目的基因的制备和基因克隆的筛选.ppt
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1、基因工程,田长恩,基因工程,1 基因工程概论,2 天然DNA的制备,3 分子克隆工具酶,4 分子克隆载体,5 表达载体,6 PCR技术及其应用,7 目的基因的制备,8 基因克隆的筛选策略,9 细菌基因工程,10 酵母基因工程,11 植物基因工程,12 动物基因工程,13 医药基因工程,14 基因工程的安全,How to amplify a target gene?,Amplification of a target gene with PCR if the sequence is known.,7 目的基因的制备 7.1 直接分离7.2 构建基因组文库分离7.3 构建cDNA基因文库分离7.4
2、 利用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因7.5 基因的化学合成(自学),7.1 直接分离限制酶酶切分离法 适于从简单基因组分离目的基因,如质粒和病毒。对已定序的DNA分子,只需用已知识别序列的限制酶进 行一次或几次切割,分离纯化所需DNA片段即可。对定位的目的基因,根据目的基因两侧的已知限制酶识别位点,用适当酶切割,可获得目的基因。即使含目的基因的DNA分子未定序或未定位,先通过酶切分析,随后再通过部分酶切,克隆构建一个非常简单的基因组文库,从中钓出目的基因。,2)物理化学法 如果不同DNA片段的碱基组成差异较大,其理化性质,如浮力密度和解链温度等明显不同,采用相应的方法从生物基因组分离目的
3、基因。主要有密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等。密度梯度离心法:GC含量高,浮力密度大,可用密度梯度超速离心使片段分开。然后通过与标记的mRNA杂交检验,分离基因,如非洲爪蟾rDNA和海胆组蛋白基因。单链酶解法:GC含量高,Tm值就高。据此,可通过控制Tm使富AT区变性解链,而富GC区仍维持双链状态,然后利用单链核酸酶S1酶切除单链,得到富GC的片段,经梯度离心分离。海胆 rDNA分子内GC含量高达 63,就是用此法分离得到。分子杂交法:单链DNA与其互补的序列“配对成双”后,再将非单链用单链核酸酶 S1切掉,最后经梯度离心分离。Beckwith(1969)等应用此法,成功地分离了大肠杆
4、菌乳糖操纵子的-半乳糖苷酶基因,首创了单基因分离的成功先例。,3)双抗体免疫法 此法适用于已分离纯化且足以产生特定抗体的蛋白质。黄色葡萄球菌中的 protein A可以同IgG产生免疫反应而代替第二抗体,由此发展出用protein A-Sepharose 4B作为亲和层析介质,通过亲和层析分离特定的多聚核糖体的技术,从而使双抗免疫法更有效。,多聚核糖体制备,与一抗保温,多聚核糖体-一抗,特定mRNA,不连续蔗糖梯度离心,多聚核糖体-一抗体-二抗,纯化的多聚核糖体-一抗体-二抗,去除蛋白,cDNA,4)反转录法 对于特定基因,以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成 cDNA,然后在 DNA聚合
5、酶的催化下合成双链 cDNA片段。这样就可以通过mRNA-cDNA-dscDNA的途径而绕过建立cDNA文库这一步,直接得到基因。,7.2 构建基因组文库分离法(第11章)高等生物的基因组DNA十分庞大,可达数万个,且基因组成结构复杂,因此,单个基因在整个基因组中所占的比例极小,除少数外,绝大多数基因难以直接分离。解决以上难题的一种可行方法就是扩增这个基因,以增加分离成功的可能性。但要分离的目的基因往往是未知基因,无法进行特异性扩增,而只能对所有的基因进行扩增,也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再用不同的方法将所需的克隆筛选出来,再分离得到目的基因。,鸟枪法克隆目的基因,早期方法,先将DN
