呼吸道病毒标本采集运输、保存与实验室结果判读.ppt

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1、呼吸道病毒标本采集运输、保存与实验室结果判读,湖南省疾病预防控制中心微生物检验科黄一伟2015-12-10,相关呼吸道病毒概况,呼吸道病毒,呼吸道病毒是指一大类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变，或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。拒统计，90%以上的急性上呼吸道感染由病毒引起。,呼吸道病毒的分类,正粘病毒科 流感病毒（A、B、C）副粘病毒科 副流感病毒（I-IV）、呼吸道合胞病毒、偏肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒 小RNA病毒科 肠道病毒（脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒）、鼻病毒、心病毒腺病毒科 腺病毒冠状病毒科 SARS-CoV,229E,OC43,NL63,HK

2、U1细小病毒 博卡病毒（1-4）呼肠孤病毒科 正呼肠孤病毒属疱疹病毒科 单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒 水痘带状疱疹病毒、披膜病毒科 风疹病毒多瘤病毒 WU、KI,呼吸道病毒感染的特点,病毒的多样性和变异性；在引起成人感冒的病毒群中：鼻病毒占30%-35%，冠状病毒占20%-30%，其他病毒占10%-15%。大部分情况下，病毒入侵部位、入侵后繁殖部位、由此引发的组织和免疫病理改变以及表现出的临床症状和体征的部位基本在呼吸道，表现的病情较轻；一般无病毒血症；有些病毒还可引起肠道感染；免疫力不持久；,正粘病毒的基本特征,流行性感冒病毒（简称流感病毒）：是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病

3、毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科理化特性：对热敏感,5630min可灭活；最适pH为7.08.0，3.0和10.0感染力很快被破坏；对紫外线敏感；对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感。,流行性感冒概述,流行性感冒（简称流感）：是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分别 引起的急性呼吸道传染病。临床表现：起病急、高热（3840）、肌痛、头痛伴有严重不适、干咳、咽喉痛或鼻炎，多数患者可在一到两周内恢复。潜伏期短（1-3天）、经呼吸道飞沫传播，传播迅速，抗原易变异，人群对变异株普遍易感，控制难度大，流感流行呈一定季节性。,流感病毒概述,分型与命名 根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人

4、类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群。根据病毒粒核蛋白（NP）和膜蛋白（MP)抗原特性及其基因特性的不同，可以将病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。甲型流感病毒根据其表面结构（H和N）及其基因特性的不同可分为多种亚型。,目前已从甲型流感病毒的天然宿主水禽中分离到16种HA与9种NA亚型的甲型流感病毒。,禽流感病毒H5N1、H9N2、H7N7以及H10N7等均有感染人的报道。血清学的证据表明H4、H6以及H11亚型 AIVs也可能感染过人。根据禽流感病毒对鸡致病性的不同，AIVs可以分为低致病性禽流感病毒（LPAIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）。近几十年，不断有H

5、PAIV和LPAIV感染人的报道，均是由禽直接传给了人，并没有病毒能在人群中有效传播的证据。H7亚型AIVs也可按照地域不同分为两个基因谱系：北美谱系和欧亚谱系，且均有感染人的报道,副粘病毒的基本特征,副粘病毒科(Paramyxoviridae)拥有2个病毒亚科6个属。副粘病毒的基因组为单股负链RNA，不分节段。基因组约1520kb，编码的蛋白811个或更多。副粘病毒毒粒直径约150350nm，含有螺旋状核壳。病毒颗粒呈多形性，但通常为圆形，均有包膜。即使在同一种病毒，毒粒的大小也不相同。细胞浆内复制。,小RNA病毒的基本特征,小RNA病毒(Picornavirus)小RNA病毒有9个属，其中

