鼠疫病原学及鼠疫实验室管理和运行.ppt

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1、鼠疫病原学及鼠疫实验室管理和运行,新疆疾病预防控制中心,鼠疫病原学,一、鼠疫菌的生物学特性（一）形态和染色：典型的鼠疫菌呈短而粗，中段膨大，两端钝圆，且两极浓染的卵圆形小杆菌,菌体长约12 m，宽0.50.7 m。有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰氏染色阴性。由于涂片材料来源不同，形态特点亦不同。用染疫动物或鼠疫患者及其尸体的新鲜材料所做涂片，一般可见到典型菌体形态，常散在，或成双排列，或呈群聚，偶见有短链状排列。,用琼脂培养物制备的涂片标本，鼠疫杆菌呈球杆状，着色比较均匀，两极浓染不明显或无两极浓染。用肉汤培养物涂片，可见呈散在或者短链状排列的两端钝圆，两极浓染的小杆菌。鼠疫菌在跳蚤消化道内的形态

2、常发生变化，常呈近似球状的卵圆形的球杆菌，有时也呈现两端浓染。陈旧性病灶、腐败材料或在外界环境中生长的鼠疫菌可有多形性变化，这一特性应在镜检过程中应引起足够的注意。,（二）培养特性：鼠疫菌为典型的异养菌，生长时需要多种有机物作为营养物质，不过普通培养基就能满足鼠疫菌的生长。鼠疫菌为需氧菌，也能在厌氧条件下生长，但适量供氧生长最好，氧压过高反而对生长有害。在厌氧环境生长时，发育缓慢且常出现变形。鼠疫菌最适生长温度为2830，在此温度下培育的菌落表面干燥，易于用白金耳从培养基表面刮取，也较容易均匀地悬浮在生理盐水中。在37条件下生长缓慢，培养出的菌落表面湿润、粘稠，不易刮取，不易制成均匀菌悬液。,

3、培养基的最适pH值为6.97.1，但是pH值在5.88.0范围内鼠疫菌均可发育。鼠疫菌虽然在普通培养基上生长良好，但是发育缓慢，一般需要2448小时才能形成肉眼可见的灰白色小菌落，如果培养基质量差或者接种菌量过少，发育至成熟菌落的时间将会更长。,鼠疫菌在普通培养基上的发育，其群体形态具有一定的稳定性，在最适温度条件下在普通培养基上经1618小时培养可见形状不一，呈碎玻璃样小菌落，2448小时后形成肉眼可见灰白色小菌落。在显微镜下，成熟的菌落中心发暗、突起，有黄褐色粗糙颗粒，菌落周边围绕一圈宽窄不等、边缘不整、薄而透明的锯齿状花边。鼠疫菌的这一发育过程及成熟菌落的形态特点，是细菌学诊断的重要依据

4、。,二、鼠疫检验材料的采集、保存和运输（一）鼠疫检验材料的采集：1.人体标本材料的采集：凡疑似鼠疫患者，应争取在服用抗菌药物前采取被检材料标本，各型鼠疫患者除采静脉血液35 ml供细菌学及血清学检验用外，可按临床类型采取以下检验材料标本.1.1 疑似鼠疫患者和密切接者的取材：（1）疑似腺鼠疫患者：选取肿大淋巴结，局部皮肤经碘酒、酒精消毒后用注射器刺入腺体中央，抽取适量组织液，保存于灭菌试管中或直接培养在斜面或平板上；,如腺肿过小取组织液困难，可用无菌注射器抽取0.30.5ml灭菌生理盐水注入腺肿内，停留片刻后，再缓慢抽取液体；如腺肿开放或有波动感，应在腺肿周围浸润部位穿刺抽取组织渗出液。（2）

