旋光色散和圆二色光谱课件.ppt

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1、7旋光色散和圆二色光谱,OVERVIEW1.A molecule is optically active if it interacts differently with left and rightcircularly polarized light.This interaction can be detected either as a differential change in velocity of the two beams through the sampleoptical rotatory dispersion(ORD)or as a differential absorpti

2、on of each beamcircular dichroism(CD).,2.ORD spectra are characterized by，which is the specific rotation at a given wavelength，or the molar rotation.Both have units of degreecm2dmol1.CD spectra are characterized by A(the differential absorption of the two beams)or the molar ellipticity m，which at a

3、given wavelength is related to A.CD or ORD bands are often referred to as Cotton effects.These can be positive or negative.,3.CD is more frequently used than ORD because of superior instrumentation and the shapes of the CD curves.4.Very few chromophores are intrinsically optically active;those that

4、are active include the amides and disulfide cystine in proteins.Most optical activity of chromophores arises from optical activity induced by interactions with asymmetrically placed neighboring groups.,5.One of the main applications of CD spectra is based on their sensitivity to the secondary struct

5、ure of proteins.Other uses include detection of conformational changes and measurement of ligand binding.6.Optical activity can also be induced by the application of a magnetic field，which perturbs the energy levels of the system.This is the basis of magnetic circular dichroism(MCD).Unlike CD，MCD is

6、 largely insensitive to molecular conformation，but it is sensitive to the total concentration of MCDactive chromophores and their local environment.,7.1 引言早在十七世纪，Huggens就发现了光的偏振到了十九世纪，偏振光开始用于分子的旋光现象的研究Biot 1881 年发现石英能使偏振光的偏振面旋转，在松节油等液体和某些气体中也发现了这种效应。Biot 在发现旋光现象的同时，还观察到了电气石的园二色性。后来将旋光色散与园二色性这两种现象称为科

7、顿效应。,十九世纪中期，许多旋光性的定律开始公式化，并对十九世纪末有机立体化学和有机结构理论的发展起到了直接的推动作用。1934年，Lowry出版了第一本完整的有关旋光色散的书”Optical Rotatory Power”。1953年Djerasi实验室建立了第一台偏振光检测仪，从此ORD开始广泛地用于研究有机分子和生物大分子。六十年代，园二色谱逐渐取代旋光色散方法，成为研究生物大分子溶液构象的有力工具。,7.2 原理7.2.1 平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光当一束平面偏振光(Plane Polarized Light)通过某种物质传播时，若出射光的偏振面相对于入射光的偏振面旋转一定的角度

8、，这种物质称之为光学活性物质(Optically active substance)或手性物质(chiral substance)。这种性质则称为光学活性(optical activity)或手征性(chirality)。光学活性物质除使入射到它上面并通过它传播的平面偏振光的偏振面旋转一定的角度之外(称为“旋光”)，还会存在光吸收各向异性，称为“圆二色性(circular dichroism)。,活的生物体所含有的分子差不多都具有光学活性。小分子的光学活性来源于其结构的不对称性，特别是分子中存在的不对称的碳原子以及这些原子对附近生色团(chromophore)的影响。生物大分子的构象与其所表现

9、出来的生物活性有着密切的关系，因此旋光性和园二色性测量技术是研究生物大分子构象及其功能间关系的重要手段。,光是横波，其电场矢量E和磁场矢量H与光传播方向均垂直。若光波电矢量E(以及磁矢量H)取所有可能的方向，而没有一个方向较其他方向占优势，这种光称为自然光(图1(a)。由于光波产生感光作用主要是电场E引起的，因而一般就把电场矢量E为光波的振动矢量。该振动矢量与光波传播方向所决定的平面叫做振动面。当自然光入射到某些材料后，出射光就变为其振动面确定的光，叫做平面偏振光或线偏振光(图 1(b)。平面偏振光的电矢量E的方向和电传播方向所决定的平面，叫偏振面(Polarized plane)。,图 1.