6、已知5个含有人类病原。小RNA病毒颗粒每个含有4种蛋白（VP1-VP4），各有60个拷贝，呈二十面体对称结构，直径大约30nm，无包膜。小RNA病毒基因组为单股正链RNA分子，大小约8kb，能够在细胞浆内翻译出病毒复制所需的所有病毒蛋白，因此具有感染性。,Cox,肠道病毒,感染特点,非脊髓灰质炎肠道病毒（NPEV），主要包括Cox、ECHO和一些新型肠道病毒；感染广泛，仅在美国每年症状性感染达500万1000万。感染主要发生在夏秋季节，发病率和严重程度与年龄成反比，幼儿是主要受害者；可引起普通感冒、心肌炎、无菌性脑膜炎、脑炎等多种疾病。绝大部分感染是无症状性的，很难与鼻病毒感染区分。,在液体中

7、稳定；脑脊液、血清、全血、尿可以放在原始采集管中送交实验室；直肠或咽拭子、鼻洗液等放入VTM；,样本采集,肠道病毒,鼻病毒,病毒复制及症状特征主要在鼻部，人普通感冒有1/31/2由鼻病毒引起；1960年代分离成功，至1987年已经鉴别了100血清型；根据基因特征可将这些血清型分为A、B两属；2007年发现C属，目前不能培养温带地区感染高峰为每年9月，春天有第二次感人那高峰，夏天可持续发生；无组特异性抗原，型见可有交叉，血清型变化频繁；病毒经呼吸道分泌物从人传播到人；潜伏期23d,病毒排出高峰期与急性鼻炎一致；45d时检测不到病毒或维持低滴度达2周，症状一般维持7d;下呼吸道感染也常发生。尤其是

8、对于婴幼儿、老年人、慢性病患者或原有肺病患者，常与RSV感染不易区分；没有胞膜，对有机溶剂有抵抗力。,感染特点,症状出现后16d均可分离到病毒，病毒排泌13 d明显；标本应在鼻部采集而不是咽部采集；鼻洗液是鼻病毒分离最好的标本；样本4可保存2448h。,鼻病毒,样本采集,线型双链DNA，不分节段，基因组长3000042000bp，编码约30种蛋白；病毒无包膜，二十面立体对称，直径约7090nm，具12个顶角和纤维刺突。,腺病毒,潜伏期58d；通常为局部感染；约5%的儿童急性呼吸道疾病及约10%的婴幼儿腹泻由腺病毒引起；咽炎，急性呼吸系统疾病（3，4，7，21，1，2，5，6），滤泡性结膜炎，流

9、行性角膜结膜炎，咽结膜热，尿路感染（子宫颈炎、尿道炎、出血性膀胱炎）以及无症状持续感染；脑膜脑炎可为腺病毒呼吸道感染的并发症。,腺病毒,感染特点,鼻咽拭子或抽出物、鼻拭子或抽出物、眼分泌物拭子、粪便或直肠拭子、尿、尿道或宫颈拭子以及活检或尸检组织都是可根据病人症状获得的合适标本。疾病早期正确收集样品并立即冷冻送往实验室可大大提高病毒检出率。用血清学方法建立或证实诊断需要配对的血样。第一份样品在症状出现后应立即尽快收集，第二份应在2-4周后收集。,样本采集,腺病毒,冠状病毒,单股正链RNA，27-31KD,5端甲基化“帽子”，3端polyA尾。根据基因序列和血清学，分成三组，感染人类的分属于I和

10、II组，包括229E、NL63、OC43、HKU1和SARS-CoV。,Woo,et al.Exp Biol Med.2009,234:11171127,可引起呼吸道、肠道感染，也可能引起神经症状。非SARS-CoV病毒，通过呼吸道飞沫传播，尚无动物模型，多数感染较轻，为自限性，可加重慢阻肺等疾病。分布广泛，主要发生在冬季和早春，美国数据表明，占成人上呼吸道感染的1024%。病毒分离可用人胚肾细胞或器官培养。,冠状病毒,感染特点,呼吸道病毒标本采集、运输、保存,流感样病例定义,是指发热（体温大于等于38），伴咳嗽或咽痛之一者。,不明原因肺炎病例定义,同时具备以下4条,不能明确诊断为其它疾病的肺