5、疑似肺鼠疫患者:疑似鼠疫患者如有咳痰时，应用无菌试管、平皿或广口瓶收集痰液；患者无痰时用无菌棉签取咽喉分泌物装入无菌试管内送检。,（3）疑似败血型鼠疫患者:该型患者除采静脉血1 ml以上保存于无菌试管送检外，还应采集咽喉分泌物进行检验。1.2 密切接触者取材:一般采用灭菌棉签自咽喉部取材检查，同时可采取淋巴穿刺液。1.3 疑似鼠疫尸体的取材:经流行病学调查和临床检查，不能排除鼠疫的尸体应以细菌学检查作为最后诊断，取材方法以解剖取材为主，不能解剖取材的可行局部解剖取材或穿刺取材。取材时注意以下事项：,（1）取材前应准备好取材的所有器械、试剂和容器等，如剪刀、镊子、手术刀、骨钳、穿刺针、注射器、生

6、理盐水、酒精、灭菌广口瓶、试管等。以及消毒处理、个人防护的器械和药品等；（2）取材应选取病变损害最明显的部分采集。肝、脾、肺分别置于灭菌广口瓶中，心血置于灭菌试管中；取口腔和鼻腔分泌物于灭菌试管中；若尸体已腐败，可取股骨、胫骨、胸骨、肋骨骨髓。,（3）如不能进行尸体解剖时，可行局部取材。可在尸体的肝、脾、肺相应部位做局部小切口，采集相应的组织材料；（4）对鼠疫尸体在不能进行解剖取材时，也可行穿刺取材。方法是将要行取材的淋巴腺、肝、脾、肺、心等脏器组织部位皮肤经局部70%酒精消毒后，用腰椎穿刺针抽取淋巴腺、肝、脾、肺、心等脏器组织液和心血，分别保存备检。若尸体腐败时，则应从胸骨柄或髂骨抽取骨髓液

7、送检。,2 动物标本材料的采集:动物标本材料取材前必须做详细登记，主要记录动物名称、捕获地点、捕获时间、捕获数量和采集者等信息数据。取材时可根据标本的类型采取相应的方法。2.1 病、死动物的取材:病、死动物标本取材的原则是按先皮下、后胸腔、最后腹腔的顺序进行取材，并在取材时观察皮下淋巴结及各脏器的病理变化。取材注意以下事项：,（1）用3%来苏尔液消毒解剖部位的皮毛，但不宜过湿，以免来苏尔液进入体内，影响检验结果；（2）取材时应选取病变明显处取材，主要是腹股沟肿大的淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏和心血等。（3）若脏器腐败或残缺不全，则应取骨髓检验，其方法 是剥去骨外肌肉，再用酒精棉包裹，然后在近股骨头

8、端用骨钳剪断，以接种针取红骨髓检查。如骨髓已干枯，可用灭菌注射器注入少许生理盐水抽取之，或将另一端打开，用生理盐水直接冲入平皿内培养。,（4）取材时注意每取完一个脏器后均应将剪刀、镊子经来苏尔棉块、清水棉块、干棉块一一擦拭干净，用火焰灼烧，最后沾酒精过火焰冷却后备用；（5）病、死动物的材料应采取两份，一份自检，一份送自治区疾控中心鼠防科复检。2.2 活体动物的取材：捕获活体动物原则上只采取肝、脾或有病变的组织进行检查。每份材料需独立存放于灭菌小瓶内。,2.3 昆虫材料的采集：可进行鼠疫检验的昆虫材料包括：蚤类、蜱类、螨类、吸虱等，其中以蚤类为重点。在进行昆虫标本材料采集时需注意以下事项：（1）

9、宿主动物要单只装袋，并注明采集时间、地点、宿主名称和生境等。（2）同体或同穴的昆虫在分类鉴定后，分组或单只拣入装有蚤类保存液1/20万龙胆紫2%盐水的小瓶内送检。,（二）鼠疫检验材料的保存 鼠疫材料的检验应遵循就近检验的原则，但在无条件时，应采取以下方法妥善保存检验材料。1 组织块的保存：（1）将组织块保存于生理盐水中，用石蜡密封容器，可保存几日。（2）将组织块保存于中性甘油保存液（中性甘油20 ml，蒸馏水80 ml，碳酸钙2g）。将12 cm3的脏器小块放入510 ml上述保存液中，可保存数日。,（3）野外采集脏器材料时常将组织块放入中性油脂保存液（液体石蜡1份；羊毛脂1.5份；凡士林或固

