蛋白质结构与功能-终.ppt

《蛋白质结构与功能-终.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质结构与功能-终.ppt（187页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第二章,蛋白质的结构与功能,概述蛋白质的基本组成单位蛋白质的结构蛋白质结构与功能的关系蛋白质的重要性质、分离纯化与鉴定,本章重点与难点重点：掌握组成蛋白质的氨基酸的结构特点、分类、三个字母代号及重要理化性质；掌握蛋白质1-4级结构特点、作用力；了解蛋白质结构与功能的关系；了解蛋白质的重要理化性质难点：氨基酸结构特点、酸碱性质、等电点；蛋白质各级结构的概念和特点、结构与功能的关系；蛋白质重要理化性质的应用。,蛋白质的生物学意义和元素组成蛋白质的分类蛋白质在生产和生活中的应用,2.1 概述,蛋白质的生物学意义,蛋白质作为生命现象的物质基础之一，构成一切细胞和组织结构的最重要的组成成分，参与生物体内

2、许多方面的重要功能。,蛋白质的重要作用,（一）酶的催化作用（二）转运和贮存功能（三）运动功能（四）结构支持作用（五）免疫作用（六）生物膜功能,（七）接受和传递信息（八）代谢调节功能（九）控制生长和分化（十）感染和毒性作用（十一）其他作用,蛋白质的元素组成,元素组成：所有蛋白质都含有 C、H、O、N 四种元素，大多数蛋白质还含有少量的 S，有些蛋白质还含有一些其它元素，如 P、Fe、Cu、Mo、I等。,各种蛋白质的含氮量都很接近，都在16%左右，因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量，1克氮就相当于6.25克蛋白质。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含

3、氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数 6.25100,凯氏定氮法原理,蛋白质的分类,1根据蛋白质的化学组成 2根据蛋白质的溶解性和组成3根据蛋白质分子形状4根据蛋白质生物功能,简单蛋白质和结合蛋白质,分类表,球状蛋白质和纤维状蛋白质,活性蛋白质和非活性蛋白质,蛋白质在生产和生活中的应用,在食品和饲料领域的应用 基本营养要素在医药领域的应用 生物多肽类药物在轻化工等其他领域的应用 催化剂、生产原材料等,2.2 蛋白质的基本组成单位,氨基酸的分类,氨基酸的性质,氨基酸的结构,氨基酸的结构与分类,-蛋白质的基本结构单位。,组成蛋白质的

4、氨基酸结构通式特点：L-型-氨基酸；-碳原子是不对称碳原子。,氨基酸的结构特点：,1、所有的氨基酸的共同特点是分子中同时具有1个羧基（COOH）和1个氨基（NH2），不同氨基酸之间的差异在于侧链的R基团结构不同。同一分子上既有酸性羧基，又有碱性氨基。故为两性化合物。,2、除R=H的甘氨酸外，a碳原子均为不对称碳原子，因而是光学活性物质，有D-型和L型两种异构体，构成蛋白质的氨基酸除Gly外均为L-型异构体。D型氨基酸没有营养价值，仅存在缬氨霉素、短杆菌肽等极少数寡肽之中，没有在蛋白质中发现。,构型与构象含义有根本的区别构型（configuration）：是指在立体异构体中所有取代原子或基团在空

5、间的取向。如几何异构体中的顺式和反式，光学异构体中的D-型和L型。构型的转变必须经历共价键的断裂。构象（conformation）：指分子中的原子或取代基团由于共价单键旋转所可能形成的不同的立体异构体。在这种立体结构中，原子或基团的空间位置改变，不涉及共价键的断裂。,氨基酸的分类,以氨基酸是否参加蛋白质的组成为依据，将氨基酸分为两大类：组成蛋白质的氨基酸 编码氨基酸（有密码子）非编码氨基酸（无密码子）非蛋白质氨基酸,根据氨基酸R基侧链的极性，可将氨基酸分为：,疏水性氨基酸（非极性氨基酸）,亲水性氨基酸（极性氨基酸）,编码蛋白质的氨基酸分类,不带电荷的极性氨基酸,带正电荷的碱性氨基酸,带负电荷的