11、炎病例:(1)发热(腋下体温38);(2)具有肺炎的影像学特征;(3)发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计数减少;(4)经规范抗菌药物治疗3-5天，病情无明显改善或呈进行性加重。,呼吸道症候群病例定义,（一）急性感染表现（至少符合下列的一项）：发热（从发病开始有报告和记录），WBC升高或降低，或WBC分布异常，寒战，体温降低（考虑年龄）（二）呼吸道临床表现（至少符合下列的一项）：咽部不适、咽干或咽痛，鼻塞、流涕，鼻/咽/喉明显充血、水肿，咳嗽（新发或咳嗽加重），咳痰，气短，听诊呼吸音异常（湿啰音，干啰音，哮鸣音，浊音），胸痛其中肺炎病例具有上述(一)和(二),并具备-（三）肺炎症状：

12、胸部X线片提示肺部炎性改变注:从肺炎病例采集的标本数比例不少于所承担发热呼吸道症候群总任务量的20%。,针对各种标本的病毒与细菌检测项目的流程图如下：,相关法律法规,依据中华人民共和国传染病防治法开展标本的采集和检测。标本的采集和检测应严格遵守病原微生物实验室生物安全管理条例(国务院424号令2004年11月12日起实施)，并严格做好个人防护标本的保存与运输严格遵守可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部45号令2006年2月1日起施行）具体依据人间传染的病原微生物名录（卫科教发200615号2006年1月11日发布）,病原微生物标本的采集条件,具有与采集病原微生物样

13、本所需要的生物安全防护水平相适应的设备，包括个人防护用品（隔离衣、帽、口罩、鞋套、手套、防护眼镜等）、防护材料、器材和防护设施等具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员具有有效的防止病原微生物扩散和感染的措施具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手段 采集过程中应对标本的来源、采集过程和方法等作详细记录。,病原微生物标本采集原则,早、快、近（病变部位）、多、净应根据病例的临床表现采集不同时期、不同种类的标本 死亡病例最好采集尸检标本，并尽可能地收集医院已检的临床标本 没有条件进行尸体解剖的，可根据检测目的采集呼吸道灌洗液、肛拭子或经皮穿刺采集胸水、腹水、肺组织标本等,病原微生物标本的种类,呼吸

14、道样品：上呼吸道样品：咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻洗液、咽漱液、深咳痰液、鼻咽抽取物。最佳采集时间为发病后3天内，一般不超过7天。下呼吸道样品：呼吸道抽取物、呼吸道灌洗液、胸水、肺组织标本。下呼吸道标本最有利于病毒分离。消化道样品：粪便、肛拭子、胃内容物。其他样品：血液、脑脊液、尿液、疱疹液、瘀斑或出血点、皮肤溃疡分泌液、体液标本、脓或伤口标本、尸检标本。,标本采集的器材和容器,标本采集的器材和容器应是无菌的，在有效期内使用。标本容器最好使用可耐深低温的塑料制品。如外螺旋盖带密封垫圈的无菌螺口塑料管或瓶。采集好的标本应规范标识独立包装在带密封条的塑料袋中。,标本容器,采咽拭子的器材和容器,采鼻

15、拭子的器材和容器,采集血标本的器材和容器,BD SST血清分离胶管 BD SST管内壁均匀喷涂促凝剂加速血液凝固，缩短周转时间（TAT）。惰性分离胶用于离心后分隔血细胞和血清，可提高血清产量，较长时间保持血清成分的稳定，利于样本的复检。分离胶稳定性强，不易吸附血清中的蛋白质，对药物检测及普通的生化检测可得出真实的结果。BD PST血浆分离胶管 BD PST管内含有惰性分离胶，可分隔血细胞和血浆，提高血浆产量，保持血浆成分的稳定。用于采集血浆样本，消除凝血时间，缩短周转时间(TAT)。通常用于重症监护和急诊检测。BD 血清管 BD血清管用于采集静脉血后分离出血清，应用于临床化学、血清学、免疫学、

