高级生化技术实验.ppt

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1、高级生化技术实验,食品与生物工程学院生物化学实验室,实验内容安排40学时,实验一 鸡卵类粘蛋白的分离与纯化 实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量 实验三 凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量实验四 离子交换层析技术分离单核苷酸,掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质；掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；,实验目的,通过实验应该做到,学习设计实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生化实

2、验仪器。学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。,实验前应认真预习，写好实验预习报告。实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。实验预习报告格式 实验原理 实验方法与步骤（表格或流程式）主要仪器、材料 实验数据记录表格 预习遇到的问题,实验记录与实验报告,实验记录与实验报告,实验报告是学生实验研究结果的记录和总结，同时也是评价学生实验课成绩的重要依据。实验报告的格式 实验目的 实验原理 实验方法与步骤 实验数据记录、处理及结果分析

3、思考题 讨论、心得 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能充分运用己学过的知识和生物化学技术原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。,考核方式与评分方法,采取“学生实验平时考核”的方法进行实验考核。评分方法采用百分制，每个环节都制定了评分标准（见高级生化技术实验评分标准）,各实验项目总成绩的平均值就是实验的成绩。实验成绩（预习成绩10实验过程成绩40%报告成绩50）N 预习报告10 实验过程40 实验报告50 N为所做实验项目的总个数,实验一 鸡卵类粘蛋白的分离与纯化,【目的要求】,掌握从鸡卵清中提取鸡卵类粘蛋白的原理及方法。,了解凝胶过滤层析的工作原理，掌握

4、基本操作技术。,掌握离子交换层析的工作原理及基本操作技术。,鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白，它具有强烈的抑制蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。另外，还可用于分离纯化麦胚凝集素。,【实验原理】,鸡卵类粘蛋白在中性及偏酸性溶液中较稳定，对热、高浓 度脲及有机溶剂均有较高的耐受性，在10三氯乙酸或50丙酮溶液中有较好的溶解度。本实验采用选择性变性沉淀、凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析等方法分离纯化鸡卵类粘蛋白。,选择性变性沉淀 在鸡蛋蛋清中，加入 10TCA溶液作为初步分离，在pH3.5的条件下，杂蛋白变性沉淀，离心后，上清液中含

5、有鸡卵类粘蛋白。,离子交换层析纯化 不同蛋白质pI不同，在同一pH 溶液中其电离有所不同，利用 DEAE-纤维素离子交换柱层析，可将目标蛋白与杂蛋白分开。从而使鸡卵类粘蛋白得到进一步纯化。,凝胶过滤柱层析 蛋白质相对分子质量较残留丙酮及TCA大的多，选择Sephadex G-25依分子筛效应，可去除粗分离样品中的小分子。,透析纯化 离子交换层析后，样品中盐的质量较高，需要脱盐才能得到纯品，一般采用透析的方法。,蛋白质含量的测定 鸡卵类粘蛋白在280nm处的消光系数=4.13，即蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413，据此可以测定其蛋白质的含量。,【操作方法】,一、鸡卵类粘蛋

6、白的提取1)取1个鸡蛋蛋清，加入等体积的10TCA溶液，充分搅匀后，测定溶液的pH值（精密pH试纸），若偏离3.5，用10 NaOH 溶液调pH3.5，室温静置4h以上。,2)3000r/min离心10min。收集清液，再用滤纸过滤并检查滤液的pH值是否3.5，若不是，则要调整。滤液量体积后转入500 mL烧杯内，缓慢加入3倍体积冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放置过夜。,3)小心虹吸出部分上清液，剩余浑浊液转入50mL离心管中，3500r/min 离心10min，弃清夜，将沉淀抽真空去净丙酮。,4)量取100mL Sephadex G-25,加入200mL pH6.5 的磷酸盐缓冲液，沸

7、水中1h。冷却后脱气。,7)取上述蛋白粗提液上Sephadex G-25层析柱。控制流速15d/min，待样品全部入床后，用同样的缓冲液洗脱，收集第峰。在蛋白峰流出后盐及杂质才开始流出。,5)装柱（25300mm）用约2倍体积的0.02mol/L,pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。,6)离心管中加入20mL蒸馏水溶解，若溶解液浑浊，可用滤纸去掉不溶物。,二、鸡卵类粘蛋白的纯化,处理离交剂 量取 DEAE-纤维素粉（DE-32）50 mL，用100 mL 0.5 mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡20min。用G-3漏斗抽滤后再用蒸馏水

