新型纳米载体固定化酶的研究.ppt

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1、,新型纳米载体固定化酶的研究,纳米颗粒是有机或无机材料构成的亚微米基团（尺寸分布在1-100nm之间）,什么是纳米材料？,？,自然界中的酶至少有70万种,而实现工业应用的仅上百种。因此,在开发利用酶资源方面,可以说才刚刚起步,潜力巨大,迫切需要克服影响酶工业化应用的障碍,实现酶的高效利用。这不仅需要使单个酶在各个体系(水相、油相、油水界面等)发挥其最高活性,而且需要实现酶的重复利用、实现多酶的协调反应和辅酶再生。近年来,随着纳米科学和纳米技术的迅速发展,有望利用纳米技术实现上述关键技术的突破。,1.理想载体材料应具备哪些特点？2.决定酶催化特性的因素有哪些？,主要内容介绍,纳米载体固定化酶,2

2、.纳米载体固定化酶的方法,1.酶纳米载体的种类（磁性纳米粒子用于固定化酶的研究）,3.纳米载体的特点及纳米载体固定对酶性质的影响,4.纳米酶催化剂的优点及纳米技术在酶催化应用中的进展,5.纳米载体固定化酶的应用与挑战,一、酶纳米载体的种类,金属纳米载体,有机纳米载体,非金属无机纳米载体,复合物纳米载体,酶纳米载体,（按材料性质分）,颗粒型纳米载体使用得较为广泛,磁性纳米粒子用于固定化酶的研究,磁性粒子是一类新型的固定化酶载体材料，具有生物相容性好和固定化酶易从反应混合物中回收等优点。无机磁性纳米粒子应用较多的是。此类载体的核心由磁性纳米颗粒组成，外面包被有一层有机或无机分子的壳，通过这种表面修

3、饰的方法可以在载体表面引入多种反应性功能基团（如羟基、氨基、巯基等），因此该载体可以连接酶、抗体、核酸等生物分子，已被广泛地用于生物学和医学研究。,1.决定磁性纳米颗粒的磁学性能的两关键因素小尺寸效应、表面效应尺寸效应当纳米颗粒小于单磁畴临界尺寸时，止血颗粒能分散的最好；表面效应颗粒粒径达到纳米级时，其具有巨大的相对表面积，也使大部分原子都处于颗粒表面，致使其具有更高的表面活性。磁性纳米颗粒具有较大的表面原子/体内原子比，其表面自旋会显著影响磁化能力。,2.磁性纳米的表面修饰在利用磁性Fe3O4纳米颗粒作为固定化酶载体前必须对其提供适当的表面包被和有效的保护措施以保持它的稳定性，并可以引入各种

4、功能基团以满足特定的应用环境。该方法主要包括利用有机分子、聚合物、生物分子、无机分子嫁接，包被Fe3O4纳米颗粒。,Fe3O4,表面修饰的材料和方法,3.应用：磁性生物分离和检测；临床诊断和治疗；药物靶向运输；固定化酶载体,二、纳米载体固定酶的方法,吸附法：将制备好的纳米颗粒或其他纳米载体直接加入含有一定浓度酶液的缓冲溶液，在合适条件下纳米载体可以通过静电作用或与氨基酸残基侧链基团之间的特异性结合而将酶分子牢固吸附到纳米载体表面,如金特异性地结合氨基酸残基侧链的巯基和氨基;镍离子特异性地结合蛋白质末端的多聚组氨酸“尾巴”。【优点】操作简单,是目前应用得较为广泛的一种固定化方法,尤其是用于各种酶

5、传感器的制备。用纳米材料制备的各种酶传感器,能显著提高生物传感器的检测极限,增强检测的特异性,缩短电极响应时间。包埋法将酶与聚合物单体在一定的条件下混合,聚合物单体之间发生聚合交联的过程，就可以将酶分子固定到高分子聚合物中;或者是将酶分子包裹在多孔的单分子膜中,形成微胶囊型纳米颗粒。【优点】包埋效率高；固定化稳定性好，酶分子与纳米载体不易解体分离,；对酶结构的完整性也没有显著的影响,；酶的半衰期长达143 天,共价结合法：酶和纳米载体以共价键的形式结合在一起,这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。1）直接结合法纳米载体必须携带有能与氨基酸侧链基团发生反应的相应基团,如C60的各种

6、衍生物就可以直接固定各种酶蛋白;2）间接结合法间接法是先在纳米载体颗粒的表面包被上一层携带有活性基团的聚合，或者先将纳米颗粒用具有活性基团的材料胶囊化,然后再与酶分子共价连接。【优点】能有效地防止酶与载体的解离,从而防止酶的丢失;并且有助于防止酶的变性,增强其稳定性。【缺点】反应过程中酶的活性位点被隐藏或限制了活性位点与底物的结合,将不可避免地导致酶活性一定程度的降低。,三、纳米载体的特点及纳米载体固定对酶性质的影响,（一）特点：表面积大、体积小；表面自由能高；易于将酶与底物和产物分离；提高酶的生物相容性、免疫活性和稳定性。（二）对酶性质的影响：1.对酶活力和稳定性的影响与传统材料相比，纳米结