6、酸性氨基酸,Asp Glu,Lys ArgHis,Ser Thr TyrAsn Gln CysGly,Ala Val IleLeu Pro Met phe Trp,根据生物体的需要，可将氨基酸分为：,必需氨基酸,半必需氨基酸,非必需氨基酸,其余氨基酸,Arg His,Lys、Val IleLeu phe Met TrpThr,编码蛋白质的氨基酸分类,编码蛋白质氨基酸的结构、代号,中性氨基酸,非编码氨基酸,属于氨基酸的衍生物，也称为修饰氨基酸。如：胱氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、L-甲状腺素等,非编码氨基酸（胱氨酸）,羟脯氨酸与羟赖氨酸,非蛋白质氨基酸,不是蛋白质的组成成分以游离或结合的形式存在于生

7、物界大都是常见氨基酸的衍生物还有些是-,-,-,和D-型氨基酸一些是代谢中间产物，如瓜氨酸、鸟氨酸；-氨基丁酸等,2.2.2氨基酸的理化性质,两性解离与等电点,光学性质与吸收光谱,化学反应,一般理化性质,氨基酸为无色晶体或粉末状，不同氨基酸其晶体形状不相同。氨基酸熔点高，一般在200300C。氨基酸一般溶于水（除Cys，Tyr外），易溶稀酸稀碱，绝大多数氨基酸不溶于有机溶剂。各种氨基酸有不同的味感。氨基酸的比旋光度。,两性解离与等电点,氨基酸在水溶液中或在晶体状态时主要以两性离子的形式存在。,具有酸碱性质，是两性电解质。,等电点(isoelectric point,pI)在溶液的某一pH条件下

8、，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,等电点的计算：,中性氨基酸：以Gly为例,酸性氨基酸，以Asp为例：,侧链不含离解基团的中性氨基酸:pI=(pK1+pK2)/2 对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值为两性离子两边的pK值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2 碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2,当溶液的pHpI，氨基酸带净负电荷，在电场中将向正极移动；当溶液的pHpI，氨基酸带净正电荷，在电场中将向负极移动；

9、当溶液的pHpI，氨基酸带净电荷为零，在电场中不移动。在一定pH范围内，溶液的pH离pI愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。,结论：,光学性质与吸收光谱,芳香族氨基酸在pH8时紫外吸收光谱,芳香族氨基酸有紫外吸收特性，所以280nm处吸收的测定，是定量蛋白质浓度最常用的方法。,紫外吸收性受溶液pH的影响,氨基酸的化学反应,（1）茚三酮反应,茚三酮在弱酸中与-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮反应，生成蓝紫色物质。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。两个亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应形成黄色化合物,（2）甲醛反应

10、-甲醛滴定法,不仅用于测定氨基酸含量，也常用来测定蛋白质水解程度。,氨基酸以两性离子形式存在,直接用酸碱滴定法很难测定其含量。,若加入中性甲醛，与氨基酸的-氨基结合，生成羟甲基衍生物，释放出H，就可以用酚酞做指示剂，用碱滴定释放出来的H。每释放出一个H，就相当于有一个氨基氮，通过氨基氮量计算氨基酸的量。-工业上常用的测定氨基氮的原理和方法。,（3）桑格（Sanger)反应2.4一二硝基氟苯（DNFB）DNP-氨基酸，黄色，层析法鉴定,被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸,（4）与荧光胺反应,氨基酸可与荧光胺反应，产生荧光产物，可用荧光分光光度计测定氨基酸含量。,（4）丹磺酰氯（DNS-

11、Cl，5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯）反应常用于多肽链-NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。,（5）异硫氰酸苯酯反应（Edman反应）在弱碱性条件下，氨基酸中的-氨基还可以与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在无水酸中，PTC-氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲（PTH），后者在酸中极稳定。这个反应首先被Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。,+,PITC,苯硫乙内酰脲(PTH-AA),苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）,（Edman反应）,（6）与亚硝酸反应,含游离-氨基的氨基酸能与亚硝酸起反应，定量地放出氮气，氨基酸被氧化成羟酸。测定