8、洗至pH 8.0 左右，抽干。然后移至250 mL烧杯内，用100 mL 0.5 mol/L HCl溶液浸泡20min，再转移到G-3漏斗内，抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，抽干。最后转移到烧杯内，用60mL 0.02mol/L,pH 6.5 磷酸盐缓冲液浸泡约15mim，脱气后装柱（15200mm）。,2)装柱（小心操作）。用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。,4)洗脱 改用含0.3mol/LNaCl的0.02 mol/L pH 6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集鸡卵类粘蛋白的洗脱峰并量体积。,3)上样吸附 脱盐后的鸡卵类粘蛋白溶液上柱吸附。控制流速20d/

9、min，待样品全部入床后，用 0.02mol/L，pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，洗去未被吸附的杂蛋白，直至基线稳定。,1)透析 将层析收集的蛋白样品装入透析袋内，对蒸馏水进行透析，间隔12h更换一次蒸馏水，直至经1%AgNO3检查无氯离子为止（过夜）。,三、鸡卵类粘蛋白纯品的制备,3)蛋白样品中加入3倍体积的冷丙酮，用塑料薄膜封口，在冰箱静置4h。,2)量透析后蛋白样品体积，转移到烧杯内。取出1mL,稀释10倍，在紫外分光光度计上，280nm处测定鸡卵类粘蛋白的含量。剩余样品小心用1mol/L HCl调至pH4.0。,4)倾去上清，剩余浑浊液转移到50mL离心管内，于 3500r/min 离心

10、10min,收集沉淀，将沉淀抽真空干燥，即可得到透明胶状物鸡卵类粘蛋白纯品。,BA,1)鸡卵类粘蛋白（mg/mL）=2)鸡卵类粘蛋白的产率（mg/mL）=100mL鸡蛋清得到鸡卵粘蛋白的mg数。3)绘制Sephadex G-25柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。4)绘制离子交换柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。,A280稀释倍数,0.413,【思考题】在鸡卵粘蛋白的提取、分离及纯化过程中，直接影响产率的是哪几步？操作过程中应当注意什么？,四、实验结果与数据处理,实验二 SDSPAGE测定蛋白质 相对分子质量,【目的要求】,学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS

11、-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。,【实验原理】,电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破

12、坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。,【SDS-PAGE基本原理】,SDS-PAGE：在PAGE中，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少，分子的大小和形状。如果在PAG系统中加入阴离子去污剂SDS（十二烷基磺酸钠），蛋白质分子表面完全被负电荷所覆盖，电泳时，其迁移率取决于蛋白质的分子量大小而与其所带电荷和形状无关。,PAG 具有机械强度好，有弹性，透明，化学性 质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作 用小的特点。改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同 孔径的凝胶。,当蛋白质的分子量在17

13、,000165,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=K-bm,蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远 远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋 白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移 率主要决定于亚基的相对分子质量。,将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。,SDS-PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统是指电泳槽中缓冲液的pH值与凝胶中的相同.连续体系中由电

14、极缓冲液、和分离胶组成。,不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-Gly缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性。,浓缩效应,浓缩胶pH6.7浓缩胶缓冲液Tris-HCl,电极缓冲液Tris-Gly解离度：Cl 蛋 Gly mclclm蛋蛋m Gly Gly凝胶中Cl为快离子，Gly为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。,SDS-PAGE过程有浓缩效应和分子筛效应,浓缩效应,样品

15、进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,浓缩效应,样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,浓缩效应,样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,浓缩效应,样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,分子筛效应,蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.9)，Gly解离度增大，不存在

16、快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。,分子筛效应,分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。,【操作方法】,、安装夹心式垂直板电泳槽 1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手对角线的方式旋紧螺丝帽。5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与

17、硅胶模框交界的缝隙加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。,1）分离胶的制备（按表3-2配制10%的分离胶）将制备的分离胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约34 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将贮槽的蒸馏水倒去，用细条滤纸吸去残留的水液。,2、凝胶的制备,将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超