10、Directions of the electric vector in polarized and unpolarized light.In unpolarized light(a)，or partly polarized light(c)，the oscillations take place at all angles perpendicular to the direction of travel;in polarized light(b)they are restricted to one angle.,如下图所示两个频率和振幅相同，偏振面互相垂直的平面偏振光，如果其相位差90，则它

11、们合成为一个圆偏振光。,图2 左旋园偏振光,图3 右旋园偏振光,图4 椭园偏振光,E0,j,i,一束平面偏振光可以分解为两束振幅、频率相同，旋转方向相反的圆偏振光(Circular polarized light)，如图 所示E=E0cost=j E0 cost=Er+ElEr 1/2(+iE sint+jEcost)(5)El 1/2(iEsint+jEcost)(6)其中 E为平面偏振光电场矢量的振幅，为其角频率，i和j为轴和轴上的单位矢量。右旋园偏振光的电场矢量Er 之端点在空间的轨迹是以光的传播方向为轴的左手螺旋，而左旋园偏振光El之端点在空间的轨迹是以光的传播方向为轴的右手螺旋，它们

12、的振动面随时间而旋转。,一个平面偏振光可以用下面的方程表示:E=E0 cos t=j E0 cos t i，j分别为X，Y座标轴方向上的单位矢量。,7.2.2 旋光(Optical Rotation)、旋光色散(Optical Rotatory Dispersion，ORD)和圆双折射(Circular Birefrigence)。光在通过不同物质时，其传播速度会发生改变，定义光在真空中的速度C0与在某种物质中的速度v之比为折射率n，即n=C0/v。如果某种物质对于左旋偏振光和右旋偏振光的折射率nlnr，则左旋光和右旋光的旋转速度会有所不同，它们的和与原来没有样品时相比旋转了一个角度(见图)，

13、这种现象称为旋光。面对入射光，使入射光的偏振方向顺时针旋转的物质叫右旋物质，使入射光的偏振方向逆时针旋转的物质叫左旋物质，习惯上用+号表示右旋物质，用号表示左旋物质。,对于光学各向异性物质，它对左旋园偏振光和右旋园偏振光的折射率nl和nr是不同的，二者之差=nl nr 称为圆双折射。由于 c:为真空中的光速，v:为光在介质中的速度，因此某种物质存在圆双折射，入射的平面偏振光之左旋分量和右旋分量将以不同的传播速度通过介质，通过该物质后，两者之间存在一定的相位差，若该介质对左旋分量和右旋分量的吸收相同，出射的两束圆偏振光分量将重新合成平面偏振光(而不是圆偏振光或椭圆偏振光），如图6（b）所示，其偏

14、振面与入射平面偏振光之偏振面间的夹角为。,图 6(a)园二色的产生：样品对左旋L和右旋R两个园偏振分量吸收不同，合成为椭圆偏振光；（b）园双折射和旋光现象：样品对左旋和右旋偏振光的折射率不同即L和R在样品中的速度不同。合成的平面偏振光之偏振面旋转了角。,经过推导可得到:(弧度)(度)式中为样品厚度，为光波波长。由此我们看出，旋光现象就是一种圆双折射，旋光性的本质就是旋光物质具有两个不同的折射率。,平面偏振光通过样品后其偏振面旋转的角度obs。与光穿透的样品厚度l、溶液样品中旋光性物质的浓度c成正比(在一定的浓度范围内)，且与该光波长、样品温度T有比例系数T称为比旋(The specific r

15、otation)或旋光率。,旋光可用比旋T表示，也可用摩尔比旋(the Molar Rotation)T 或克分子旋光度表示，二者间的关系为:其中 MW是溶质的分子量，单位为克/摩尔，摩尔比旋的量纲为度厘米2分摩尔1。l为光径，单位为分米(dm)，C为浓度，单位为克/毫升。,在生物大分子的研究中，还常用平均残基旋光度(average residue rotation)，其定义为 MRW 100其中 MRW 为平均残基分子量(mean residue weight)，即蛋白分子量与残基数之比 MW MRW 残基数 对一般的蛋白质分子，该值约为110-115。,对于同一物质，比旋 或摩尔比旋 与入

16、射偏振光的波长有关，比旋 或摩尔比旋 与波长间的函数关系称为旋光色散。,7.2.3 圆二色性(Circular Dichroism)和椭圆率(ellipticity)当一束光穿过样品时，光的强度呈指数规律下降，服从Beer-Lambert定律。log10(I0/It)=C l 其中I0是入射光的强度，It是穿过样品后的光强度，C是样品浓度，l是光径，是消光系数(extinction coefficient)。令A=log10(I0/It)=C l A称为吸收度(absorbance)或光密度(optical density)。,当一束平面偏振光通过光学活性介质传播时，由于介质对二分量的消光系数