12、N2 的体积，即可算出氨基酸的含量。Van Slyke 氨基氮测定法就是根据此反应原理。,含亚氨酸的脯氨酸则不能与亚硝酸反应。,1纸层析法,2薄层层析法,3离子交换柱层析法,4高效液相层析法,5纸电泳,氨基酸的分离与分析,制备氨基酸有4种途径：,从蛋白质水解液中分离提取；,应用发酵法生产；,应用酶的催化反应生成氨基酸；,有机合成法。,适宜于中小规模的生产,可大规模生产,氨基酸的生产（制备）,蛋白质的基本组成,对生物体具有其他特殊的生理作用，参与许多代谢作用，不少已用来治疗疾病。,用于食品强化剂、调味剂、着色剂、甜味剂和增味剂,用于饲料添加剂,调节皮肤pH值和保护皮肤的功能,氨基酸的应用状况,2

13、.3 肽,肽的基本概念,肽命名、书写阅读与分类,天然活性肽,肽类的应用和发展前景,肽的基本概念,肽是由氨基酸构成的聚合物。氨基酸之间通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸氨基脱水缩合形成酰胺键（肽键）连接而成。,肽键：-CO-NH-,肽的命名、书写阅读与分类,由两个氨基酸组成的肽叫二肽，三个称三肽，20个以内又称为寡肽。20个以上称多肽。一般的肽都有一个游离的氨基（N端）和一个游离的羧基（C端）。阅读和书写方向是从N端到C端。多肽化合物的名称，通常按照肽内氨基酸残基的排列顺序，以残基名称（如某某氨酰）从N端依次阅读到C端，并以C端残基全名结束肽的名称。绝大多数肽为线性结构，少数肽为环状结构。,命名

14、举例,氨基末端,羧基末端,下列五肽命名为丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸：,注意：,在开链肽的N端和C端可以有游离的氨基和羧基，而有的开链肽的N端或C端的游离的氨基或羧基被别的基团结合（如烷基化、酰化等）或N端残基自身环化。,例如促甲状腺素释放激素的N端残基是谷氨酸，此残基易于自身环化成焦谷氨酰基（氨基与谷氨酸的羧基脱水缩和而成）。,举 例,谷胱甘肽（GSH）,它的分子中有一个特殊的肽键，是由谷氨酸的羧基与半胱氨酸的氨基缩合而成。由于GSH中含有一个活泼的巯基很容易氧化，二分子GSH脱氢以二硫键相连成氧化型的谷胱甘肽（GSSG）。,谷胱甘肽的生理功用：解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；

15、参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,活性肽-激素类,活性肽-抗生素类,活性肽-在体内的重要作用,生物的生长、发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物钟规律及分子进化等均涉及到活性肽。生物活性肽是机体内传递信息、调节代谢和协调器官活动的重要化学信使。,2.4 蛋白质分子的结构,蛋白质的一级结构 肽键 一级结构测序蛋白质的三维结构 蛋白质的二级结构 超二级结构与结构域 蛋白质的三级结构与作用力 蛋白质的四级结构,蛋白质的结构层次

16、,一级结构,空间结构,二级结构三级结构四级结构,超二级结构结构域,蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。,1、蛋白质的一级结构,定义-蛋白质的一级结构指蛋白质中多肽链的数目；多肽连中氨基酸的排列顺序；包括二硫键的数目与位置。,氨基酸彼此之间通过肽键连接，形成一条多肽链。,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。,N=C 0.127nm键长=0.132nmN-C 0.148nm,肽键,1.由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。2.与肽键相连的六个原

17、子构成刚性平面结构，称为肽单元或肽键平面。由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转。,肽平面或酰胺平面：,酰胺平面与-碳原子之间形成的二面角（和）,蛋白质分子的一级结构测定方法,一.测定蛋白质分子量及肽链数目,二.蛋白质中肽链的拆离,三.氨基酸组成分析、氨基酸末端分析,四.肽链的部分降解及肽片断的分离,五.肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠,六.二硫键与酰胺基的定位,1测定蛋白质分子量及肽链数目a、样品必须是均一的，纯度应在97%以上；b、测定蛋白质的分子质量（电泳、层析、离心等），其误差允许在10%左右。c、通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质相对分子量之间的关系