16、治疗药物监测、微量元素测定。促凝剂的作用是加速血液凝固。采用促凝管可以缩短周转时间。BD血浆管 BD血浆管用于采集静脉血后分离出血浆，应用于临床生化等检验。血浆管内壁均匀喷涂肝素锂或肝素钠用于血液抗凝，适于大多数临床生化检测，可以作为那些不用分离胶管而又需要血浆标本的实验室的主要采血管。BD血糖管 BD血糖管用于血糖测定或糖耐量检测，管壁均匀喷涂抗凝剂（草酸钾）及糖原稳定剂（氟化钠），糖原稳定剂可以使血糖浓度在室温条件下保持24小时稳定。BD EDTA血常规管 血常规管含有EDTA的二钾盐或三钾盐，其中二钾盐呈雾状均匀喷涂于管壁。该管主要用于血细胞学检测如血象，血红蛋白，糖化血红蛋白，环胞素，

17、红细胞叶酸及输血前检测（血型、抗体筛查、交叉配型）。BD血凝管 BD血凝管主要用于凝血四项检测（凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原），指导临床如口服华法林治疗的监控、静脉输注肝素治疗的监控以及“特殊凝血研究”（凝血因子检测、如第VIII因子或血友病因子、血小板功能检测）。BD Vacutainer 血沉管（ESR管）血沉管用于红细胞沉降率的测定，含有3.2%枸橼酸钠溶液抗凝，抗凝剂与血液的比例为1:4。玻璃管可配合血沉架或全自动血沉仪联合使用，该方法为封闭系统，无需打开管帽，采血后直接操作。-BD PAXgeneTM 全血RNA管能稳定血细胞内的RNA水平，延长血液标本

18、体外放置的时间，利于批量采集，细胞转录水平保真性好可用于与血细胞RNA相关的RT-PCR检测，人类疾病基因转录谱的研究及其他RNA转录相关的检测,标本采集方法,咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时檫拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋紧管盖。,标本采集方法,鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出；取另1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔；将上述2根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋紧管盖。,标本采集方法,鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼

19、吸道分泌物。先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用采样液3ml涮洗收集器1次（可用小孩导尿管接在50ml注射器上来代替收集）,吸取过程,正确,错误,错误,不要触摸病人的脸!,标本采集方法,咽漱液：用10ml不含抗菌素的采样液漱口（漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让洗液在咽部转动），然后将咽漱液收集于50ml无菌的螺口塑料管中。无条件的可用平皿或烧杯收集咽漱液并转入10ml螺口采样管中。,标本采集方法,深咳痰液：肺部感染应采取痰标本，以清晨第一口痰为最佳。采集前要求患者用清水漱口数次，以除去口腔内的大量杂菌，患者深咳后，将咳出的痰液收集于含3ml

20、采样液的50ml无菌螺口采样管中。呼吸道灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次（可用小孩导尿管接在50ml注射器上来代替收集）。,标本采集方法,胸水：在B超定位下进行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于无菌的塑料螺口管中。肺组织活检标本：在超声或X线定位下，经皮穿刺取肺组织活检标本，置于含3ml采样液的塑料螺口管中。尸检标本：在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸检，根据检测目的可采集肺、肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等组织标本。病人死亡后应依法尽早进行解剖，无菌采集，每一采集部

21、位分别使用不同消毒器械，以防交叉污染；每组织应多部位取材，各组织应取2050g，淋巴取2个。,标本采集方法,粪便标本：对黏液脓血便应挑取黏液或脓血部分，液状粪便采集水样便或含絮状物的液状粪便25ml；成形粪便至少取5g粪便置于无菌螺口管中，最好加有保存液或增菌液。肛拭子：若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门45cm深处（小儿23cm）轻轻转动一圈，取直肠表面的黏液后取出，用于病毒检测的肛拭子立即放入含3ml病毒保存液的带外螺旋盖的试管中，用于细菌检测的肛拭子需将样品接种到增菌液中，或将标本插入Cary-Blair 运送半固体培养基中，但不得冷冻。,标本采集方法,血清标本：

22、用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，15002000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管中。每一例病人须采集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第34周采集。以空腹血为佳。病例诊断需双份血清。全血：用一次性真空抗凝采血管采集病人5ml静脉血，立即缓慢地颠倒采血管3-5次，4条件下立即送至有关实验室。,不同疾病标本的采集,流行性感冒：采发病3天内流感样病例（T38、伴有咽痛或咳嗽症状之一者,缺乏其它实验室确定诊断依据）的咽拭子或鼻咽拭子放入3-5 ml采样液中或采集病人的含漱液10 ml，冷藏运送至实验室。最好没