17、l和r不等，即对左旋光和右旋光的吸收不同，一束平面偏振光通过该样品后，其左旋分量和右旋分量强度不再相同，它们的和就不再是平面偏振光而是椭圆偏振光。这种现象就叫做“圆二色(circular dichroism)“（图6a）。,由于存在圆二色性，平面偏振光通过光学活性介质后，两圆偏振分量电场矢量的大小不同了(实际上，由于同时存在圆双折射，因此二者位相也不同)，这样两个大小不同的圆偏振光合成的不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光(elliptically Polarized light)，其电场矢量端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的椭形螺旋(elliptical helix)，其振动面随时间也是连续旋

18、转的(图 4)。,我们可以通过进一步的分析来理解园二色现象。如果 lr，则通过光学活性物质的样品后，左旋分量的振幅不再等于右旋分量的振幅。假定左旋分量ElEr 1/2(+i Er sin+j Er cos)El 1/2(i El sin+j El cos)Er+Eli(Er El)sin+j(Er+El)cos 这个光的电场矢量的端点轨迹是一个椭圆，即通过光学活性物质的样品后，左旋和右旋偏振光的和不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，椭圆的长轴在j方向上，长轴为Er+El，短轴在i方向上，短轴为Er El。,圆二色可用吸收度差A或消光系数差来表示:A=Al Ar称为圆二色性()。有的文献用摩尔消光

19、系数表示圆二色性=l r(Al Ar)Cl 上式中l和r分别为左右旋分量的摩尔消光值(molar absorbance)。,园二色性的大小也可用椭圆率来表示。椭圆偏振光电场矢量端点在空间的轨迹投影到垂直于光传播方向的平面上为一椭圆，此椭圆的短轴(the minor axis)a 与长轴(the major axis)b 之比的反正切称为椭圆率:a tg-1（弧度）b 由理论分析可推出椭圆率和圆二色性间的关系为 180 2.303(Al Ar)(度)4,与旋光度对应，在实际工作中，还常用比椭圆率（specific ellipticity）、摩尔椭圆率(molar ellipticity)和平均残

20、基椭圆率MRW（the mean resicue ellipticity）:=其中为测得的椭圆率，单位为度，MW为分子量，单位为克/摩尔，MRW为平均残基分子量，l为光径，单位为分米，C为浓度，单位为克/毫升，的单位是度厘米2分摩尔-1。,当不存在圆二色性时，即l=r 时，椭圆的短轴为零，变为在长轴方向的直线，这正是前面讨论过的平面偏振光，不过偏振面相对于入射光偏振面旋转了角度。,724 科顿效应(Cotton effect)在光学活性物质的整个吸收带内，其旋光色散曲线(ORD)呈 S形，而相应的圆二色性曲线(CD)呈钟形，这种ORD在吸收带附近的异常效应和圆二色性在吸收峰处具有极值的现象称为

21、科顿效应(图7)。ORD 曲线在较长波长一侧有一峰的科顿效应称为正的科顿效应，而此侧有一谷的称为负的科顿效应 图7。正的科顿效应具有正的 CD 曲线，其峰位在 S形 ORD曲线的凸到凹的转折点。,图 7(a)正的科顿效应(b)负的科顿效应（参考书图104）,从图中可以看出：CD谱带比ORD有更好的分辨率，但ORD谱带的两翼看到的信息可能是CD无法直接看到的。此外，ORD谱是一种色散曲线（反映了折射率随波长的变化），因此它与折射系数的符号在吸收峰附近的变化有关。,从图中还可以看出：CD谱带比ORD有以下三个优点：（A）CD谱带比较容易辨认，因为一个有光学活性的电子跃迁，其ORD是一个色散曲线，而

22、CD谱只有一个单相的谱峰。（B）ORD色散曲线分布的波长范围比CD谱宽，即其分辨率不如CD谱高。（C）CD谱在检测技术上比ORD更方便。这一点将在仪器部分介绍。,7.2.5 旋光色散与园二色谱的关系：Kronig-Kramer变换式CD谱与ORD谱是相互关联的，实际中，这两种现象总是同时发生的，它们之间的关系可以用Kronig-Kramer变换式表示:()20()d 2()2 2()2 0()d 2()2,7.2.6 THE PHYSICAL BASIS OF OPTICAL ACTIVITYAs we discussed in Chapter 2,transitions from the g

