何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理.ppt

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1、第四章 基因工程的主要技术与原理,周毅峰2013.03,核酸的提取与纯化,核酸电泳,分子杂交,PCR技术,DNA序列分析,大分子相互作用,1、核酸的提取与纯化,破碎细胞或包膜内容物释放,材料准备,核酸分离、纯化,沉淀或吸附核酸，并去除杂质,核酸溶解在适量缓冲液或水中,1.1、基因组DNA的提取与纯化,DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,DNA钠盐比游离态更易溶于水,DNP在0.14mol/LNaCl中的溶解度是水中的1%,DNP在1mol/LNaCl中的溶解度是水中的2倍,生物材料的准备,新鲜，或者冻存的样品,液氮中研磨,加缓冲液,EDTA螯合Mg2+、Ca2+,SDS变性蛋白质,-巯基

2、乙醇、DTT打开二硫键和抗氧化,PVP与酚和多糖结合及抗氧化,裂解细胞,除杂,加CTAB或SDS结合多糖和蛋白,加酚仿去蛋白,纯化与保存,加乙醇或异丙醇沉淀,加乙醇反洗涤,吹干,水或TE溶解20保存,基因组DNA的提取-酚抽提法,样品的准备,细胞的裂解,蛋白质变性,DNA的抽提,DNA的沉淀,血基因组DNA试剂盒,酵母基因组DNA试剂盒,细菌基因组DNA试剂盒,细胞基因组DNA试剂盒,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,SDS法流程图（以动物组织为例）,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为

3、蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,浓盐法：,有机溶剂抽提法：,密度梯度离心法：,核酸分离、纯化,蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理,多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl)，冰浴20min。,核酸分离、纯化,多酚的去除：在

4、抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,核酸分离、纯化,盐离子的去除：70的乙醇洗涤,CTAB溶液配制好备用，65水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化 65水浴一个小时 氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次。用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5u

5、l,1mg/ml的RNA酶后保存,猕猴桃DNA提取实例,CTAB提取缓冲液的改进配方,猕猴桃基因组DNA,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,原理,1.2、碱裂解法提取质粒DNA,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时,生成不溶的PDS，这些复合物从溶液中沉淀下来。,变性,利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当

6、条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。,碱裂解法,所用的试剂作用,葡萄糖,增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。,EDTA,Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。,冰醋酸

7、把醋酸钾溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。,高浓度的K+置换Na+，生成不溶的PDS,用于沉淀DNA。,乙醇,DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。,KAc-HAc缓冲液,RNase A,降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。,TE缓冲液,DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。,Tris-HCl维持溶液中pH值相对稳定；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。,蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。,酚-氯仿,选用,以上试剂有

8、商业试剂盒；也可以自己配制。,碱抽提法提取质粒DNA的步骤,Solution I 的配制：,使用“溶液”悬浮菌体。,第一步：悬浮菌体,25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA,溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。,第二步：破膜，蛋白质和DNA变性,Solution II 的配制：,0.2N NaOH，1.0%SDS,第三步：中和,溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA沉淀。,Solution III的配制：,5M 乙酸钾（用冰醋酸调pH至4.8）,上清液中含有闭合质粒DNA。,第四步：离心除去沉淀,0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。,第五

9、步：纯化DNA,上清液过柱或酚-氯仿抽提。,第六步：沉淀DNA,材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮

10、研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕猴桃大提，10000转20min）针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组

11、DNA的提取,质粒DNA的提取,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA

12、，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,对策,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解。,对策,原因,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不

13、完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少。,对策,原因,1.2、RNA的提取与纯化,细胞RNA的含量,每个细胞的RNA量约为10-5 g 80%-85%rRNA 10%-15%tRNA 1%-5%mRNA 其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA,液氮中研磨,加蛋白变性剂,去除DNA和蛋白,提供超低温抵制酶活性,异硫氰酸胍、N-十二烷基

14、肌氨酸钠使蛋白和核酸分离,异硫氰酸胍、-巯基乙醇抑制RNase活性,LiCl2沉淀RNA,酚仿或水饱和酚抽提DNA和蛋白，将RNA留水相中,乙醇洗涤杂质，乙醇或异丙醇沉淀RNA,纯化和沉淀RNA,异硫氰酸胍/苯酚法,原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,步骤:材料准备：尽量新鲜。器具准备：0.1%DEPC处理24小时，灭菌；裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放

