基因工程DNA诱变.ppt

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1、第十章 DNA诱变,突变是研究基因结构与功能的最基本手段。,经典方法：分离自发突变体或用物理、化学诱变剂处理活体来获得突变，再根据突变体的表型，采用遗传学方法鉴定相应基因。体外诱变：对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，从而获得突变基因，用于基因工程、蛋白质工程等研究。,定向进化的原理,第一节 随机诱变,体外随机诱变：指随机地在克隆化DNA中引入碱基置换突变。,特点：不需要有序列针对性的合理设计，引入突变的位置随机；结果：在目的DNA片段中引入大量的序列多样性；方法：错误掺入诱变、增变菌株诱变、盒式诱变、化学诱变；用途：诱变基因的编码区，改变氨基酸序列，从而改造蛋白质的性质或活性，得

2、到符合需要的蛋白质。,定向进化：对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质，又称为试管进化。,一、错误掺入突变,概念：在体外DNA扩增中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，又称易错PCR（error-prone PCR）。,error-prone PCR的实质：通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率，降低聚合酶固有的突变序列倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。,易错P

3、CR采用的方法：,增加MgCl2浓度到7mM，稳定非互补的碱基配对；加入0.5mM的MnCl2，Mn 2+能降低聚合酶对模板的特异性；增加聚合酶量到5U，促使在错配碱基处继续延伸反应；限定4种碱基中的一种，通常为正常浓度的1-10%，在缺乏正确核苷酸时，DNA聚合酶经短暂停顿后，会插入另外3种可用核苷酸的一种；3种为正常浓度的正常碱基，第四种为次黄嘌呤dITP（可与C、T、A配对）；增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误掺入；使用突变DNA聚合酶，如Mutazyme。,二、盒式诱变,盒式取代诱变 混合寡核苷酸诱变,盒式取代诱变,种类,简单的盒式取代诱变是通过限制性酶切除去特定的双链DN

4、A片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接,得到取代突变，是一种定点诱变。,混合寡核苷酸诱变,混合寡核苷酸诱变：若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。,三、增变菌株的诱变作用,概念：与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株（mutator strain）。,常用增变菌株：E.coli XL1-Red(mutD mutS mutT),mutD突变造成DNA聚合酶的35外切核酸酶活性缺陷，失去错配碱基的校正功能；mutS突变使DNA错配修复系统失去功能；mutT突变不能水解dGTP的氧化

5、产物8-oxodGTP，8-羟基鸟嘌呤在复制时掺入DNA中，造成突变。,四、化学诱变,用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。,常用的化学诱变剂：,1.烷基磺酸盐和烷基硫酸盐甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）2.亚硝基烷基化合物亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU）3.次乙胺和环氧乙烷类乙烯亚胺（EI）4.芥子气类氮芥类、硫芥类,烷化剂,作用机制作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。,这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。代表药剂：5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴

6、去氧尿核苷（BudR）为胸腺嘧啶（T）的类似物2-氨基嘌呤（AP）为腺嘌呤（A）的类似物马来酰肼（MH）为尿嘧啶（U）的异构体,核酸碱基类似物,亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA复制紊乱。HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。叠氮化钠(NaN3)是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，而且无残毒。,其它诱变剂,作用机制作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。,第二节 DNA体外重组,依赖序列同源性的DNA体外重组技术。要求：DNA亲本序列之间要有一定程度的同源性，重组交换在局部序列完全相同的片段内

7、发生。关键：引入DNA片段的重新组装过程，又称有性PCR（sexual PCR）或分子育种PCR（molecular breeding PCR）。优点：可以将大量突变中的有益突变快速地组合，加速产生DNA序列多样性，使定向进化从以往的“突变选择”模式变为与自然进化更为相似的“突变重组选择”模式。,一、DNA洗牌法（DNA shuffling）,美国Stemmer 于1994 年首次提出。,DNA shuffling技术是通过对一组序列相关DNA序列，经过超声波处理或在DNaseI的作用下随机切成小片段，然后在没有引物的情况下，采用有性PCR方法进行合成；随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近

8、切割前的目的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因。DNA shuffling技术的优点：可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可达几十kb;通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片段上序列的信息，简化了操作程序；比随机突变显著提高了良性突变的概率。,二、交错延伸重组（staggered extension process）,交错延伸重组是一种简化的DNA shuffling技术。它不是由短片段组装全长基因，而是在PCR样反应中将含不同点

9、突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂（5sec）复性/延伸反应，在每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段，重组的程度可通过调整反应时间和温度来控制。,三、随机引发重组(random priming in vitro recombination，RPR),RPR以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。该