23、round state to the excited state involve a displacement of charge.A linear displacement with an electric transition dipole moment is denoted by.The transition can also have a circular component;this(rotating current)then generates a magnetic dipole moment m perpendicular to the plane of the circular

24、 motion(see Figure 8(a).,Optical activity requires a finite and a finite m.This corresponds to a helical displacement of charge.The result is that left or rightcircularly polarized beams then interact differently with the molecules in solution.These interactions do not average to zero even in molecu

25、les randomly oriented in solution(compare Linear Dichroism).(The magnitude of the transition is proportional to the vector product of and m).,The required helical displacement of charge may arise from the intrinsic nature of the chemical bonds,for example,in an n*transition(see Figure 8(b).Chromopho

26、res that have intrinsic optical activity are often termed asymmetric.The required helical displacement of charge may also arise from an induced effect because of the environment of the molecule undergoing the transition.The resulting optical activity is then often referred to as an extrinsic Cotton

27、effect.,Figure 10.6(a)A helical displacement of charge can be considered to comprise a linear displacement plus a circular displacement.(b)Rotation and translation of charge in an orbital.,OPTICALLY ACTIVE CHROMOPHORESOptical activity is observed only when the environment in which a transition occur

28、s is asymmetric.An inherently asymmetric chromophore,such as the peptide bond,is always optically active irrespective of the surrounding groupswhich can,however,modify its optical properties.,In contrast,any optical activity from inherently symmetric chromophores is induced and results from interact

29、ions with asymmetrically placed neighboring groups.The sign and magnitude of the induced optical activity(Cotton effects)of a particular chromophore depend on the local environment.,Very few chromophores are inherently optically active.In proteins,apart from the amide chromophores(240 nm),only the d

30、isulfide cystine is intrinsically optically active.The positions of the CD bands from the disulfide are found in the range 240-360 nm.Their CD spectra are complex to interpret and depend on the SS dihedral angle and the interactions with neighboring groups.They are not usually resolvable from the in

31、duced CD bands of the normally optically inactive aromatic side chains,which occur in the range 250-310 nm.Induced optical activity is also observed in the heme absorption transitions of most hemeproteins and for the metal absorption bands in most metalloproteins.,In nucleic acids,the individual bas

32、es of DNA and RNA are not optically active,but their incorporation into nucleosides or nucleotides results in induced optical activity.These effects depend on the nature of the base and the glycosidic linkage.,Carbohydrates generally absorb only in the far ultraviolet,but as instrumentation is impro

33、ved,there will be more applications in this field.In polysaccharides,both the nature of the individual sugars and the linkages between them are important in determining the optical activity.,三、仪器原理 物质光学活性研究，既可以通过旋光色散(ORD)谱的测量进行，也可以通过园二色性(CD)的测量进行。但是，CD 谱较 ORD 谱有明显的优点，其谱带与吸收带重迭，分子中不同生色团对于谱的贡献比起在ORD 中

34、可以更容易分辨，而在ORD 中任意波长处的旋光性是分子中所有生色团色散贡献之和。其科顿效应又与吸收峰不一致，解释起来有较大困难。,由于科顿效应曲线总是发生在光学活性物质的吸收带附近，这时光学活性物质也总是表现出园二色性，因此近年来园二色性研究已基本取代了旋光色散研究，这里也仅介绍园二色性测量的仪器原理。园二色性测量，实际上是测量样品对左旋偏振光和右旋偏振光吸收率的差值A=ALAR,由公式2.303(ALAR)可以计算出椭圆率，进而由公式可以得到摩尔椭圆率。,只要将频率、强度完全相同的左、右旋偏振光交替地通过样品，分别记录样品对它们的吸收值，由式A=ALAR即可得到该频率下的圆二色性和椭圆率的值