7、构能使酶在不同体系长期保持活性稳定,2.对酶特异性的影响纳米材料巨大的比表面积、充足的表面功能化基团,尤其是单层受保护的纳米粒子,会使酶活力提高很多。Eg：在空间位阻和静电的共同作用下,结合在表面用烷基硫醇-四(乙二醇)乙酸单分子膜功能化的纳米金颗粒表面的-胰凝乳蛋白酶,表现出了很明显的化学选择性:对携带正电荷的底物表现出很强的亲和性,有较高的催化活力;对携带负电荷的底物仅表现很低的亲和力和催化活力;对中性底物的亲和力和催化能力居中。3.对酶结构和功能的影响一般来说,纳米材料固定化对酶结构和功能基本上没有太大的影响,都能够保持其完整性;有些可以通过在纳米材料表面偶联一些特异性的配体,调控酶的结

8、构和功能,四、纳米酶催化剂的优点及纳米技术在酶催化应用中的进展,。,（一）纳米酶催化剂的优点：降低酶固定化时的变构,保持酶的稳定性；纳米颗粒的布朗运动使纳米固定化酶和底物频繁碰撞,大幅度提高催化效率，且纳米结 构提高水相、有机相、油-水界面的催化效率；使伴随辅酶再生的多酶催化体系成为可能；微反应器的设计使纳米酶的回收利用成为可能,将带来更大的工业应用优势。,（二）、纳米技术在酶催化应用中的进展,纳米技术能够实现酶的稳定固定化.纳米颗粒的尺寸对酶的固定结构有很大影响粒径越小，颗粒表面的曲率越大，酶与颗粒表面的接触面积越小，就不容易使酶变构失活。.纳米颗粒显示了显著的尺寸效应颗粒越小,布朗运动速率

9、提高,和底物的碰撞频率迅速提高,从而提高了催化效率。.纳米凝胶的柔性微环境能使酶发生柔性变化，从而和底物更好地结合；同时由于是纳米尺寸，底物很容易从外扩散到酶附近。可以认为，纳米颗粒对酶的活性保持有利于我们进一步了解细胞内纳微结构和环境对酶活性的影响，为设计仿生材料和环境提供新思路。2.纳米技术能够保持酶在有机相中的稳定性.由于限制了酶变构,因此固定化酶在有机溶剂中仍能保持高的活性；.纳米孔也对酶结构有很好的稳定作用。与平坦的表面相比,纳米孔的高曲率能够有效地维持酶的结构,使酶得到稳定固定化,从而保持高的酶催化活性。,（A:由于酶和纳米孔的表面曲率相似而能实现多键结合;B:酶与平面载体以单键结

10、合）,（图）纳米孔稳定纳米酶示意图,3.纳米技术能够实现油-水界面催化酶应存在于相界面才能高效地实现催化;而一般酶往往是溶于水相或油相。.利用疏水性高分子材料(如聚苯乙烯)修饰水溶性酶,通过合理设计聚苯乙烯的分子量,可以获得两亲性的酶,该两亲性酶能自组装于油-水界面,减少反应传质阻力，提高界面自组装酶的催化活性。.疏水性纳米材料的固相界面能使酶在油-水界面更加稳定。,（图）单壁碳纳管修饰的大豆过氧化物酶()和天然酶()在油水两相中的稳定性,4.纳米技术能够实现多酶催化反应体系的构建目前,在工业上获得应用的基本为单酶体系。有很多反应体系需要同时使用酶和辅酶,而辅酶往往非常昂贵,如果不能使其再生,

11、则难以在实际生产中获得应用。现用的两种方法：,.将两种酶与辅酶共同固定在纳米孔内,辅酶在两种酶之间穿梭,一种酶与辅酶的还原态共催化生成产物1,另一种酶则与辅酶的氧化态共催化生成产物2。这种设计不仅实现了辅酶再生,而且可以同时获得两种重要产品。由于纳米孔尺度小,辅酶依靠热振动就能在两种酶之间穿梭。同时,纳米孔还能使酶稳定.多酶体系也可以利用纳米颗粒来实现,将分别固定了酶和辅酶的纳米颗粒混合,依靠纳米颗粒的布朗运动来实现酶和辅酶的共催化以及辅酶再生。,（图）包括辅酶再生的纳微结构多酶催化体系设计。,【(左)酶-辅酶通过由布朗运动驱动的纳米粒子之间的碰撞发生相互作用并催化生物转化反应;(右)纳米粒子

12、被包埋在多孔微胶囊的内部形成微反应器,既能保证底物与产物的自由出入,又避免直接利用纳米粒子所带来的催化剂回收利用困难的问题。这样的催化体系可灵活应用于诸如固定床和悬浮搅拌反应器中,适于工业放大生产过程】,五、纳米载体固定化酶的应用与待解决的问题,（一）应用：纳米材料由于其结构的特殊性,表现出许多独特的理化性能和生物学特性,被广泛应用于生命科学的许多领域,如酶的固定、蛋白质的分离纯化、药物载体、核酸载体、核酸的分离纯化、生物传感器等（二）待解决的问题：1.材料表面纳米结构对酶稳定性的影响规律；2.基于酶的特性设计最佳的界面纳米酶；3.纳米酶的回收利用；4.多酶体系的系统集成、匹配和高效化；5.重要多酶体系的产业化应用；,