10、体石蜡1份）。加热混匀后，置小广口瓶中高压灭菌后备用。操作时应注意先将保存液溶化，待温度降至不烫手时（约4045）倒入放置脏器块的小瓶内，保存液应将脏器块完全覆盖。该保存液在低温下保存时限不应超过一周。,2 蚤类标本的保存：（1）活蚤的保存：将活蚤置于清洁的试管或小瓶中，用白布封好瓶口。并放入几片无味的绿草，管底放少许干沙或干燥的滤纸块（厚度约1 cm）置于阴暗处，避免接触消毒液及有毒气体。（2）保存液法：将蚤放入1/20万龙胆紫盐水中保存，（配方为2%氯化钠100 ml中加入1:1 000龙胆紫液0.5 ml）。,（三）检验标本（菌种）的包装与运输 1）准确详细填写送检单。应包括：标本（菌种

11、）种类、标本（菌种）数量、采集地点、采集时间、采取标本名称、采集者、送检者、菌种检验者、菌种检验时间、送检单位等。2）按照国家生物安全的相关规定，将装有材料的容器（试管、小瓶等）用石蜡或胶布密封，外裹以塑料布，再用浸有消毒液的棉花包裹后装入特制的容器内并附上详细送检报告单，指派2名人员（其中1名为专业人员）用当地最快的交通工具运送。,三、鼠疫病原学检验（一）鼠疫细菌学检验和鉴定程序 常规的鼠疫病原体检验包括：菌体形态检查、细菌培养、鼠疫噬菌体裂解试验和动物试验四步，通称“四步检验”。,鼠疫菌体形态检查 1 涂片 在收集到检验材料之后要尽快地涂片，剪取腺体、肝、脾、肺、心，用脏器切面在洁净载玻片

12、上压印，或取骨髓、脑脊液及各种渗出液、痰等用接种环直接涂片，或挑取可疑菌落用生理盐水研磨涂片。2 固定 在紧急情况下，允许加热固定，但如果用甲醇（或95%酒精或95%酒精和乙醚各半）固定，可以促进鼠疫菌两端浓染效果更好，并能杀死鼠疫菌。将可疑鼠疫材料涂抹在载玻片上，晾干或制成压印涂片，浸在固定液中，固定510分钟，取出晾干染色。,3 染色 分别用革兰氏染液、美兰染液进行染色。1）革兰氏染色 将结晶紫染液加于已固定的标本上，染1分钟；水洗后用卢戈氏碘液染1分钟；水洗后用95%酒精脱色约0.51分钟，将玻片轻轻摇动直到无紫色继续脱落为止；水洗后用稀释石碳酸复红复染1分钟，水洗待干。2）美兰染色 将

13、染液加在已固定的涂片上，染35分钟，然后再水洗，待干，镜检。,4 镜检 在显微镜下，查找典型鼠疫菌，即两端钝园、两极浓染、卵园形，革兰氏阴性小杆菌（菌体长12um,宽0.50.7um）。显微镜标本对鼠疫菌的鉴别诊断有一定帮助，仅根据鼠疫菌的形态，不能做最后确诊。,细菌培养 鼠疫菌培养可根据待检标本的种类和新鲜程度选用不同的培养基进行分离培养，腐败材料最好经皮感染实验动物，待接种动物死亡或7日处死后取材培养。1 培养基:培养基是细菌培养获得准确结果的基础,必须在营养成分、酸碱度、透明度及高压灭菌等方面严格把关。并进行质量控制。,细菌学监测中常用培养基有：1）营养琼脂培养基：一般市场有售，按说明溶