35、，逐渐改变左右旋偏振光的波长，即对波长进行扫描，即可得到圆二色谱(随的变化曲线)。,圆二色测量谱仪的结构框图,光源（S）一般为氙灯，功率在500 W左右，在可见波段具有足够的光强，且称连续谱。紫外波段虽强度下降，但直至185 nm，仍有相当的强度，是较理想的光源。单色仪（MC）的用途是使光源发出的各种波长的光按要求成为单一波长的光波。起偏器（P）的作用是使单色光成为平面偏振光。,调制器（M）受程序控制系统的控制，使透过的光以一定的频率交替地变为左旋和右旋园偏振光。一般来说，这种调制器是由某种压电晶体制成的晶片制成的，晶片两面镀上电极，两电极之间加上一交变电压，交变电压的电压值按照一定的频率周期

36、性地变化时，晶片的厚度也随之变化。仪器的设计使交流电压的峰值处获得园偏振光。当电压通过其正、负峰值时，可以交替地得到左、右旋园偏振光。,从调制器出来的左旋和右旋园偏振光通过样品后，由检测器（PD）进行检测，然后输入放大器（Amp.）和相敏检测器（PSD），由放大器出来的信号的直流分量和由相敏检测器出来的信号的交流分量在运算单元中进行计算，得到A，最后输入数据记录系统。,A的测量和计算方法前面已经介绍：A=ALAR由于吸收率A式中I0为入射光强度，I为出射光强度,由于入射的左、右旋园偏振光的强度是相等的，因此I0LI0R由于IR与IL相差很小，A很难测定。实际仪器中是将平面偏振光引入调制器，调制

37、器是加一高频交变电压。选择适当的交变电压和调制器，使得在交变电压的峰值处获得园偏振光，当电压通过其正、负峰值时，可以交替地得到左、右旋园偏振光。当光学活性的物质插入这园偏振光的光路中时，通过样品后的光强度随时间的变化如下图，强度变化的频率与外加电压的频率相同。,如果AL AR，则IR IL，即通过样品后的右旋园偏振光的强度大于左旋园偏振光。当强度这样变化的光照射到光电倍增管上时，输出信号中含有AC分量IAC和DC分量IDC。IACIRILIDC,如果AL AR，则IR IL，即通过样品后的右旋园偏振光的强度大于左旋园偏振光。当强度这样变化的光照射到光电倍增管上时，输出信号中含有AC分量IAC(

38、图中S)和DC分量IDC(图中IA)。IACIRILIDC,当x1，,这样，,这样，求出 就得到了A，也就得到了。现代化的 CD 谱仪，只要将仪器调整到正常工作状态，置样品于光路中，启动仪器，即可自动进行波长扫描(在设定的频率区间)，得到 CD谱。,7.4 园二色谱的生物学应用举例,7.4.1 氨基酸和多肽的园二色性氨基酸分子内的紫外生色基团有吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键，咪唑基和羧基。当这些生色基团受到不对称碳原子或其它不对称结构的影响时，在它们各自的吸收区域里表现出圆二色性。研究氨基酸（主要是芳香族氨基酸和胱氨酸）以及它们的衍生物的CD性质，为研究蛋白质的CD 谱提供基本的材料。同时，活性

39、肽有重要的生理功能，因此肽的构象与功能的关系是重要的分子生物学课题。肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了许多重要的信息。,氨基酸的圆二色谱7.4.1.1.1 酪氨酸及其衍生物的近紫外CD谱酪氨酸及其衍生物在中性水溶液中的CD谱都在275 nm左右显示CD峰。下图表示 N-乙酸酪氨酸酰胺在水溶液中的CD谱。275 nm左右的峰可正可负，视模型化合物以及所用溶剂而定。在水溶液中，CD峰处的椭圆值在660到660间，比一般蛋白质中每个酪氨酸残基的CD贡献要小得多。,在有机溶剂中或在低温下，酪氨酸及其衍生物的CD峰值显著增大。Strickland等得到在低温下酪氨

40、酸衍生物在有机溶剂中的CD谱，它们能清楚地显示酪氨酸 CD谱的振动结构。但即便在室温下的水溶液中，一般酪氨酸衍生物的CD谱仍能显示一峰一肩（见下图），肩在峰的长波长一侧。溶剂组成的改变能影响谱带的位置。酪氨酸酚羟基如和其他质子受体组成氢键，则其CD谱会产生较大的红移。,有些酪氨酸衍生物如N-乙酰-O-甲-酪氨酸乙酯在甲基环己烷中显示的CD谱形和其吸收谱形几乎完全一样，这说明这个化合物在此溶剂中以单一的构象子（Conformer）存在，但有许多模型化合物在溶液中以处于平衡状态的多个构象子存在。每个构象子的CD谱各不相同，有正有负。这些CD谱叠加起来，使得观察到的CD谱和吸收谱不一致的情形出现。酚