23、有服用过抗病毒药物。麻疹：作病毒分离的样品，要在前驱期或出疹初期（T38、3天内）采病人的咽拭子放入3-5 ml采样液中冷藏送至实验室；作血清学诊断的样品，则在出疹后-天采集静脉血，必要时间隔1周再采1次。,不同疾病标本的采集,SARS/人禽流感/MERS：应在发病不同时期分别采集住院病人的不同标本，早期可采集病人的咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液等上呼吸道标本；病人上呼吸机后，可采集呼吸道抽取物、支气管灌洗液等下呼吸道标本；如果病例有腹泻症状，可采集粪便标本；有胸水者可采集胸水标本；须采集急性期、恢复期双份血清；必要时还可采集全血。,51,标本的采集,（一）注意事项确认符合病例定

24、义后尽早采集（尽量在采取治疗措施前）采集时严格无菌操作，减少或避免机体正常菌群及其它杂菌污染采集后应尽快送检。床旁接种可提高病原菌检出率。送检标本应贴条形码，并附送检单，送检单上应注明姓名、(编号)、标本来源、检验目的和标本采集具体时间。填写病例信息调查表。严格按生物安全规范操作。,52,（二）各种标本的采集要求病毒检测：（检测一类标本即可）鼻/咽拭子（必采项）痰液（尽量采集）鼻咽抽吸物（尽量采集）胸腔穿刺液（尽量采集）支气管肺泡灌洗液（尽量采集）血液（尽量采集）细菌检测：血液（必采项）痰液（必采项）胸腔穿刺液（尽量采集）支气管肺泡灌洗液（尽量采集）尿液：军团菌、肺炎链球菌快速抗原检测（必采项

25、）,联合国对感染性物质的运输分类,根据其所运输病原体的传染性和感染后对个体或群体的危害程度不同，分为A类和B类。A类指人感染后发病的可能性大，传染性强，对人群危害性大的烈性感染性物质。高度怀疑具有严重危害性的感染性物质也属于A类。A类之外，仅具有一般危险性，引起感染的机会较少的感染性物质感染性物质为B类,感染性物质运输的包装系统,感染性及潜在感染性物质的运输应使用三层包装系统：内层容器、中层包装、外层包装将样品采用防水、防漏的内层容器包装并贴上指示内容物的标签后装入中层容器内层容器和中层容器间应放置足量的吸水性材料，以便内层容器打破或泄漏时能吸收溢出的所有液体。然后将中层容器固定在硬质外层容器

26、中以免中层容器在运输过程中受到物理性损坏。,标本的包装,A类包装，符合UN2814要求容器或包装材料应达到国际民航组织危险物品航空安全运输技术细则（Doc9284包装说明PI602）规定的A类包装标准,标本的包装,三层包装第一层为离心管第二层为防水、防漏的安全壳容器第三层为运输包装包装要求样本应用吸水纸等包裹，固定在自封袋或离心管内在坚固、防水、防漏的第二层安全壳容器中，用吸水纸等填充物将内有标本的自封袋或离心管固定好，装入第三层包装第二层和第三次包装之间应放置冰排等制冷材料安全壳容器和外包装须与IATA危险物品条例包装制度650相符合,57,标本的运送,血液标本、鼻/咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物

27、、支气管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液、尿液标本采集后应该尽快送检。血培养瓶须在24小时内送检，送检前置于常温环境（15-30）保存。其他标本送检前应保存在4-8，如24小时内无法检测的标本则应置于-70或以下保存，但应避免反复冻融。标本运送过程中，血培养瓶应置于15-30环境中,其他标本应置4-8运送。,收取标本,由医院所在地的疾病预防控制机构到医院收取标本。标本运输之前，应按相关生物安全规定，与样本接收单位生物安全管理部门联系，办理相关手续运送日期确定后，立即将运送时间和运输方式通知接收单位，做好接收准备,59,标本的保存,（一）检测标本的存放血清、呼吸道标本、尿液标本、胸腔穿刺液标本抵达检测实验