6、A打断,与适当载体重组,转化受体菌进行无性繁殖,获得一大群含不同外源DNA片段的克隆,再从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株,获得所要的基因。,鸟枪法的不足:采用质粒作载体,克隆能力有限,重组后的克隆多,筛选困难。噬菌体载体使可插入的外源片段长度大为增加,最大可达22 kb;而cosmid和YAC载体能容纳45 kb和上百万kb,有利于分离和筛选同一生物体内的各种基因片段。1)基因组文库的概念 通过克隆载体使某种生物基因组的全部遗传信息贮存于一个受体菌的群体,即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗传信息,则称为部分基因组文库。,2)基因组文库的大小 理想的
7、基因组文库:“全”,克隆群体包含基因组的所有DNA序列;“完整”,片段的长度要足够,含基因的完整序列,包括其侧翼序列;“重叠”,目的序列在某些克隆中有部分重叠,便于获得基因的全部序列。一般情况下,完整的基因组文库所需的克隆总数取决于外源基因组大小及切割片段大小,可用公式进行理论值的估算:,基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长片段均长 例如某生物基因组的总长为3106kb,酶切片段均长15kb,则基因组文库应含克隆子数为 310615 2105。但实际上,该基因组文库应含的克隆子数远远超过这个数。为此,Clark和Carbon(1976)提出了一个经验公式用于估算基因组文库的大小,公式如下:必
8、需的克隆的数目 N ln(1-P)/ln(1-f)P:目的片段在文库中出现的概率;f:插入片段大小/全基因组大小。如果要使文库中目的片段的出现概率达到期望值 99,即0.99,则构建上述某生物的基因组文库应包含的克隆子经验值是 N ln(1-0.99)ln(1-153106),比理论值约大 4.5倍。几类生物基因组文库大小列于表4-1。,实际上,无论采用什么方法都不能达到理论上的完全随机切割。为了使基因组文库具有真实代表性,一般构建基因组文库的实际克隆数应比上述计算值大2倍或3倍,甚至更高。,3)构建噬菌体基因组文库 包括获得含基因的DNA片段,与噬菌体克隆载体重组,转化受体菌和筛选克隆子。目
9、前较多地选用替代型噬菌体载体来构建基因组文库,其基本步骤如图所示。,BmaHI与Sau3AI是同尾酶(5GATC),I,4)构建cosmid基因组文库 Cosmid分子小,含质粒复制起点和抗生素标记,可在大肠杆菌中复制;也含cos位点,可体外包装。重组Cosmid进入大肠杆菌后,只按质粒DNA的方式复制,所得为菌落。Cosmid作为构建基因组文库载体的优缺点 优点:能容纳更大的片段(3045 kb);载体分子很小(5 kb),便于插入片段的限制酶图谱分析。缺点:筛选困难;重组效率低;文库不易贮存。,5)构建YAC基因组文库 噬菌体和cosmid克隆能力约为20和45 kb,对于单个基因或小基因
10、组已足够,但对于大基因组明显不够。酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)能象染色体一样在酵母细胞中复制,并可克隆长达上千kb的DNA。YAC以pBR322为骨架,具pBR322质粒的复制起点和筛选标记,还加入染色体复制必需的组分:着丝粒序列(CEN)、酵母自主复制序列(autonomusly replicating sequence,ARS)、一对端粒序列(TEL)、选择标记TRP1和URA3(酵母色氨酸和尿嘧啶营养缺陷型trp1和ura3的野生型等位基因)、克隆位点,存在于SUP4中。当外源DNA片段插入时,该基因被隔断,使突变宿主菌落由白色转为红色
11、。构建过程如图。,丢失,7.3 构建cDNA基因文库分离(第11章)基因组庞大而复杂,从染色体DNA出发,直接克隆目的基因非常困难。高等生物具有大约104-5种基因,但在一定发育阶段的单个细胞或个体中,仅15左右的基因表达。可见由 mRNA出发反转录而产生的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA克隆是通过酶将总poly(A)mRNA转变成双链cDNA群体,插入到适当载体后转化寄主,构成某个时期或某组织中表达基因的 cDNA基因文库(图)。7.3.1 cDNA文库的构建(i)先提总RNA,再纯化mRNA。,(ii)合成第一链cDNA。Oligo(dT)引导的cDNA合成法