14、解于蒸馏水中，按一定量分装克氏瓶内，15磅30 min高压灭菌后倒制平板备用。,2）LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠 5 g、琼脂粉6 g（不同生产厂家的琼脂粉加量不同，需做预试验确定加入量）、蒸馏水1 000ml。制备时将所有成分加热溶解，用1 N氢氧化钠将pH调至7.2；分装克氏瓶内，每瓶约300 ml；15磅30 min高压灭菌；待克氏瓶中培养基冷却至50左右，无菌条件下倒制平板，每个平板倒入约15 ml，分离细菌时使用。,3）琼脂斜面：将上述溶化好的琼脂培基分装量为试管的1/5，15磅30 min高压灭菌后，取出趁热摆放制成斜面，斜面长度约为试管长度的1/3。4）琼脂

15、高层：将上述溶化好的琼脂培基分装量为试管的1/3，15磅30 min高压灭菌后，取出竖直摆放冷却备用。,2 取材和接种 培养前取材的器械消毒应按以下顺序进行:剪刀、镊子等先用浸有来苏尔液的棉球擦试清水棉球擦干棉球擦干过火焰浸入95%酒精中取出过火焰，冷却后取材。每取完一个脏器，剪刀、镊子等都需重新严格消毒。,1）疑似患者的材料:淋巴腺穿刺液：在含菌量高时，用白金耳划线培养，如已用生理盐水稀释的穿刺液，则必须充分振荡，然后用白金耳做划线培养。或用毛细管滴于培养基表面12滴，再用白金耳划线。痰：痰的培养以稀释培养法较宜。用棉签采取的咽喉分泌物可直接涂于培养基。血液：直接培养。将1 ml血液加入5

16、ml肉汤内，培养24小时后，再用白金耳取出，培养在平板上。脓汁：培养法同痰液。,2）尸体材料:脏器：根据不同的脏器材料，采取不同的培养方法，并做好详细标记。用灭菌剪刀剪下一小块脏器材料，以镊子夹住，直接点于培养基靠边处,然后用白金耳划线。骨髓：一般以接种针采取骨髓，直接划线培养。,3）病死鼠脏器材料:培养的原则是单只培养、单只接种。将新鲜脏器切面直接点种于琼脂平板靠边处，然后用白金耳划线培养。点种后的脏器制成悬液接种试验动物。对于较腐败的死鼠脏器，可直接用白金耳从脏器切面上取材划线培养，或通过小白鼠后再进行细菌培养。,4）捕获活鼠脏器材料：培养原则是单只培养，集组接种，每组 10只。一般情况下

17、只取肝、脾检验，每两只鼠脏器，分别培养于1个平皿上。按同一时间、同一地点捕获的同种动物培养后可分组进行动物试验，但每组一般不得超过10只，小型啮齿动物不得超过15只。,5）蚤、蜱等昆虫材料：病死鼠体蚤均需单只检菌，将蚤体放入灭菌的凹玻璃板上，用生理盐水冼3次，将后胸背板和第一腹节剥开，用解剖针固定肛门前方，再用另一解剖针从头部刺入，拉出蚤胃，用灭菌白金耳在板上将胃磨破，接种于培养基上。,3 培养 鼠疫菌的最适培养温度为28，培养的动物材料连续观察3天，病死材料及蚤类材料连续观察5天，3天或5天不生长即可处理。值得注意的是，野外实验室应随时观察孵箱温度的变化，始终保持在2830之间。,4 结果观

18、察 培养2448小时后肉眼可见菌落形成，直径约0.10.2 mm,中央突起半透明淡灰色小菌落.镜下菌落中央呈黄褐色,有粗糙颗粒,边缘薄呈半透明有锯齿状花边。将具有上述特点的菌落挑选出来进一步做鼠疫噬菌体试验。菌落观察必须仔细认真，肉眼初筛后，应勾画出可疑菌在镜下进一步观察确认，不得轻意丢弃。,鼠疫噬菌体裂解试验 鼠疫噬菌体裂解试验是鼠疫细菌学诊断中较特异的诊断方法。,培养时发现的可疑菌落，用白金耳勾出移种在另一个琼脂平皿上，接种划线要密。然后用注射器滴加1滴鼠疫噬菌体于划线部位起点中心部分，合起平板并倾斜使噬菌体流线与培养划线垂直交叉流下，放入28温箱中，次日观察结果。如出现噬菌带则判为鼠疫噬

