可能最终被证实不能切断信号传播。,目前临床试验成功的例子AAV-Hemophilia BTreatment of certain types of cancer using conditionally replicating oncolytic virusesTreatment of vascular and coronary artery disease using viral vectors that express angiogenic factors p53 for cancer treatmentDN

23、A vaccine for cancer and infectious diseases,六、我国基因治疗成就和存在问题（一）成就：1991年复旦大学进行了国际首例血友病B基因治疗临床实验2000年四川大学首先提出利用异种同源分子作肿瘤基因治疗的策略2002年上海市肿瘤研究所设计的非病毒基因导入系统获得美国专利 2003年，世界上第一个基因治疗药物在中国诞生 我国已有14个基因治疗方案进入临床试验,（二）存在问题：大多重复国外同类实验；缺乏创新性，各自为政,规模小,资金投入有限,缺乏中心的辐射作用；一哄而上,一哄而下,缺乏基因治疗正确认识.缺乏孵化和转化机制,更缺乏风险基金；基因治疗研究和相关研究如基因组学,病毒学,免疫学,转基因动物,临床医学的结合不够；初级 人才流失,高级人才匮乏；过于强调商业价值,忽视科学价值和样板作用,