12、:用12 20个Oligo(dT)做引物,以mRNA为模板合成第一链cDNA,得RNA-DNA杂交分子。但是,此法从3-端开始,往往无法到达5-端。随机引物引导的cDNA合成法:利用随机610个核苷酸(混合物)为引物,从许多位点同时反转录,然后测序和重叠分析,得到mRNA全序列。(iii)将mRNA-DNA转变为双链DNA。大肠杆菌RNaseH酶识别mRNA-DNA,并将其mRNA消化成许多短片段,仍同第I链DNA杂交着,故可作为引物,以第I链为模板合成第II链。最后,用连接酶连接。(iv)将合成的双链cDNA重组到载体上,导入寄主增殖。,以质粒为载体构建cDNA文库,PCR法合成cDNA,7
13、.3.2 mRNA丰度与cDNA基因文库大小的关系 一个细胞中有上万种mRNA,但各种mRNA的拷贝数不同,即丰度不同,可以分为高、中和低丰度类型(表)。,估算cDNA文库大小的理论公式:文库中cDNA的克隆数=总mRNA数/某种mRNA的拷贝数 估算cDNA文库大小的经验公式:N=ln(1-p)/ln(1-f)N为cDNA基因文库克隆的数目;P为文库中含目的基因cDNA片段的出现概率,一般期望值为 99;f是某种 mRNA的丰度与总mRNA数的比值。,7.3.3 cDNA文库的优越性 第一,cDNA克隆是某些不经过DNA中间体的RNA病毒(如流感、脊髓灰质炎等病毒)基因组结构研究及有关基因的
14、克隆分离的唯一可行的方法。第二,cDNA基因文库的筛选简单易行。cDNA文库比基因组文库所含克隆数少,约为后者的1/10,甚至更少。第三,每一cDNA克隆都含有一种mRNA序列,选择目的基因出现假阳性的概率较低。第四,通过cDNA文库筛选到的目的基因克隆可在细菌中表达,获得有生物活性的蛋白质产物。第五,cDNA克隆可用于真核mRNA的结构和功能研究。,7.3.4 cDNA文库的局限性 首先,遗传信息远少于基因组文库,并受细胞来源或发育时期的影响。其次,不能直接获得内含子序列和编码区外的大量调控序列的结构与功能方面的信息。第三,低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例较低,分离也比较困难。近年来发
15、展了一些新的cDNA文库的构建方法和技术,例如,减数、标准化和染色体区域性cDNA文库的构建及目的cDNA的克隆等。这些文库的构建原则是使cDNA文库具有最大的代表性。,7.4 利用PCR 扩增目的基因 如果知道目的基因的全序列或其两侧序列,可合成一对引物,利用PCR有效地扩增出所需片段。为了克隆操作的方便或保证克隆后基因的方向正确性,常常对引物的5-端作修饰,如限制酶切点,启动子序列或起始或终止密码。经过PCR扩增后,添加的序列最终可整合到新合成的产物中,便于下一步的重组克隆和基因的表达和调控研究(图)。,7.5 基因的化学合成(自学),8 基因克隆的筛选策略 建库后,首要任务是筛选含目的基
16、因的克隆子。依据待分离基因或其产品的有关特性,如序列、功能、染色体上的位置和mRNA等,建立相应的方法。8.1 根据功能筛选 8.2 根据序列筛选 8.3 差别杂交及减法杂交法 8.4 差别显示法 8.5 功能结合法 8.6 DNA 插入诱变法 8.7 基因定位克隆法 8.8 分子间相互作用克隆法,8.1 根据功能筛选8.1.1 特异蛋白分离法 在特异蛋白测序的基础上进行。1)根据氨基酸序列遗传密码的简并性,人工合成特异简并探针或引物,筛选或PCR扩增相应基因。2)用纯化蛋白制备抗体,再用抗体筛选。8.1.2 功能互补法 利用克隆片段与寄主细胞染色体DNA在功能上的互补性直接分离目的基因。如将
17、“库”中的DNA片段分别导入突变体,找出能互补的序列片段。,8.2 序列克隆法8.2.1 已知基因序列或同源基因序列克隆法 根据已知基因或同源基因序列分离目的基因的最直接方法是用核酸探针进行杂交筛选。先从DNA序列数据库(GenBank)中查找基因序列,用以制备作探针或引物,筛选或扩增基因(图)。另,许多基因在种、属间高度保守。可用已知的同源基因制备探针或引物,筛选文库,再对阳性克隆测序,并与已知基因序列或同源性序列比对,最后经转化鉴定是否为待分离的基因。,菌落原位杂交,8.2.2 表达序列标签法 表达序列标签(expressed sequence tag,简称EST):一段含有足够信息以显示