18、过短玻璃板上缘。静置电泳槽，30 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。,2）浓缩胶的制备（按表3-2配制3%的浓缩胶）,3、蛋白质样品的处理,1）标准蛋白质样品的处理低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200l样品溶解液中，沸水浴中加热3-5min后上样。,b)称制备样品1mg，按1mg/mL溶液比例加样品溶解液，将其转移到带塞的小离

19、心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。,2）待测样品处理 a)称1、2、3号待测样品各1mg，按1mg/mL溶液比例，加 样品溶解液，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖 上盖子，在100沸水浴中加热3min，取出冷却后加 样。,将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。,5、电泳,4、加样,用移液器分别取10 l样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。并做好标记。,Staking gel,Sepa

20、rating gel,7、结果处理,量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR：相对迁移率mR=,蛋白质样品迁移距离(cm)溴酚蓝区带距加样端距离(cm),6、染色与脱色,电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。,【注意事项】,1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通

21、过。3）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。,【思考题】,1、在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?2、电极缓冲液中甘氨酸的作用?3、在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?4、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,实验三 凝胶过滤层析法 测定蛋白质分子量,【目的要求】,掌握凝胶层析的基本原理。学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。,【基本原理】,凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进

22、行分离的技术。,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从一个胶粒孔隙进入另一凝胶颗粒，移动速率慢而最后流出层析柱。中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外均有分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。,Vo（外水体积）：Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子如蓝色葡聚糖-20

23、00溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。Vi（内水体积）：凝胶颗粒中孔穴的体积。Vi从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积Ve计算，即 VeVoVi推出,ViVeVo,Vt（柱床体积）：凝胶柱所能容纳的总体积。1)可用下式计算：Vt（D/2）2h 2）根据 VtVoVi 可以得到 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积即可得出 Vt。,，,Vex（洗脱体积）：它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，故其洗脱体积 VeVo 对于完全渗透的小分子由于它可

24、以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积 VeVt 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。,凝胶层析拄洗脱的三部分示意图,分配系数表示某个组分在内水体积（Vi）和在外水体积（Vo）中的浓度分配关系。Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Vt）有关。即 Kav=在限定的层析条件下，Vt和Vo都为恒定值。而Vt值却是随着分离物分子质量的变化而变化的。分子质量大的物质先从柱中流出Ve值小Kav值小 分子质量小的物质后从柱中流出Ve值大Kav值大,VeV0VtV0,对于完全排阻的大分子 Ve=Vo 故 Kav=0 对于完全渗透的小分子 Ve

25、=Vt 故 Kav=1 一般Kav值在01之间，若Kav1说明物质与凝胶有吸附作用。Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、Vo及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，Kav与lgMr成线性关系：Kav=blgMr+c,同样可以得到：Ve=blgMr+c 即Ve与lgMr也成线性关系。通过在一凝胶柱上分离多种已知分子质量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出KavlgMr或Ve lgMr标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子质量。,吸水率和床体积,吸水率是指1g干的凝胶吸收

26、水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。Sephadex G-25200 数字是吸水率10 例如Sephadex G-75 吸水率 7.5ml/g 床体积指1g干的凝胶吸收水后的最终体积 例如SephadexG-75 床体积 1215 ml/g 干胶用量(g)=柱(ml)床体积/凝胶床体积(ml/g),应用,生物大分子的纯化分子量测定脱盐及去除小分子杂质去热源物质 溶液的浓缩,【操作方法】,一、凝胶的选择和处理称取7g(105 mL)Sephadex G-75于250 mL烧杯中，加入洗脱液100mL，室温充分溶胀3h。反复倾泻去掉细颗粒，然后在沸水浴中煮

27、沸12h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。二、装柱 1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。2）凝胶柱床总体积（Vt）的测定：在距柱上端约5处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积Vt。,3）向柱内加入约1/4柱体积的洗脱液，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约23高度后打开出水口，待胶面上升到距柱上口23高度时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻，等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储液瓶连接，调流速36mL/10min，用 23倍柱床体积的洗脱液平蘅。,三、蛋白质分子

28、量测定,）测定Vo和Vi：打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取1 mL蓝色葡聚糖-2000和重铬酸钾混合液，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集），待溶液完全渗入柱床后，关闭出水口，取1mL洗脱液沿管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端再加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接，打开出水口，开始洗脱。分别收集蓝色葡聚糖-2000和重铬酸钾洗脱峰，测出它们的洗脱体积Ve。,）标准曲线的制作,按上述方法加入1mL标准蛋白质混合液，以3mL/10min 的速度洗脱并收集洗脱液体积。分别收集各标准蛋白质的洗脱峰（灵敏度0.2A），