15、RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。,影响RNA提取的因素,材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于70或20保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，70短期保存,样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动

16、植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,影响RNA提取的因素,1.3 核酸的纯度与浓度鉴定,紫外分光光度法,核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。,各种碱基的紫外吸收光谱,可通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染

17、，比值升高与降低均提示不纯,判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,纯DNA 比值1.8，1.8 Pr、苯酚污染纯RNA 比值2.0，2.0 DNA、Pr、苯酚污染,DNA或RNA的定量，OD260=1.0相当于,50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸,紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,直接测定核酸浓度,荧光光度法,核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量

18、分析。（1-5ng）,DNA的完整性测定：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。,RNA的完整性测定：完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA的污染。,1、短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA 贮

19、存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2、长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,1.4、核酸的保存,DNA的储存,RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70保存。注意避免Rnase 的污染；分装，避免反复冻融；如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin，保存时间可延长。,RNA的储存,2、核酸电泳,DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：

20、,琼脂糖凝胶电泳 可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.50.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。,聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。,2.1、琼脂糖凝胶,琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿-L-半乳糖组成，形成相对分子量为1041

21、05的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。,针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间适用于DNA大片段的分离。,2.2、DNA电泳影响因素,DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比

22、是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。,DNA分子大小 DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。,DNA分子构型 对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同,不同类型琼脂糖分离DNA片段大小范围,不同的胶浓度 对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。,常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2的凝胶）,电场强度电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这

23、样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。,溴化乙锭（EB）电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。电泳时所加的浓度：临界点的游离EB质量浓度为0.1mg/ml0.5mg/ml,EB代替品,电泳缓冲液目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和TPE,2.3、DNA电泳上样缓冲液（loading buffer）,指示剂监测电泳的行进过程，指示电泳的前沿，它的速率约

24、与300bp的线状双链DNA相同。,10mmol/l的EDTA,螯合Mg 2，防止电泳过程中DNA被降解,一定浓度的甘油或蔗糖,增加样品的比重和密度以保证DNA沉入加样孔内，而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。,溴酚蓝指示剂,目前厂商提供的限制性内切酶中都有赠送的上样缓冲液，一般为10上样缓冲液，DNA样品中仅需加入1/10的量即可，加入过多的上样缓冲液会造成电泳轻微的托尾现象。,倒胶,点样,2.4、DNA电泳上样量的控制,在分析性电泳中，一般样品投入量达50100ng/带即可观察到清晰结果。对于珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率510ng/带也

25、可对于一定量的DNA，当电泳时采用较薄的梳子制胶，则电泳时DNA条带相对较窄，观察较清晰；随着电泳时间的延长，由于DNA分子本身有一定的扩散，电泳条带也会变浅。,2.5、脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis,这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。,脉冲电场电泳示意图,3、分子杂交,分子杂交(molecular hybridization)：利用带有标记（放射性同位素(32P或125I)、生物素或荧光酶等）探针（D

26、NA、RNA或蛋白质）进行相同或不同种类分子间相互特异识别而发生结合的过程。,3.1核酸探针,一小段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）。探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。,根据标记物不同可分为放射性探针和非放射性探针两大类；放射性标记物（-*N-dNTP）32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)和125I(60d)非放射性标记物半抗原：生物素、地高辛荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。,寡核苷酸

27、探针（oligonucleotid probe）：是人工合成且被适当标记的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的DNA或RNA），能与被检测长链DNA或RNA进行分子杂交，且杂交后可由该分了上的标记显示目的长链DNA或RNA分子的存在。,常用寡核苷酸探针的标记物,放射性同位素标记：32P、33P、35S,非放射性标记：生物素、地高辛,生物素dUTP、生物素dATP、地高辛dUTP等,杂交探针的标记：ABC荧光标记,杂交探针的标记：ABC显色酶标记,地高辛dUTP,杂交探针的标记：地高辛系统标记,两种地高辛dUTP显色系统,DIG探针杂交过程,杂交探针的制备：,用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必

28、须满足下列条件：,单链结构（双链DNA可用碱变性）,足够长度（至少12个碱基）,内部不含互补区,探针的制备方法或来源包括：,人工合成,cDNA合成,同源序列,mRNA,T4-PNP介导的末端标记,探针的标记方法,切口移位(平移)法,引物延伸法,末端标记法,体外转录或反录法,末端标记,TdT介导的末端标记,T4-Pol介导的末端标记,DNA聚合酶介导的切口平移标记,DNA聚合酶介导的随机引物法,逆转录酶介导的反转录标记,转录酶介导的转录标记,3.2 Southern 杂交(Southern blotting),目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳,0.4N NaOH 变性1.5M N