19、菌体裂解试验阳性。即可判定为鼠疫菌。一般做培养检查的同时做噬菌体裂解试验。即同时接种两个琼脂平皿，一个做培养检查，另一个做鼠疫噬菌体裂解试验。,操作中应注意以下几点：1）疫噬菌体必须保持足够的效价（一般是10-8）效价降低到一定程度，则噬菌带不明显，噬菌体失效则不出现噬菌斑，造成错误的判断。2）使用噬菌体前需观察有无污染，如有污染不得使用。3）操作要规范，滴加噬菌体时，必须让噬菌体液自然流下。,4）真假阳性的区别：阳性：噬菌带中间无鼠疫菌生长，噬菌带边缘在显微镜下有被侵噬的斑纹噬菌带逐渐扩展，扩展后两边有形象模糊的边缘。假阳性：噬菌体流道中间有与培养菌相同的菌落，流道边缘菌落或菌苔完整，由于细

20、菌生长，流道逐渐缩小或不明显。,动物试验 动物试验在鼠疫细菌学检查中有2种目的。一种目的是材料含菌量少或材料腐败，培养不易获得阳性结果时，以敏感动物体培养，同时也为了观察细菌对动物的致病性和病理变化；另一种目的是菌株已经分离出来，为了测定该菌株毒力的强弱，或者为了增强菌株的毒力，而作动物试验。试验动物常用小白鼠（18-20g）和豚鼠（250-300g），而以豚鼠最好，因小白鼠对鼠疫菌的毒素较敏感且在夏季死亡后极易腐败，分离鼠疫菌较困难。,1 被检悬液的制备：（1）脏器：将所取脏器块放入已消毒好的乳钵中剪碎研磨后，按1:10的比例加入生理盐水，为了便于注射器吸取脏器悬液，可在脏器悬液中加一小块灭

21、菌脱脂棉。（2）昆虫：将已分类好的蚤、蜱从保存液取出，用灭菌盐水反复冲洗数次，然后研磨制成悬液，接种动物；当检获大量蚤类时，可按地区、宿主、蚤种进行分组，每组30只。,2 接种方法：根据不同目的、被检材料新鲜及腐败程度来决定接种方法。（1）腹腔接种：一般新鲜材料和纯培养的菌液，为了迅速获取阳性结果而又不期待它出现较完全的病理变化时多用腹腔接种。将腹部皮肤注射部位剪毛，经消毒后提起腹部，将被检悬液注入腹腔，注意不得损伤内脏器官。接种量为小白鼠每只0.20.4ml，豚鼠每只接种0.50.6ml。,（2）经皮接种：这种方法多用于腐败或污染程度严重的材料。将小白鼠或豚鼠腹部毛剪去一小块，用刀刮至有出血

22、点后，将待检材料以棉拭子涂布于已刮过的皮上并反复揉擦，使液体充分浸入。（3）皮下接种：材料不太腐败时此方法较好，一般病程短，病理变化较明显。是动物接种最常用的方法。,试验动物鼠蹊部经消毒后将被检悬液注入皮下，接种剂量同腹腔接种法。一般每份材料接种两只小白鼠，按材料的新鲜与腐败的不同程度常采取两种不同途径进行接种。如材料新鲜可采用皮下、腹腔各一只，如果材料腐败，则可采取皮下、经皮各接种一只。,3 饲养与结果观察:（1）实验动物接种后，放入饲养盒内，详细记录编号、接种日期等，每日观察12次，直至动物死亡或57天观察期满，处死剖检。同时应注意感染动物死亡后，饲养盒的清洗与消毒。,（2）鼠疫材料的实验