28、室后，原则上应尽早进行病毒和细菌检测；进行病毒检测的标本，24小时内能进行检测的可置于4保存，24小时内不能进行检测的则应置于-70或以下保存；用于细菌培养的标本，应立即分离，不应存放后分离。标本应避免反复冻融。（二）标本的长期保存所采标本抵达实验室后，血清、呼吸道标本、尿液标本、胸腔穿刺液标本按需要分装成所需份数，置-70冰箱或以下保存。,60,（二）标本的处理,（一）呼吸道标本用于病毒检测前需进行分装分装鼻/咽拭子标本时，注意充分挤压拭子头，保证细胞充分脱落分装管中用于核酸检测的标本，如粘液成分较重，可进行液化等处理（二）血清标本从血标本中分离血清，分装后按方案要求储存,呼吸道病原谱（1）

29、,流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒和鼻病毒8种病毒以及肺炎支原体和肺炎衣原体的核酸检测。进行细菌培养和鉴定，培养的重点是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、A组乙型链球菌、流感嗜血杆菌。,呼吸道病原谱（2）,对所有细菌分离培养阴性的胸腔穿刺液和支气管肺泡灌洗液，进行针对所检测细菌和肺炎支原体、肺炎衣原体的核酸检测。对全部尿标本进行肺炎链球菌和嗜肺军团菌的快速抗原检测。凡从无菌部位（全血、支气管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液）采集标本证实一种病原体感染，即可视为检测终点，不要求继续进行其它病原体检测。,63,（三）检测程序,检测病毒：人流感病

30、毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人副流感病毒、人偏肺病毒、人冠状病毒、人博卡病毒、人鼻病毒检测方法：核酸PCR检测/Real-time PCR（逐步完善）分离培养和免疫荧光/PCR鉴定血清学检测：各实验室视情况和条件选择实施。,64,呼吸道病毒的核酸检测,1.核酸的提取：自动化核酸提取商品化的核酸人工提取试剂盒公认的传统方法：如分子克隆。2.核酸的检测：RT-PCR，PCRReal-time PCR3.结果的确证和记录：胶回收克隆和测序,65,病毒的分离培养（1）,1.进行病毒分离的标本选择原则：我国目前尚缺乏或存量较少，且具有较大的研究意义的病毒，包括人偏肺病毒，人冠状病毒。在常规监测研究时，

31、某种病毒核酸检测阳性比例的异常增高时或非常规的聚集性病例时，从中选择适当数量病例分离5-10株病毒。鼓励建立人博卡病毒的细胞培养分离体系。,66,2.分离得到的病毒，应采用核酸检测、免疫荧光等方法鉴定病毒种类。3.细胞株：应有明确的生物学背景，来源清楚，并已排除病原体的污染。,病毒的分离培养（2）,实验室生物安全要求,实验室检测相关活动严格按照人间传染的病原微生物名录的要求，在相应的生物安全级别实验室开展病毒培养在BSL-x实验室动物感染实验在ABSL-x实验室未经培养的感染材料的操作在BSL-x实验室灭活材料的操作在BSL-x实验室按照病原微生物实验室生物安全管理条例等相关规定要求，做好生物

32、安全工作,标本上送要求,根据要求，应将阳性和部分阴性标本送省疾控中心、中国控中心进行复核检测实验室检测结果应及时反馈标本送检单位，并尽快上报上级主管部门,A类标本运输的生物安全要求,由专人专车运送，运送人员须有相关资质，且不得少于两人申请单位对与运送人员进行相关的生物安全培训在运送过程中采取相应的防护措施运输前仔细检查容器，要符合安全要求按照规定进行标本运输前的包装和送达后的开启,呼吸道病毒检测实验室结果判读,核酸检测技术的原理,PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的DNA片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DN

33、A合成。特异性：引物序列灵敏度：扩增100万倍,重复13步2535轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,RT-PCR和real-time PCR,RT-PCR：即逆转录PCR，扩增的模板为RNA，增加RNADNA过程。Real-time PCR：即实时荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。,RT-PCR/Real-time RT-PCR的基本步骤,需要主要设备：高速冷冻离心机，PCR仪或荧光定量PCR仪，电泳仪，水平电泳槽，凝胶电泳成像系统，可调加样枪（10ul