29、aCl/1M Tris（pH7.4）中和使 DNA 仍保持单链状态,将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上通过 80 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上,将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附,杂交：在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上,洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去,检测：放射性标记、检测非放射性标记、检测,分子杂交炉,紫外交联仪,M，地高辛（D

30、IG）标记的分子量标准（DNA/Hind）,1-3，苏云金芽胞杆菌 YBT-1520 菌株的总 DNA 分别经 Kpn-Pst、Pst 和 Kpn 酶切,以 cry1Aa 杀虫晶体蛋白基因中的 728bp 片段作探针，通过随机引物标记的方式，用 DIG 标记探针,3.3 Northern 杂交(Northern blotting),(A)RNA is isolated from various tissues and is separated by size using gel electrophoresis.,(B)The gel is then placed on a paper wick

31、,which absorbs an ionic solution from a trough,(C)A filter that traps RNA is placed above the gel,and blotting paper is placed above the filter.Capillary action draws the solution through the gel,trapping the RNA on the filter,(D)The filter is incubated with radioactive single-stranded DNA complemen

32、tary to the mRNA of interest,(E)After any unbound DNA is washed off,autoradiography localizes the mRNA in the samples that contain it.,(F)Drawing of a developmental Northern blot showing the presence of Pax6 mRNA in the eye,brain,and pancreas of a mammalian embryo,SBEIII,WT,SBEIII OX,WT,SBEIII OX,检测

33、基因的表达水平-Northern的应用实例,3.4、Western 印迹法(Western blotting),检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗体对蛋白质进行鉴定及定量的方法,主要步骤：,蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：NC膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标，二抗）反应显色反应：酶促反应,三种分子杂交技术的比较,Southern,Northern,Western,3.5、原位杂交(in situ hybridization),将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特

34、点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,细胞或组织的原位杂交 检测特异mRNA是否存在。步骤：细胞或组织的固定后置于载玻片上 组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测,基本步骤,硫转蛋白在拟南芥根部的原位杂交,Fluorescent in situ hybridization chromosomes,Multicolor fluorescence in situ hybridization of Zea mays L.chromosomes.Stu

35、dy of maize chromosomes has been hampered by a lack of chromosome features.,菌落或噬菌斑杂交，将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用,基本程序是：将被筛选的大肠杆菌菌落或噬菌斑，从其生长的琼脂平板中转移到硝酸纤维素滤膜上，进行适当的温育，保藏原来的菌落平板作为参照，以便从中挑取阳性克隆。,复制平板和膜转印时应在平板和膜上的一侧做三个对应的标签,0.5MNaOH裂解细菌酸中和蛋白酶处理漂洗细胞碎片80烘烤,与32P-标记的探针杂交,放射性自显影,在参照

36、平板上挑取目标阳性克隆（阳性菌落）扩大培养,菌落原位杂交,噬菌斑原位杂交,4、PCR技术,4.1PCR技术发展简史,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外扩增的一种方法,Applied Biosystems GeneAmp PCR 9700 Thermocycler,Dr.Hargobind Khorana（1922）,Khorana(1971)等提出“在体外经DNA变性，与适当引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因”。,序列分析方法未成熟,

37、寡核苷酸引物合成还处于手工及半自动合成阶段,热稳定的DNA聚合酶未见报道,因此这个想法没有实际意义！,但是：,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1968for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis,加速分子生物学发展进程的一项“简单而晚熟”技术,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)met

38、hod,Kary B.Mullis1944,Dr.Mullis joined the Cetus Corp.in Emeryville,California,as a DNA chemist in 1979,1983年，Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。,Mullis最初使用的DNA聚合酶是Klenow片段,Klenow片段不耐热，每个循环加一次酶,是一个笨拙的中看不中用的实验室方法,扩增的DNA片段很均一，真实性较高，只有所期望的一种DNA片段,1988年Keohanog改用T4DNAPol,但仍是每个循环加一次酶,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq

39、）引入了PCR技术,Saiki RK,Gelfand DH,Stoffel S,Scharf SJ,Higuchi R,Horn GT,Mullis KB,Erlich HA.(1988)Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science.239:487-491.Saiki RK,Scharf S,Faloona F,Mullis KB,Horn GT,Erlich HA,Arnheim N.(1985)Enzymatic amplification of beta-