29、测量它们的洗脱体积Ve。代入公式计算出各标准蛋白质的Kav值。以Kav值为横坐标，标准蛋白质lgMr为纵坐标，绘出标准曲线。也可以标准蛋白质lgMr为横坐标，Ve或Kav为纵坐标，作出标准曲线。,）未知样品蛋白质分子量的测定,将待测蛋白配制成5mg/mL溶液,以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积Ve，代入公式计算待测蛋白的Kav值，然后在标准曲线上查得lgMr，其反对数便是未知样品的相对分子质量。,四、实验结果与分析 实验结果填入表中,结果分析,绘制蓝色葡聚糖重铬酸钾洗脱曲线 绘制标准蛋白质洗脱曲线 绘制待测样品洗脱曲线 绘制lgMr-Kav标准曲线,确定

30、待测样品相对分子质量,实验四 离子交换层析 分离单核苷酸,目的要求,通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸，学习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。,离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。,离子交换层析的基本原理,树脂 N+(CH3)OH-,离子交换层析的基本原理,离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）和 反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；,纤维素O CH2 COO-Na 基质 电荷基团 反离子

31、,RA+B RBA+(RA是阳离子交换剂，B为溶液中的离子或待分离的生物分子）,离子交换层析的基本原理,当A+=B+,RBRA,说明 R 与B的结 合力比A大；反之亦然。对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及 溶液的pH值。,平衡装柱 离子交换剂带上反离子(R-O-X+)上样 样品（A,B+，C+，等）与反离子（X）竞争与电荷基团结合；（结合力A B+Y+C+X）洗脱 洗脱液中的离子成分（Y）与样品(A等）竞争结合电荷基团，首先C洗下来，随着Y浓度增加，B洗脱出，最后A出来，使样品分离。所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的。洗脱液的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。,离子交换层

32、析的基本步骤,离子交换层析的基本步骤,1.单核苷酸的结构 碱水解使核酸降解为2或3单核苷酸混合物，在2，或3位带磷酸基团。,离子交换层析分离单核苷酸的原理,2.阴离子交换层析分离单核苷酸的依据 单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点 AMP 2.65 GMP 2.35 CMP 4.5 UMP 1.55按等电点由高到低：CMPAMPGMPUMP,但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱顺序是：CMP-AMP-UMP-GMP,如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是：CMPAMPGMPUMP,离子交换层析分离单核苷酸的原理,3.2，3单核苷酸等电点的差异 由于2和3核苷酸的磷酸基团与碱环

33、的距离不同，所以碱环上碱基基团的pK值有区别，所以2和3核苷酸的PI值有区别。2核苷酸的PI值略高于3核苷酸的等电点。所以每种单核苷酸洗脱时出现2个峰。,离子交换层析分离单核苷酸的原理,4.离子交换剂的类型 所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团为季铵基。,树脂 N+(CH3)3,离子交换层析分离单核苷酸的原理,离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤,1）样品的获得 以KOH 37C水解酵母RNA，生成2或3核苷酸混合物。最终pH值调到8.0（注意核苷酸所带电荷！）。具体操作见讲义p23。2)交换剂的平衡和装柱 以甲酸钠溶液平衡，反离子为甲基（COO-）。具体步骤见讲义p23。3）加样 以

34、滴管加入1.0ml样品，以34d/min 的速度让其进入层析柱。然后以200ml ddH2O洗柱至OD2600.02。,离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤,4）洗脱并检测 依次用以下溶液分段洗脱：250ml 0.02mol/L甲酸；250ml 0.15mol/L甲酸；250ml 0.01mol/L甲酸0.05mol/L甲酸钠溶液（pH4.44);250ml 0.1mol/L甲酸0.1mol/L甲酸钠溶液（pH3.74);流速1ml/min。收集洗脱液，10ml一管分别进行紫外检测，并记录吸收值。,离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤,5)分析检测 a.根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗脱曲线(如图所示）。,离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤,b.保留各组分的洗脱高峰管，作出各组分在230300nm波长范围内的紫外吸收光谱图（如图所示）。,思考题,通过实验操作，讨论有哪些因素会影响离子交换层析作用的的效果？,