18、，即可确定多肽链的数目。,蛋白质中肽链的拆离,几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,二硫键的断裂,氨基酸组成分析、氨基酸末端分析,常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸，110真空水解10-24小时左右可使蛋白质完全水解。优点：不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。缺点：色氨酸完全被破坏；羟基氨基酸（丝氨酸或苏氨酸）有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺酰胺基被水解成了羧基。,酸水解,一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10

19、-20小时。优点：可使蛋白质完全水解，色氨酸在水解中不受破坏。缺点：由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化，其产物是D-型和L-型氨基酸的混合物。,碱水解,N-末端分析,二硝基氟苯法（FDNB法）,二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）,异硫氰酸笨酯法（Edman法）,C-末端分析,肼解法,还原法,还原法,羧肽酶法,肼解法 是目前最好的方法 用色谱法鉴定 多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。注:末端若为半胱氨酸或胱氨酸就不能用此法，必须烷基化后再

20、肼解。,羧肽酶的方法 是目前最有效也是最常用的方法。羧肽酶是一类肽链外切酶，它专一地从肽链的C端依次切下一个氨基酸残基，释放出游离的氨基酸。,肽链的部分降解及肽片断的分离,酶解法：胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 嗜热菌蛋白酶等,化学法：溴化氰法羟胺法,R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。,胰蛋白酶,R1=Phe,Trp,Tyr时水解快;R2=Pro 水解受抑。,胰凝乳蛋白酶,化学法：可获得较大的肽段溴化氰水解法：它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽

21、键以及-Asn-Ala-之间的肽键。,Edman降解法,DNS-Edman方法,DABITC/PITC双耦合法,成功用于微量序列分析,顺序分析的最主要的方法,肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠,使测定灵敏度，进一步提高,所得资料：氨基末端残基 H 羧基末端残基 S 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO,片段重叠法重建完整多肽链一级结构,借助重叠法确定肽段次序,末端残基 H S末端肽段 HOWT APS第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序 H O W T

22、 O U S E O V E R L A P S,二硫键的定位:,二硫键与酰胺基的定位,1、采用胃蛋白酶水解：切点多，生成的肽段包括含二硫键的肽段都比较小；酸性环境下防止二硫键发生交换，二硫键稳定。2、将所得的肽段利用对角线电泳技术进行分离。3、然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,对角线电泳：把水解的混合肽段点到滤纸中央，在pH6.5的条件下，进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷的不同分离开来。然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使-S-S-断裂。这时每个含二硫键的肽段被氧化成一对含半胱氨磺酸的肽。滤纸旋转90度角在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。在这里，大多数肽段的迁移率

23、未变，并将位于滤纸的一条对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。,+,-,+,-,第二向,第一向,ab,Brown和Hartlay对角线电泳图解,pH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段,二硫键位置的确定,酰胺基位置的确定,用酸处理含酰胺基的肽链，使其产生游离的NH3和COOH。测出NH3的数量和可能形成的COOH的数量（不包括C端），如两者相等，就可以确定酰胺基的位置。,2、蛋白质的三维结构,天然的蛋白质分子并不是一条走向随机的松散肽链，每一种都具有自己特定的空间结构。线性的多肽链在空间中折叠成特定的三维

24、结构，这种空间结构通常称为蛋白质的高级结构或分子构象。肽键不能自由转动，具有部分双键性质。肽平面间的二面角（和）决定肽链的构象。,二面角（、）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子之间的接近有无障碍。,蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构是指多肽链的主链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。(注:二级结构不涉及侧链的构象)主要有-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲。,定义：,多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；每个aa残基沿轴旋转100.肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴

25、平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。绝大多数天然蛋白质中的-螺旋几乎都是右手螺旋。,螺旋,左手螺旋与右手螺旋,俯视图,螺旋结构表示法,SN,多肽链主链的螺旋结构中以螺旋（也称3.613螺旋）结构最为常见。,凡是有Pro、Gly存在的地方,不能形成。因两个氨基酸不能形成螺旋所需二面角（-57、-47）。静电斥力。若一段肽链有多个带相同电荷氨基酸相邻,则因电荷相斥,防碍螺旋的形成。位阻。如Asn、Leu侧链很大，防碍螺旋的形成。,-螺旋结构形成的限制因素:,-折叠,-折叠或-折叠片也称-结构或-构象，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。-折叠是由两条或多条几乎完

26、全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。,-折叠结构几乎所有肽键都参与链间氢键的形成，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型：一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,平行折叠,反平行折叠,在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中，负责各二级结构单元之间的连接。其特点是肽链回折180，对确定肽链的走向起着决定性的作用。,-回折(-转角

27、),目前发现的-转角多数都存在蛋白质分子表面，它们的含量相当丰富，约占全部氨基酸残基的1/4。,转角结构,转角,转角结构,转角,突起,突起是在折叠的2个相邻的氢键中多出一 个氨基酸残基，形成一个突起，干扰其氢键配对。（多发生在反平行式）,突起的结构,几种情况,无规卷曲或自由回转,无规卷曲与生物活性有关，对外界理化因子极为敏感。,多肽链主链不规则随机盘绕形成的构象。,超二级结构指蛋白质中相邻的二级结构单位（-螺旋或-折叠或-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。超二级结构的基本类型：、X、,超二级结构,迂回,A.迂回 B.希腊钥匙 C.双希腊钥匙,超二级结构类型,X,

28、结构域,结构域的定义,是指在二级结构或超二级结构基础上，多肽链进一步卷曲折叠成相对独立、近似球形的组装体，它是三级结构的局部性区域。,类型：-螺旋域；-折叠域；+域；/域；无规则卷曲+-回折域；无规则卷曲+-螺旋结构域,免疫球蛋白VL-折叠结构域-折叠域,免疫球蛋白,木瓜蛋白酶内的2个结构域,彼此很不相同,弹性蛋白酶的二个结构域,彼此非常相似,蛋白质的三级结构,即多肽链中所有氨基酸残基的空间关系，其具有二级结构、超二级结构或结构域。,定义：,多肽链在二级结构、超二级结构的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲、折叠形成特定的球状分子结构。,肌红蛋白的三级结构,蛋白质的四级结构,由两条或

29、两条以上各自独立具有三级结构的多肽链通过次级键相互缔合而成的蛋白质结构。其中每条多肽链称为亚基。,定义：,通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连亚基单独存在时无生物学活性。一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白。,在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水键。即亚基之间主要是通过次级键彼此缔合在一起。疏水键是最主要的作用力。,维持蛋白质四级结构的主要作用力,（1）血红蛋白的结构特点：a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000。b.是由相同的两条链和两条链组成四聚体22，成人的血红蛋白为22、胎儿的血

30、红蛋白为22c.链由141AA残基组成，链由146AA残基组成。四条肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。（2）血红蛋白的功能：存在于动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH。,血红蛋白的结构与功能,血红素辅基,血红蛋白四级结构,4.5 蛋白质结构与功能的关系,蛋白质一级结构与功能的关系,同源蛋白质一级结构的种属差异性与生物进化 一级结构变异与分子病 一级结构断裂与功能激活,蛋白质空间结构与功能的关系,蛋白质一级结构与功能的关系,同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化,不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目 黑猩猩 0

31、鸡、火鸡 13 兔 10 金枪鱼 21 狗牛猪羊 11 小麦 35 粗糙链孢霉43 酵母菌 44,细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明：（1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。（2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变。,分子病指蛋白质分子中由于AA排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病(基因突变造成的)。,镰刀形贫血病：病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞壁薄，而