23、动物，一般13天发病（症状为不摄食，竖毛尤以背部为明显衰弱），37日死亡。动物死亡后应迅速解剖，观察病理变化并做培养及噬菌体裂解试验。必要时可进行动物传代。感染34天死亡的动物，解剖时常见急性鼠疫特有的病理变化，皮下血管充血，肝、脾有微小病死灶，充血并肿大，肺充血，心血不凝，皮下注射部位可见出血性浸润，注射部位淋巴结肿大。,（二）鼠疫菌的判定依据及鉴定：（1）形态特征与染色特征与鼠疫菌相符。（2）培养特征与鼠疫菌一致。（3）被鼠疫噬菌体裂解，但应注意排除假噬菌现象，该项指标为判定鼠疫菌的主要依据。（4）实验感染的小白鼠或豚鼠，具有鼠疫特有的病理改变，并从实验动物体内分离出鼠疫菌。,（三）结果报

24、告：判定为鼠疫菌时，除通知送检单位以便及时采取防治措施外，应立即以书面形式连同两只试管培养物，按照卫生部可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定进行包装和运输，派专人专车上送省级专业机构作复查判定。上报内容包括：被检材料的种类、数量、来源、时间、送检者、收到时间、检验者（单位、姓名并盖章）主要判定依据。培养物在送检同时要留一份备查，待作出最终判定后再行销毁或上送。,鼠疫实验室及其管理和运行,按照中国的病原微生物实验室生物安全管理条例（国务院令424号）和实验室生物通用要求（GB19589-2004）的规定，鼠疫病原微生物操作实验室应具备国家二级生物安全水平（BSL-2）。,（

25、一）基本要求 1 鼠疫细菌学检验必须在专用的BSL-2实验室内进行。2 检验人员必熟悉并遵守BSL-2实验室工作制度、自身防护规则及有关技术操作规程。,3.凡进入毒菌室操作，必须2人以上同时工作。及时准确做好检验的各项实验记录。4.实验室管理实行人员准入和使用审批制度。5.实验室工作人员，实行资格证书和准入制度，符合规定资质的人员经生物安全岗前培训，考试合格，获得岗位资质证书；并签定生物安全责任书后方可办理准入手续。,（二）生物安全实验室的建立和要求 生物安全实验室是进行病原微生物分离、培养、鉴定和保存的专用实验室，它可以保证工作人员自身安全、防止环境污染的意外事故发生，提高疾病控制机构抗御事

26、故的能力。完整的生物安全实验室由以下三部分构成：（1）生物安全实验室设施、设备和个人防护装备；（2）有一定数量的、经正规培训的技术人员；（3）综合的生物安全管理手册、标准操作程序。,实验室的设施要求：实验室生物安全防护屏障：级生物安全防护水平（BSL-1）：级生物安全水平是指实验室操作、安全设施适应于从事明确生物学特征的、已知在健康成人中不引起疾病的、活的微生物菌（毒）株的实验活动要求达到的水平。,级生物安全防护水平（BSL-2）：标准的BSL-2实验室除了满足BSL-1的要求以外，在门上增加生物危险标志、级生物安全柜、高压蒸汽灭菌器、安全离心机罩帽、防溅罩或眼罩、冼眼器等。1）使用设计原则：

27、必须为实验室安全运行、清洁和维护提供足够的空间。应设有各自独立的个人办公室、辅助实验室（存储与实验准备间）、操作实验室。实验室门应带锁并可自动关闭。实验室门应有可视窗，门口应设有防止节肢动物和啮齿动物进入的设施。门上贴有符合要求的BSL-2实验室危险标志。如应用窗户自然通风，应有防虫纱窗。,每个实验室的墙壁、天花板和地面应平整、易清洁、不渗水、耐化学药品和消毒剂的腐蚀。地面应防滑，不得铺地毯。实验台应防水，耐腐蚀、耐热。实验室中的厨柜和实验台应牢固。厨柜、实验台之间应保持一定距离，以便于清洁。在实验室门口应设有挂衣装置，个人便装与实验室工作服分开放置。在实验室内应穿专门工作服；戴乳胶手套。实验