10、法可以用一条DNA单链为模板，因此可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组。,随机引发合成短DNA片段混合物；过滤并纯化DNA片段混合物；做无引物PCR；用两端引物进行标准PCR，扩增全长的杂交DNA链。,第三节 寡核苷酸介导的定点诱变,70年代初x174DNA（ssDNA 5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象，即产生带野生型基因组的噬菌体。,一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程,化学合成能与野生型DNA模板的靶区域退火，并携带所需突变的寡核苷酸，作为体外合成DNA的引物。由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸，产生含有预定突变

11、的双链DNA。对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区域没有发生额外的突变。,二、诱变寡核苷酸的设计要求,与靶DNA的适当链互补，并注意与模板的其他区域不能错误杂交；足够的长度与靶序列特异地结合，1-2个碱基改变的引物要求至少25个碱基长度；错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15个碱基与模板链完全匹配；含有与模板完全杂交的5端区，这样从上游引物起始的DNA合成不至于取代诱变寡核苷酸引物；诱变寡核苷酸引物3区域有10-15个碱基与模板链完全匹配，形成足够稳定的杂交分子；无回纹、重复或自身互补序列；必要时可在诱变寡核苷酸上加入新的酶切位点，或消除靠近诱变点的已有酶切位点。,三、经典D

12、NA定点诱变,在PCR技术得到广泛使用之前，定点诱变程序均采用普通的DNA聚合酶催化DNA的复制。通常以单链DNA为模板，大部分方案利用了M13噬菌体可制备单链DNA的特点。M13噬菌体是一种丝状噬菌体，只感染雄性大肠杆菌，不裂解大肠杆菌细胞，可形成模糊噬菌斑，其基因组为闭合环状DNA，插入M13的DNA可以分别回收到两种形式：dsDNA和ssDNA。,1.背景知识dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP，因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由T占据的位置。ung-：UDG酶缺陷，UDG酶尿嘧啶-N-糖基化酶可除去掺入D

13、NA中的尿嘧啶残基在体外用诱变引物合成的杂合双链DNA在导入正常ung+dut+菌株后，只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制，而野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。,（一）Kunkel定点诱变法（又称“U”法）,（二）位点选择诱变（altered sites in vitro mutagenesis）,位点选择诱变法使用了2个寡核苷酸引物，一个是用来引入突变的引物，另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链。特点：可正向选择突变链，使用高保真的T4DNA聚合酶合成DNA，可以使用双良DNA作模板，可进行多轮筛选。但需

14、特定载体，即含有一个有缺陷的抗生素抗性基因。,（三）转化子诱变（transformer site-directed mutagenesis）,转化子诱变也使用了2个寡核苷酸引物，除了突变引物外，还使用了1个用来剔除单一酶切位点的引物。因此该方法也称酶切位点剔除法。将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上必须存在1个单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA合成时，突变的DNA链将不再含有该单一酶切位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。,四、PCR介导的定点诱变,优点：,突变体回收率高；快速简便，不需制备单链DNA

15、模板；高温的利用可降低模板DNA形成二级结构的几率；所有反应可在同一试管进行。,缺点：,PCR扩增DNA时会产生一定程度的碱基错配；在扩增DNA的3末端加上非预设碱基；对每套引物和模板，PCR反应的条件都需要优化；标准PCR不能有效扩增大于3kb的DNA片段。,（一）大引物PCR诱变,（二）重叠延伸PCR诱变(overlapping extension PCR),（三）重叠延伸剪接技术（splicing by overlap extension,SOE）,（四）同源重组法,（五）双向PCR快速定点诱变,五、野生型DNA的筛选和排除,限制性内切酶 DpnI 可特异性切割dsDNA中的Gm6ATC

16、位点，对半甲基化的DNA效率较低，完全不能切割非甲基化DNA。大肠杆菌体内DNA在Dam甲基化酶催化下完全甲基化，对DpnI 敏感。,第四节 嵌套缺失,逐步从感兴趣的DNA的一端或两端删除多个寡核苷酸，得到一套终末端长短不同的嵌套缺失突变体，这个突变体群体也称渐次截短文库。,外切核酸酶（35外切核酸酶活性）BAL 31核酸酶（35外切核酸酶活性）DNaseI（内切核酸酶活性）,一、外切核酸酶的消化,二、BAL 31核酸酶消化,主要活性为3外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3端去掉单核苷酸；具有较弱的单链内切核酸酶活性；依赖Ca 2+EDTA可抑制其活性,三、DNaseI消化,内切酶，可优先在嘧啶处水解ds或ssDNAMg 2+：独立作用于每条DNA链，切点随机Mn 2+：大致在同一位置切割dsDNA 产生平端或1-2个核苷酸突出,