32、且脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。,蛋白质一级结构的变异与分子病,谷氨酸在生理pH值下为带负电荷R基氨基酸，而缬氨酸却是一种非极性R基氨基酸，就使得HbS分子表面的荷电性发生改变，引起等电点改变，溶解度降低，使之不正常地聚集成纤维状血红蛋白，致使红细胞变形成镰刀状,输氧功能下降,细胞脆弱易溶血.,HbA:Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS:Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys链 1 2 3 4 5 6 7 8,镰刀型红

33、细胞贫血的分子基础,一级结构的局部断裂与蛋白质的激活,胰岛素原与胰岛素（牛胰岛素原的激活),蛋白质空间结构与功能的关系,当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应。,血红蛋白的变构,对氧亲和力高,对氧亲和力低,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集

34、，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,4.6 蛋白质的重要性质、纯化与鉴定,蛋白质的重要性质蛋白质的两性解离与等电点蛋白质的胶体性质与沉淀蛋白质的变性与复性蛋白质分离纯化的原则与方法分离纯化的一般原则与基本步骤分离纯化的基本原理与方法蛋白质含

35、量测定与纯度鉴定,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的重要性质,蛋白质的两性解离与等电点,蛋白质的胶体性质与沉淀,蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径1-100nm的颗粒，属胶体颗粒范围，而具有胶体溶液的通性。蛋白质的水溶液能形成稳定的胶体溶液原因：、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。2、蛋白质是两性电解质，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒

36、之间相互排斥，不致互相凝聚而沉淀。,如：NH3、COO、OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。,蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等,蛋白质胶体性质的应用,蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等

37、电点状态或破坏其水化层和双电层，蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。此现象即为蛋白质的沉淀作用。分可逆沉淀与不可逆沉淀。,蛋白质的沉淀,可逆沉淀,在 温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶

38、液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。,盐析与盐溶,各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为分段盐析。,盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。,用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。弱酸或弱碱沉淀法机理：破坏蛋白质表面净电荷。,弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀）,在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。注意：有

39、机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。,有机溶剂沉淀法,定 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由 沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如 加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀,当pH 稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合

40、。,重金属盐沉淀,能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下（pH稍小于pI），蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。例如：“柿石症”,生物碱试剂沉淀法,几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速.如：煮鸡蛋,加热变性沉淀法,天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。但一级结构未遭破坏，这种现象称为蛋白质的变性。,蛋白质的变性与复性,引起蛋白质

41、变性的主要因素,1.物理因素：加热、高压、紫外线照射、X-射线、超声波、剧烈振荡和搅拌等2.化学因素：强酸、强碱、脲、去污剂（十二烷基硫酸钠（SDS）、重金属盐、三氯醋酸、浓乙醇等。,蛋白质的变性后的表现,分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；光吸收系数增大；生物化学性质改变。变性后的蛋白质在结构上虽有改变，但组成成分和相对分子质量不变。,蛋白质的复性,如果引起变性的因素比较温和，蛋白质构象仅仅是有些松散时，当除去变性因素后，可根据热力学原理缓慢地重新自发折叠恢复原来的构象，这种现象称作复性。,蛋白

42、质分离纯化的原则与方法,分离纯化蛋白质的意义:1.研究蛋白质的结构与功能 要求纯度高，不变性2.提取活性的酶或蛋白质 必须保持天然活性状态3.作为药物或食品添加剂 纯度要求一般,蛋白质提纯的原则与目标：增加制品纯度或比活力，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质的产量达到最高值。,蛋白质分离纯化的一般原则和基本步骤,1.前处理 生物组织 破碎、溶解、离心 蛋白质提取液2.粗分级 盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级分离3.细分级 层析、电泳 精制品4.结晶 结晶或冻干粉,基本步骤,2、根据溶解度,等电点沉淀盐析（常用硫酸铵）有机溶剂沉淀,3、根据电离性质,电泳离子交换层析,1、根

43、据分子大小,透析或超滤,分离纯化的基本原理与方法,4、特异亲和力：亲和层析,沉降平衡离心法沉降速度离心法,层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,层析,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,电泳,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,蛋白质含量测定与纯度鉴定,含量测定常用方法凯氏定氮法紫外吸收法呈色反应,纯度鉴定标准电泳单点纯层析单一对称峰结晶,