34、，200ul，1000ul）。,裂解细胞或病毒释放核酸纯化核酸,反应管中加入提取的核酸,PCR试剂盒混合反应体系,反应管放入PCR仪，自动完成扩增程序,反应管中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳拍照结果分析,PCR检测结果判读,荧光PCR结果判读,结果解释阴性样品,结果解释试验失败,结果解释可疑样品,结果解释可疑样品,阳性样品扩增曲线,病毒分离结果-采用的细胞系,MDCK细胞：流感病毒LLCMK2细胞：副流感病毒，偏肺病毒，冠状病毒CoV-OC43Hep-2细胞：腺病毒，RSVHela细胞：腺病毒，RSV，冠状病毒CoV-229E，副流感病毒HEL细胞：冠状病毒CoV-229EBSC-1细胞

35、：冠状病毒CoV-OC43,MDCK,LLCMK2,Hep-2,检测流程,Influenza A,Influenza B,Screening,Screening,RSV,Negative,尼基氏小体（Negri body）,神经细胞荧光染色照片,血凝和血凝抑制实验结果判断,鸡或火鸡红细胞,豚鼠或人O型血红细胞,阳性（环状）,阴性,阳性,阴性,阳性,阴性,中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测,参考标准,中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）实验室检测技术指南WHO:LaboratoryTesting for Middle East Respiratory SyndromeCoronavirus：

36、interimrecommendations(revised).(September2014）US CDC：Interim Guidelines for Collecting,Handling,and Testing Clinical Specimens from Patients Under Investigation(PUIs)for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus(MERS-CoV)-Version 2,MERS-CoV感染标本采集对象,中东呼吸综合征冠状病毒感染疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例；其它需要进行MER

37、S-CoV感染诊断或鉴别诊断者。,标本采集要求,从事MERS-CoV检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训，培训合格且具备相应的实验技能。在标本采集过程中，采样人员进行安全防护。住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾控机构专业人员指导下采集。密切接触者标本由当地疾控机构负责采集。根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样。,采集标本种类和要求,呼吸道（上、下呼吸道）和其他样品（血清、尿液和粪便）、尸检标本。每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本，下呼吸道标本最佳，建议同时采集粪便和尿液标本。应尽可能采取发病初期和恢复期双份血清标本以确定是否感染，双份血清样品间隔1421天采集比较理想，第

38、一份血清应在发病第一周内采集。但单份样品的检测对于确定疑似病例也有价值，如果只能采集一份样品，应该在出现症状后至少14天采集。,标本的保存,样品采集后应尽快送至实验室，运输过程需合理。若呼吸道样品72小时以上才能到达实验室，强烈推荐将样品储存在-80并使用干冰进行运输，应避免样品反复冻融。从全血分离的血清应4储存并运输，或用干冰、液氮冷冻并运输。由于无霜冰柜温度波动较大，应避免使用无霜冰柜储存呼吸道和血清样品。,院内转运时，标本应该放置在耐用、防渗透的二级容器中进行转运。为减少任何标本破、漏的风险，不要使用任何气动传输系统来转运任何可能疑似患者标本。转运至CDC的MERS-CoV标本应该充分包

39、裹，转运时不能开盖或分装标本。标本转运应该符合三重包装系统要求：内层是主要的容器（一个可密封的标本袋缠绕以可吸收材料），第二层是防水、防渗漏的容器，外层是用于转运的包装。,MERS-CoV感染标本包装和运输,MERS-CoV感染实验室检测方法,核酸检测：为目前早期诊断、早期发现MERS-CoV感染病例的主要检测方法，采用Real-time PCR 进行病毒核酸检测和诊断，患者呼吸道样本中扩增到特异性核酸，可确诊MERS-CoV感染。传统RT-PCR因易出现污染使用受限，但可以获得病毒基因序列。抗原抗体检测:IgM捕获法ELISA检测血清特异性IgM抗体间接法ELISA或免疫荧光方法检测IgG抗