41、羟基在碱性溶液中解离时，给出290 nm以上的CD峰，峰形和峰位与其吸收谐相似。,色氨酸及其衍生物的近紫外CD谱色氨酸的近紫外CD谱波长位置不大受溶剂条件的影响，一般在288-292 nm间。溶剂对波长位置的影响，氢键的形成，使色氨酸及其衍生物的C D谱出现多种多样的情况。,苯丙氨酸及其衍生物的近紫外CD谱由于苯环的高度对称性，苯丙氨酸侧链的CD值和上述两个芳香族氨基酸相比要小得多（见上图）。典型的苯丙氨酸模型化合物的CD谱在250268 nm间显示多个振动能级峰，尤其是268 nm谱段，在室温下也能显示陡直的峰形。,7.4.1.1.4 芳香族氨基酸以及它们衍生物的远紫外CD谱芳香族氨基酸以及

42、它们的衍生物在250 nm以下都有较强的CD贡献（下图），在这个区域内，苯丙氨酸的CD值和酪氨酸或色氨酸的相差不多，这和近紫外区域的情况形成对照。在酪氨酸的各种模型化合物中，226 nm左右的CD峰总是正的。,，N-乙酰酪氨酰胺；-，N-乙酰苯丙氨酸胺；，N-乙酰色氨酰胺,7.4.1.1.5 胱氨酸及其衍生物的紫外CD谱胱氨酸在水溶液中的CD谱中，近紫外区的负峰归属于二硫键，远紫外区的正峰归属于羧基贡献。和其他氨基酸的羧基贡献比，此正峰出现在较长的波长位置上，这可能是由于羧基和二硫键两个基团电子的相互作用，因而降低了羧基跃迁的能量；也可能由短波长区域的二硫键的强负CD峰的存在造成。胱氨酸的各种

43、衍生物在水溶液中也显示相近的CD谱。,二硫键是个具有不对称的生色基团，其正常的双面角接近90，有右手(P)和左手(M）两种旋转构象，在胱氨酸及其简单衍生物的溶液中，二硫键以几乎等量的P和M构象存在，因而它们的CD贡献互相抵消，即二硫键的固有不对称性并不对CD谱作出贡献。胱氨酸及其简单衍生物的 CD谱只来源于不对称碳原子对二硫键的扰动。胱氨酸以晶体形式存在时，其二硫键只能采取某一种构象。对它的晶体所作的CD研究显示，波长最长的CD 谱段可能与二硫键的手征性有关，即 P构象显示正 CD峰，M构象显示负 CD峰。,7.4.1.1.6 脯氨酸衍生物的CD谱核磁共振研究说明，X-Pro酰胺键存在反式一顺

44、式异构现象。Madison和Schelman在对N-乙酸脯氨酸一N，N-二甲基酸胺（AcProDMA）的研究中，计算得到了反式与顺式的不同 CD谱（见下图）。在水溶液中，AcProDMA主要以反式异构体存在，在非极性溶剂中主要以顺式异构体存在。上述结果对研究含有较多脯氨酸残基的肽的CD行为和多聚脯氨酸螺旋构象是很有帮助的。,7.4.1.1.7 其它氨基酸的紫外CD谱在近紫外区，其它氨基酸均无 CD贡献。在远紫外区，组氨酸侧链在213 nm显示正峰；其余的氨基酸一般在200210 nm间显示正峰（下图），此为羧基所贡献，pH值升高使此峰蓝移。,7.4.2 用园二色谱研究多肽和蛋白质的二级结构7.

