放射免疫技术.ppt
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1、第七章 放射免疫技术,第二节放射免疫分析 一、基本原理 二、实验方法及测定第三节 免疫放射分析 一、基本原理 二、IRMA与RIA的比较,思考题小结,免疫技术:以抗原-抗体反应原理为基础,对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术:将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析:用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体,检测免疫反应结果并确定待检物。,标记免疫技术基本概念,常见标记免疫技术,放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术,第一节 放射免疫技术,早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA),稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度
2、高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点,广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析,对相关学科的发展起到了极大地推动作用。,放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。,免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合,采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。,放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA,其它,一、放射免疫技术原理及分类,二、放射免疫技术常用的放射性核素,125I 3H 射线 理化性 活泼 差核素丰度 90%半衰期 60.2d 12.3y标记方法 简单 复
3、杂标记设备 低廉 昂贵测量条件 简单 复杂,常用标记核素,125碘-标记物的制备标记,125I-,化学或酶促反应,将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子,通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。,125I或125I+,125I-标记物(混合物),Ch-T、LPO氧化,取代反应,直接标记法,三、放射免疫技术标记物制备及鉴定,使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体积200l反应时间1-2分钟弱碱性反应条件,间接标记法,联接标记(bolton-Hunter)预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯,制成的125I 化脂功能基团可与蛋
4、白分子上的氨基酸残基反应,从而使待标记物被碘化。,bolton-Hunter,125碘-标记物的制备纯化,凝胶过滤法离子交换层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱法,聚合、损伤物,标记蛋白,游离125I,125碘-标记物的制备鉴定,标记物质量高比放射性高纯度完整免疫活性,放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95%,免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大,标记物免疫活性好,比放射单位化学量标记物中所含的放射性强度单位:Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性过高,将影响标记物免疫活性,计算法:依据标记反应中放射性核素的利用率
5、(标记率)来计算标记物的比放射性.自身置换法:比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性,结果准,测定复杂,比放射性计算法,结果欠准,计算简便,自身置换曲线 反应系统:限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少 两条曲线平行,若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性,标准曲线 反应系统:抗体(限量)、标记抗原(定量)和剂量递增的标准抗原组成 标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少,比放射性自身置换法,标准曲线与自身置换曲线平行表明在相同的放射性结合水平上,二实验中抗体上结合 的抗原物质总量相同计算置换曲线
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