18、出该基因与其他基因差异的特异序列,长100 500 bp。表达序列标签法(ESTs):利用EST寻找新基因的策略。基本步骤:测序 比对 筛选、分离目的基因。局限性:找极低或不表达的基因难;不能检测出内含子序列和调控序列;基因功能待鉴定;基因序列不全。,8.2.3 基因表达系列分析法 基因表达系列分析法(serial analysis of gene expression,SAGE)的主要优点在于一次可对大量基因的转录产物进行定量分析,从中找出新的基因。此法用来分离不同发育阶段和生理状态下差别表达基因,不需特殊仪器设备,只要PCR和测序。(1)原理:从转录物某一特定位置上分离得到一段9-10bp
19、的寡核苷酸序列标签(sequence tag,ST),含有确定一个独特转录物的足够信息量。理论上随机排列的9 bp片段可区分262 144(49)种转录物,而人类基因仅30 000个转录子。多个序列标签(ST)能以锚定酶(anchoring enzyme,AE,识别位点为4碱基的限制酶)识别位点序列相隔,连成双标签序列(ditag)的多联体,将该多联体序列克隆到一载体中,用连续,的方法进行多联体的序列分析,再通过计算机处理,确定每一种序列(ST)代表转录产物的种类和出现频率。因此,本法要求在计算机中建立一种注册和界定每个标签的方法。(2)过程:以mRNA为模板,利用连有生物素的oligo(dT
20、)作引物合成cDNA,然后以锚定酶切割,通过亲和层析分离cDNA的3端。将3端cDNA分成两等份,分别与接头A或B连接。两种接头均含一种标签酶(tagging enzyme,TE,识别位点与切割位点不一致,两者相距520 bp)的识别位点。然后以标签酶TE和锚定酶AE切割 cDNA,产生粘合TE、AE切割末端,并且都具有cDNA 910bp转录产物序列(ST)的短片段。将两部分cDNA短片段等量混合、相互连接,然后以两种接头特异的双引物A、B进行PCR扩增,形成两端含有TE、AE位点的双标签序列(ditag),用AE酶切,分离二聚体标签,连接,形成以AE位点为标界的ditag多联体,最后进行克
21、隆测序。通过序列比较,确定ST是否为未知序列。,8.3 差别杂交及减法杂交技术8.3.1 差别杂交法 构建文库后,如无可用探针,也无基因的序列信息,采用差别杂交法(differential hybridization)筛选目的片段,特别适于分离特定组织或特定发育阶段特异表达及诱导表达基因。差别杂交的技术原理十分简单(图)。,8.3.2 减法杂交技术 减法杂交(subtractive hybridization),又叫做差减杂交、扣除杂交、减数杂交或消减杂交,通过DNA复性动力学原理富集目的基因,并以此构建减数文库分离克隆目的基因。本质是尽量除去两种样品中共同存在的基因,使目的基因得到有效的富集
22、,以提高敏感性,尤其适于低丰度mRNA的cDNA克隆。l)mRNA减法杂交 从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录为cDNA,然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交,在两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA杂交分子,而特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链状态,将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列,如图。2)基因组DNA减法杂交(图),制成亲和探针,亲和层析,衔接头,8.4 差别显示法8.4.l mRNA差别显示 mRNA差别显示(mRNA differential display by PCR,DD-PCR)或称差别显示反转录PCR(different
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