28、室应保证工作照明，避免不必要的反光和强光。有可靠的电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等应设专用电源。,应在实验室内配备生物安全柜，生物安全柜应安装于人走动少的地方，不应安装在门口。生物安全柜的背面、侧面与墙壁之间的距离宜保持不小于150300 mm的检修距离，顶部也应留有不小于300 mm的空间。应有适当的消毒设备，在靠近实验室的位置配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。,2）县级BSL-2建设要求：设施要求：要满足上述通用要求，可在公用实验室区域选取足够的房间，一间作为工作人员的办公室兼作个人物品存放和仓储,按进入次序依次为准备间，面积适宜；最后是

29、操作感染性材料的实验室，面积30 km2左右为宜（详见通用要求）。装备要求：有条件的在BSL-1和BSL-2实验室都应设置通风厨或负压罩，用作有害气体、化学物操作；必须安装生物安全柜，用于操作感染性材料中容易产生气溶胶和喷溅的操作。建议选用CLASS级安全柜，符合国际分级标准；配备高压蒸汽灭菌器和生化培养箱。,（三）鼠疫BSL-2实验室的管理 1、生物安全管理(1)实验室主任（对实验室直接负责的人员）负责制订和采用生物安全管理计划以及安全或操作手册。(2)实验室主管（向实验室主任汇报）应当保证提供常规的实验室安全培训。(3)要将生物安全实验室的特殊危害告知实验室人员，同时要求他们阅读生物安全或

30、操作手册，并遵循标准的操作和规程。实验室主管应当确保所有实验室人员都了解这些要求。实验室内应备有可供取阅安全或操作手册。(4)应当制订节肢动物和啮齿动物的控制方案。(5)如有必要，应为所有实验室人员提供适宜的医学评估、监测和治疗，并应妥善保存相应的医学记录。,2、实验室管理（1）实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的的物品。（2）发生具有潜在危险性的材料溢出以及在每天工作结束之后，都必须清除工作台面的污染。所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃和清洁再利用之前，必须清除污染。（3）认真做好实验记录，特别做好各种仪器设备运行记录。,（4）各种仪器、设备要经过有资格的计量部门的鉴定，并有标志。

31、（5）妥善保管易燃、易爆的有害化学物和气体，对其操作时要在通风柜内进行。（6）按要求做好水电的管理和安全。,（四）实验室操作规范 从事鼠疫微生物的操作，都应遵循下列基本原则：（1）所有操作人员必须经过专业技术培训，经考核批准才能工作。（2）熟悉各种仪器的操作步骤和要点，进行正确的操作和使用。（3）应掌握各种感染性物质操作的一般准则和技术要点。严格按照鼠疫操作手册进行操作。,（五）鼠疫强毒实验室操作规程 1、凡是鼠疫材料、疑似材料的检验或鉴定等项工作必 须在鼠疫强毒实验室内进行。2、鼠疫强毒实验室操作，需有2名工作人员同时进入。3、强毒区工作前，用紫外灯照射半小时消毒工作区域。4、工作人员按要求

32、着装，才能进入强毒区域。,5、进入实验室（1）进入实验室时，每进入一道门，应先将此门关好，再开启下一道门。（2）实验过程中所需要的其它物品应从传递窗送入。（3）进入实验室后，关闭紫外灯。（4）做好开始实验的各项准备。,6、实验操作1）凡是鼠疫材料及疑似材料的检验或鉴定，包括菌种开封、细菌分离、培养或其它操作，均应在实验室生物安全柜内进行。2）在进行实验工作之前，工作台面先用消毒液灭菌并铺放浸有消毒液的毛巾，随时进行工作台面的消毒。3）进行细菌操作时，使用一次性接种环或使用接种环电热灭菌器燃烧灭菌接种环，避免菌液或菌块飞溅。4）稀释菌液时，将吸管插入试管或烧瓶底部，用吸球缓慢打击菌液，避免产生气