40、体利用假病毒进行中和抗体检测,MERS-CoV的实验室检测靶标,目前病毒核酸的检测方法主要有：检测E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a、N2基因四种。这些方法均高度敏感，推荐upE检测用于初筛;检测ORF1b基因的方法不如针对ORF1a的方法敏感，但比其更加特异;N2基因检测具有较高的灵敏性。另外，已确定了中东呼吸综合征冠状病毒基因组中位于RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）和衣壳蛋白（N）基因的几个适合测序验证的靶序列。,巢式PCR,普通PCR,PCR产物电泳或测序,逆转录，获得cDNA,核酸提取,标本采集,PCR检测,荧光定量PCR,实验方案,待检样品,upE 特异性RT-PC

41、R检测,阳性,阴性,ORF1a RT-PCR检测,阳性,阴性,确 诊,RdRp测序或N 测序,阴性,抗原检测抗体检测病毒分离,阳性,实验流程,upEupE-Fwd 5-GCAACGCGCGATTCAGTT-3upE-Rev 5-GCCTCTACACGGGACCCATA-3upE-Prb 5FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3ORF1bORF1b-Fwd 5-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3ORF1b-Rev 5-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3ORF1b-Prb 5FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAAT

42、GT-TAMRA 3ORF1aORF1a-Fwd 5-CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3ORF1a-Rev 5-CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3ORF1a-Prb 5FAM-TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-TAMRA 3N2N2-Fwd 5-GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3N2-Rev 5-TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3N2-Prb 5FAM-ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ-3,分子检测引物与探针,荧光定量RT-PCR检测结果判断,阴性:无Ct值或Ct为40。阳性：Ct值37,可报告为阳性

43、。Ct值在37-40之间的样本建议重做,若重做结果Ct值 37，该样本判断为阳性,否则为阴性。,MERS-CoV核酸检测结果报告,在实验室要确认一个样本为阳性，需要满足以下两个条件的其中一个：至少两种MERS-CoV特异性PCR结果阳性；一种PCR结果为阳性，另外一种PCR产物序列测序，与MERS-CoV序列相符。当针对MERS-CoV的两种不同的检测方法结果不一致的时候，应当采用反转录PCR扩增，对扩增产物进行测序以确认检测结果。,检测结果判读,阴性结果也不能排除临床病人的感染，一些因素可能产生假阴性，包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和

44、处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异，PCR抑制等。当PCR检测结果为阴性，但临床表现和流行病学特点提示是MERS-CoV感染时，可采用血清学方法进行检测。双份血清标本能够满足血清学检测的要求。,我国首例输入性中东呼吸综合征病例的实验室快速确诊,2015年5月27日晚10时世界卫生组织向中国卫生计生委通报，韩国1例确诊中东呼吸综合征（MERS）病例的密切接触者经香港入境广东省惠州市。5月28日下午，经广东省疾控中心对病例标本进行核酸检测，初筛结果为阳性。样本接收时间：日凌晨1点40分（中国疾控中心病毒病所）实验室确诊结果上报：日凌晨5点40分,疑似MERS-CoV感染的实验室快速确诊,样本

45、来源：KIM MYEONGSHIK(韩国）广东省惠州市样本类型：鼻咽拭子(3份）血清(1份）采样日期：实验室复核检测流程：BSL-3实验室：分装灭活 BSL-2实验室：核酸提取 荧光定量RT-PCR(三个靶标UpE、ORF1b和N2)结果判定与报告,广东省CDC疑似MERS-CoV感染的复核检测,UpE检测扩增曲线,ORF1b检测扩增曲线,N2检测扩增曲线,疑似MERS-CoV感染的送检样本复核检测,荧光定量RT-PCR检测结果（Ct 值）,结论,采用upE/ORF1b/N2 三个靶标，进行三种荧光定量RT-PCR扩增，在对照成立的基础上，三管咽拭子样本检测结果皆为阳性。基于N2靶标的荧光定量RT-PCR扩增，血清标本呈弱阳性。结论：广东疑似MERS-CoV病人实验室检测确定为MERS-CoV感染阳性。,祝各位工作顺利、生活愉快！,