40、globin genomic sequences and restriction site analyses for diagnosis of sickle cell anemia.Science.230:1350-1354.,4.2PCR技术基本原理和操作,类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,基本反应步骤,变性,退火,延伸,变性,PCR技术基本原理,模板DNA的变性模板DNA经加 热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备,模板DNA与引 物的退火(复性)模板DNA经加热

41、变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,引物的延伸DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,预变性,模板DNA dNTP 引物Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC5min,模板DNA dNTP 引物Buffer,Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer,94 30s55 1min72 2.5min,Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer,72 710 min,循环2535次,第二轮扩增,第三轮扩增,第一轮扩增产物,

42、目的基因,目的基因,PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用下面的公式计算。,PCR反应动力学,Y(1X)n,Y：代表DNA片段扩增后的拷贝数X：表示平均每次的扩增效率n：代表循环次数,平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值,每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝,反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效

43、应,PCR技术反应体系、条件和过程,引物、酶(热稳定性DNA聚合酶)、dNTP、模板和二价阳离子（Mg2+）、一价阳离子（K+）、缓冲液,PCR反应的基本成分,10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ul,标准的PCR反应体系：,ddH2O 11L cDNA第一链模板 1L 2GC buffer 25L dNTP(25mmol/L)8L P7(10mol/L)2L P8(10mol/L)2L LA Taq DNA polymease 1L,在

44、0.1mL离心管中加入下列溶液:,总体积 50L,RT-PCR,10扩增缓冲液,KCl 500mmol.L-1Tris-HCl 100mmol.L-1(pH8.3-8.8)MgCl 15mmol.L-1明胶 0.1%,在延伸温度（72）下，pH 值接近 7.2，二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 1.5mM Mg2+，有时使用 Mn2+。dNTP都能结合Mg2+，因此Mg2+的浓度要大于dNTP，KCl对扩增大于500bp长度和改善DNA片段产物是有益的,标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP（终浓度：

45、250 mol/L）,dNTP,酶及其浓度,Selection for DNA polymeraseKlenow酶，早期采用，该酶不耐热，缺点有温度要求低(37)，受热即失活；产物特异性不高；积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；扩增的最长序列约400bp（Taq酶则能扩增10kb）,thermostable DNA polymerasesTaq DNA polymeraseTth DNA polymerasefrom T.thermophilusVENT DNA polymerasefrom T.litoralisSac polymerasepfu polymerase,Taq DNA

46、聚合酶,分离:1969年，美国黄石国家公园温泉分子量:94KDa活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200 000U/mg,离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感，最适浓度为50mmol/L。忠实性：没有校正单核苷酸错配功能-致命弱点。一般出错率为210-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意,抑制剂：尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂内源DNA：不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存：在-20至少6个月。,如何选择最合适的DNA聚合

47、酶 PCR 实验的不同需求,特 异 性：基因组扩增、RT-PCR保 真 性：基因筛选、测序、TA克隆长片段扩增：构建基因图谱、测序、分子遗传学扩增效率：复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）PCR试剂盒：复杂模板扩增、大规模基因检测,热启动 Taq酶,特点：,35核酸外切酶活性，降低碱基错配率,用途：,表达基因的克隆,基因的定点突变,细胞内基因点突变分析（SNP）,高保真酶,Promega中国公司普洛麦格（北京）生物技术有限公司产品,高保真 高扩增效率,混合酶,热启动耐热聚合酶 35核酸外切酶,用途,超长片段扩增、测序构建基因图谱复杂模板扩增：GC含量高、二级结构,-controlled tem

48、perature-controlled rate of temperature change,Thermocycler,Gradient-Thermocycler,an automatic machine,a computer-controlled thermal block,in which the temperature can be rapidly changed and finely controlled,引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。,引物,设计引物的原则,引物长度：15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于 38

49、 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74），不能保证PCR扩增产物的特异性,引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段,引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带,引物 3端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败,引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对

50、酶切分析或分子克隆很有好处,引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,引物量：每条引物的浓度0.1 1umol或10 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,引物的解链温度两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5,简并引物设计（degenerate primers),如：Asn PheTyr Ala对应的核苷酸序列(?)AAU UUU UAU GCUAAC UUC UAC GCC 等 N/A T C G,设计引物的方法,设计引物的操作流程,同源性比较,序列下载,引物设计筛选,根据所需要检测的基