项目三-微生物染色技术.ppt
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1、项目三,微生物染色技术,细菌(bacterium):是属原核生物界的一种单细胞微生物.广义细菌:包括细菌、放线菌、支原体、衣 原体、立克次体、螺旋体 狭义细菌:专指其中数量最大、种类最多、具有典型代表性的细菌,概 念,细菌的大小,测量细菌大小的单位是微米(m)多数球菌直径为:1m 中等大小杆菌长约为m.同一种细菌可因 菌龄不同和环境等 因素而有差异,细菌的大小与形态,细菌的形态,细菌的基本形态有三种:球菌(coccus);杆菌(bacillus)螺形菌(spiral bacterium),细菌结构模式图,细菌的结构分为两类:,荚膜鞭毛菌毛芽孢,细胞壁细胞膜 细胞质核质,细菌的基本结构,细菌的特
2、殊结构,习惯上:细菌的结构,基本结构,特殊构造,细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质、核糖体和内含物等,细菌基本生命活动中所必需,各种细菌都具有的结构,如夹膜、鞭毛、菌毛、芽孢等,与基本生命活动没有多大关系,并不是所有细菌都有这些结构,细胞壁,细胞质,细胞膜,细菌的染色体,菌毛,核糖体,质粒,鞭毛,内含物,荚膜,一、基 本 构 造,(一)细胞壁(Cell wall)位于细菌细胞最外层,贴近细胞膜之外,是一层坚韧而具有一定弹性的膜状结构。结构比较复杂较厚(1080nm)质量均匀网状结构可承受细胞内强大的渗透压而不破坏,革兰氏染色法,由于各种细胞壁所含成分不一样,1884年丹麦科学家(Christion
3、 Gram)发明了一种染色方法,我们称之为革兰氏染色法。据革兰氏染色反应不同,可以把细菌分为两大类:-革兰氏阳性菌 G+-革兰氏阴性菌 G-,革兰氏染色(Gram staining)过程,1)初染:结晶紫溶液染色13min,水洗2)媒染:卢戈碘液1min,水洗3)脱色:95%的酒精,脱色时间根据抹片的厚度灵活掌握,多在1530s之间,水洗4)复染:番红染色液染1min,水洗5)干燥:吸干或自然干燥6)镜检:G+菌呈蓝紫色,G-菌为红色,碘液媒染,95%乙醇脱色,石炭酸复红或番红染色液复染,细菌菌体涂片,固定,结晶紫染色,Gram Positive G+,Gram Negative G-,Gra
4、m stain of Gram+Staphylococcus cells,Gram stain of Gram-E.coli cells,革兰氏阳性菌细胞壁组分:肽聚糖、磷壁酸革兰氏阴性菌细胞壁组分主要有:肽聚糖、外 膜(脂蛋白 脂质双层 脂多糖),细菌的细胞壁,特殊成分,基本成分肽聚糖,革兰阳性菌磷壁酸革兰阴性菌外膜,肽聚糖化学组成:,特点:层次多(50层)三维空间网格结构,特点:层次少(2层)二维平面结构,G(+)菌,G(-)菌,聚糖骨架,聚糖骨架,四肽侧链(丙、谷、赖、丙),四肽侧链(丙、谷、二氨基庚二酸、丙),五肽交联桥,()主要成份:肽聚糖(peptidoglycan)又称mucop
5、etide Grams阳性菌:肽聚糖磷壁酸特殊蛋白,肽聚糖:聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥 G+菌含量丰富,15-50层占胞壁干重5080%,幻灯片 33,、聚糖骨架:N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)N-乙酰胞壁酸(N-acetyl muramic acid)两者由-1,4糖苷键联结,各种细菌的聚糖支架相同,这是肽聚糖合成的第一步。,、四肽侧链:氨基酸组成及联结方式随菌种不同而异,以金葡菌为例,N乙酰胞壁酸上连结L丙 氨酸、D谷氨酸(或D异谷氨酰胺)、L 赖氨酸、D丙氨酸,这是肽聚糖合成的第二步。,、五肽交联桥:五个甘氨酸组成的交联桥,一端接在 第三位L-赖氨酸上,另
6、一端在相邻四肽侧链的未端D-丙氨酸上,这是肽聚糖合成的第三步。,1、革兰氏阳性菌细胞壁的结构,壁磷壁酸,肽聚糖,脂磷壁酸,阳性菌特有,细胞壁较厚,约1580mm。其化学成分主要是肽聚糖,约占细胞壁干重的4095%,形成1550层聚合体。组成肽聚糖的聚糖骨架与革兰氏阴性细菌相同,但四肽侧链的组成和交联方式则与革兰氏阴性细菌不同。磷壁酸(Teichoic acid),(1)肽聚糖(peptidoglycan),又称“粘肽”(Mucopetide)、“糖肽聚”(glycopetide)或胞壁质(murein),是细菌细胞壁特有物质。,细胞壁的机械强度有赖于肽聚糖的存在。合成肽聚糖是原核生物特有的能力
7、。,凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质,都能损伤细胞壁而使细菌变形或杀伤细菌,如:溶菌酶能水解肽聚糖支架的-1,4糖苷键,引起细菌裂解。青霉素和头孢霉素能抑制四肽侧链上D-丙氨酸与五肽桥之间的联结,使细菌不能合成完整的细胞壁,可导致细菌死亡。,不同的抗生素作用于肽聚糖合成的不同阶段:抑制第一步:磷霉素、环丝氨酸、溶菌酶 抑制第二步:万古霉素、杆菌肽 抑制第三步:青霉素、头孢菌人类没有细胞壁,因此研究和发掘破坏或阻抑肽聚糖合成的新型抗菌药物是我们的方向之一,革兰氏阳性菌“肽聚糖”(如金黄色葡萄球菌),由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥组成,N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamin
8、e,G),N-乙酰胞壁酸(N-acetyl muramicacid,M),磷壁酸,膜磷壁酸(Membrane teichoic acid),与细胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸连结,又称脂磷壁酸(Lipteichoic acid),和细胞膜连结,另一端均游离于细胞壁外。,壁磷壁酸(Wall teichoic acid),(2)磷壁酸(Teichoic acid),G+菌特有,是由核糖醇(Ribitol)或甘油(Glyocerol)残基经磷酸二酯键相互连接而成的多聚物,并带有一些氨基酸或糖。约30个或更多磷壁酸分子组成的长链,穿插于肽聚糖中。,磷壁酸(Teichoic acid),磷壁酸的作用抗原性
9、很强G菌的表面抗原;在调节离子通过肽聚糖层中起作用;与细胞膜上一些酶的活性有关;某些细菌的磷壁酸,对宿主具有粘附作用,其作用类似菌毛,可能与致病性有关。因带负电荷,故可与环境中的Mg等阳离子结合,提高这些离子的浓度,以保证细胞膜上一些合成酶维持高活性的需要。,2、革兰氏阴性菌细胞壁结构,较薄,约1015nm,结构成分较为复杂,由肽聚糖和外膜组成,外膜由脂蛋白、脂质双层、脂多糖组成。,外膜:G菌特有,为胞壁主要成分,厚8-10nm。包括:脂蛋白:向内与肽聚糖()相连 脂质双层:液态,似细胞膜 脂多糖:G菌的内毒素,由 类脂A、核心多糖、特异性多糖组成,(1)革兰氏阴性菌“肽聚糖”(大肠杆菌),包
10、括聚糖骨架、四肽侧链,四肽侧链的第三位氨基酸由二氨基庚二酸(DAP)替代,以肽健直接与相邻四肽侧链中的D-丙氨酸相连,无五肽交联桥,形成二维结构,故其结构较疏松,G,G,G,G,M,M,丙,谷,DAB,丙,丙,DAB,谷,丙,N-乙酰葡萄糖胺,N-乙酰胞壁酸,聚糖骨架,四肽侧链,外膜脂蛋白:位于肽聚糖层和脂质双层之间,起连接作用,使外膜和肽聚糖构成一个整体。脂质双层:磷脂双层,内嵌外膜蛋白(out membrane protein OMP),具有不同的功能。如有的外膜蛋白为孔蛋白是小分子的通道;有的是噬菌体、性菌毛、细菌素的受体。,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)-是革兰
11、氏阴性菌的内毒素;有以下三部分组成:类质A(Lipid A):类脂A:是细菌内毒素的毒性和生物学活性的主要组分,无种属特异性。是细菌内毒素的毒性和生物学活性的主要组分。核心多糖(core polysaccharide):位于类脂A的外层,由己糖、庚糖、2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)、磷酸乙醇胺等组成。有种属特异性。特异性多糖(specific polysaccharide):由数个至数十个低聚糖重复单位组成的多糖链。具有种特异性。革兰氏阴性菌的菌体抗原(O 抗原),脂多糖(LPS),是革兰阴性菌外膜的组成成分,包括类脂A、核心多糖和O特异性多糖三部分,又称为内毒素。类脂A是内毒素的主要毒性成
12、分;核心多糖具有属特异性,同一属细菌的核心多糖的抗原性相同;特异性多糖即菌体O抗原,具有种的特异性。,概念,是革兰氏阴性细菌致病物质内毒素的物质基础,与磷壁酸相似,也有吸附Mg+、Ca2+等阳离子以提高这些离子在细胞表面的浓度的用;,由于LPS结构的变化,决定了革兰氏阴性细胞表面抗原决定簇的多样性;,具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能。,脂多糖功能,3、细菌细胞壁结构比较,4、细胞壁的功能,1)保持:细菌外形2)保护:免受外界渗透压和有害物用质的损害3)屏障:它具有相对通透性,对物质的进出,起着选择性分子筛的屏障作用。4)抗原性:带有多种抗原决定簇,决定细菌菌体的抗原性。5)与细菌某
13、些染色反应和药物敏感性有关。,(5)革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁结构差异的生物学意义,染色性:革兰阳性菌细胞壁结构致密,含脂类物质少,不易酒精脱色,革兰氏染色成蓝紫色(紫色);反之革兰阴性菌染成红色;抗原性:革兰阳性菌的重要表面抗原之一是磷壁酸,革兰阴性菌的核心多糖和O抗原多糖是为重要表面抗原;毒性:革兰阴性菌的脂多糖即为内毒素(类脂A为内毒素主要成分),革兰阳性菌无此成分;药物敏感性:革兰氏阳性菌对青霉素,溶菌酶敏感,革兰阴性菌则否。,G+菌与G-菌的差别及与细胞壁的关系,(二)细胞膜(Cell embrane),细菌细胞膜的结构与真核细胞者基本相同,由蛋白质、脂类和少量的多糖组成。所含的脂
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