45、4.2.1 多聚氨基酸的远紫外园二色谱 利用旋光色散研究蛋白质的构象虽然有过较大的进展，但是存在两个困难。首先是在旋光色散谱中，科顿效应的极值都在吸收带极值的旁边，而不在吸收带的顶端，这对分析科顿效应的归属带来了困难。其次是残基本身有旋光值。要讨论ORD与构象关系时，有必要将残基的旋光扣除。但是我们只能测出氨基酸的旋光值而无法测出残基的旋光值，因此这种扣除是很困难的。这两个缺点是ORD自身的性质所决定的。,Holzwarth与Doty发表了他们利用圆二色谱来测定多聚氨基酸和肌红蛋白的构象的工作以后，就逐渐有一些工作者从旋光色散转向用圆二色性来研究蛋白质。六十年代初，一般仪器只能测出波长大于25

46、0 nm的CD谱，因此进展不大。后来仪器的改进能够测出波长范围在190250 nm的CD谱。由于这一区域的谱线与蛋白质分子主链构象有密切的联系，于是吸引了许多科学家应用CD来研究蛋白质。,相应于ORD的缺点，CD谱有许多有利的方面。首先它的峰或放样的位置与吸收峰的位置基本重叠，因此每一个谱峰的贡献者是谁可以利用吸收光谱的知识来寻找。其次是肽键上与碳原子有关的共价键的吸收光谱带在红外区，或在低于180 nm的超远紫外区。在可见波长或紫外区它与碳原子相关的价电子不表现出任何吸收带，因此也没有它的CD带。这样，残基除非有生色团的侧链，不然就不提供CD谱。可以看出 ORD的缺点在CD谱中就可以避免。,

47、多聚氨基酸从化学上讲比蛋白质简单，只含一种或几种氨基酸，因此研究它们的构象比较容易。许多人曾详细地用其它方法（如红外等）研究过它们的构象，了解到在何种条件下，它们以哪一种构象存在，因此，蛋白质的CD谱可以以多聚氨基酸为模型化合物来着手研究。,用许多其它方法证明，多聚-L-赖氨酸（PLL）在 pH不同时有不同的构象。在水溶液中。pH 11，室温时，它是螺旋；pH 11，52C加热 15分钟后即转变成 折叠；而在pH 5.7时，它是无规卷曲。Greenfield与Fasman利用这一特点测定了PLL在不同构象状态下的CD谱，其结果如下图。,对于 螺旋讲，它的曲线与 PMLG、PLA等相同，也是双负

48、峰。Holzwarth等人证明，谷氨酸、赖氨酸与丙氨酸的共聚物在螺旋时也是呈相同曲线。此后Beychok测定的多聚氨基酸的CD曲线也相同。因此认为，远紫外双负峰是螺旋的典型谱形。Gratzer与Cowburn总结了 1969年前的工作指出，222-223 nm间的负峰是肽链处于螺旋时肽键n-*跃迁所贡献。但是极值处的数值在不同的实验室利用不同的多聚氨基酸，大约有10的差别。,208-209 nm的负峰也是螺旋肽键的*跃迁所贡献，各家的数据可以有25的波动。对于191 nm讲，它也是螺旋的肽键*跃迁的贡献，比椭圆值间可以有30的波动。事实上，数值间的这种差别是不算大的，结果相当满意。,PLL于折

49、叠时给出的曲线是在215 nm处的负峰。在中性pH时的SDS溶液中，PLL也呈现折叠。此时它的CD谱在218 nm有负峰，但218相应变小。许多工作者也发现，结构的CD谱与溶剂有较密切的关系，因此相应地看，折叠的椭圆值不如螺旋者那样恒定。但是从谱线形状看，图63曲线2是典型的。基于这种种实验基础，一般都认为，该曲线反映了多聚氨基酸的折叠结构。,无规卷曲时PLL给出的曲线是198 nm的负峰,在 220 nm附近一个小而平宽的正峰。这种峰形是否能典型地代表无规卷曲，看法有些混乱。Tiffany及 Krimm（1969）发现 Na-PLGA（多聚-L-谷氨酸钠）在水溶液中给出正峰，但在3摩尔升胍中

50、该峰消失，变成了218-220 nm处的负肩，见下图。,Dearborn与 Wetlaufer测定摩尔升胍（PH 6.0）中PLL的CD谱，发现它的谱形与在0.01摩尔升NaCl中的一样，也是无规卷曲状。Fasman等人研究了Na-PLGA和PLL做成干膜时的圆二色谱。他们（1970）发现，在200-205 nm有一负峰，同时在215-310 nm间有一负的肩。此外，Wetlaufer等及 Fasman等都发现，一些变性蛋白质的谱形与PLL在溶液中的谱形不完全一样。总的来看，这些变性蛋白质的结果与PLL的曲线有两点区别：一是负峰位置不正在198 nm，而经常有红移，峰值也小得多。二是220 n