33、泡。,5）实验中需使用酚、氯仿等腐蚀性试剂时，应在乳胶套外 加戴一次性塑料手套。6）离心时，应使用双盖封闭式离心机和全封闭试管，每管离心液总量至少低于最高容量1个刻度单位；平衡时不得有菌液渗漏到套管中，离心机使用后立即用消毒液擦洗消毒。7）进行实验操作时，勿用手直接对接或拔开注射器和针头，以免划破皮肤或无意接种。8）禁止在空气中直接排放含有菌液注射器内的气泡，以免 形成气溶胶。9）实验中使用的利器，应用利器盒直接收集处理。,10）接种了强毒鼠疫菌的动物必须饲养在封闭的实验动物室内，并有明确的实验记录11）未分离到鼠疫菌的动物尸体必须在实验室内用5%来苏儿浸泡5昼夜，然后深坑掩埋。染疫动物尸体必

34、须5%来苏儿浸泡后，再高压灭菌后深埋。12）工作完毕，检查各仪器设备是否恢复零位，做好使 用记录。13）实验操作结束后，用消毒液消毒、清理工作台面、地面等，并详细记录所做的工作内容。,7、出实验室及脱个人防护装备。1）先用消毒液浸泡手套、长筒胶靴5分钟。2）用喷雾器从上至下喷雾消毒防护服。3）脱个人防护装备并按要求进行消毒灭菌。4）最后使用75%酒精对手部、面部及暴露部位擦拭消毒，用3%硼酸水漱口后离开实验室。8、关闭实验室，打开实验室紫外灯进行30分钟消毒。,（六）实验室操作防护和个人防护：1、实验室操作防护（1）进行实验室操作，任何时候都必须戴口罩和防护眼镜、穿着反背隔离防护服，穿防护鞋袜

35、，不得裸露腿部和脚趾，必要时穿连体衣。（2）在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，先消毒再摘除，随后必须洗手。（3）在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。,（4）为了防止眼睛或面部受到洒溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，必须戴安全眼镜，必要时戴面罩（面具）或其他防护装备。（5）严禁穿着实验室防护装备离开（如去餐厅、办公室、图书馆、员工休息室和卫生间等），更不能把防护器材带回家。（6）禁止在实验室的准备间和操作间里进食、饮水、吸烟、化妆、处理隐形眼镜和储存食品和饮料。（7）在实验室内

36、用过的防护服要消毒后再清洗，不得和日常服装放在同一柜子内。,2 个人防护除符合BSL2的要求外，还应该符合下列条件：（1）工作人员在进入实验室时必须使用个体防护装备，包括两层防护服、两层手套、生物安全专业防护口罩（不应使用医用外科口罩等），必要时佩戴眼罩、呼吸保护装置等。工作完毕必须脱下工作服，不得穿工作服离开实验室。可再次使用的工作服必须先消毒后清洗。（2）在实验室中必须配备有效的消毒剂、眼部清洗剂或生理盐水，且易于取用。实验室区域内应配备应急药品。,（3）个人防护用品的穿脱顺序 穿脱顺序应根据使用的防护服而定，一般原则是先穿后脱，后穿先脱，严格区分洁净品和污染品。（1）穿防护用品顺序：穿内

37、防护衣、裤-穿靴套-穿胶靴-戴帽子-戴口罩-戴手套-戴猴帽-穿外防护衣-戴大口罩-戴手套-戴防护眼镜或面罩。（2）脱防护用品顺序：全身喷雾消毒-消毒液泡手-摘下防护眼镜或面罩-脱外防护服-摘下大口罩-摘下猴帽-摘外层手套-摘帽子、口罩-脱胶靴-脱靴套-摘内层手套-脱内防护裤、衣-使用75%酒精对手部、面部及暴露部位擦拭消毒。,（七）实验室消毒 1）鼠疫实验室日常消毒要求1、实验室应制定日常消毒制度，定期进行消毒处理，有专人负责检查实验室日常消毒情况。2、实验室常备75酒精、实验室消毒槽（池）、浸泡缸、喷雾器并备有足量500-1000mg/L二氧化氯溶液或3-5的来苏儿（或石炭酸）溶液供随时消毒

38、使用。3、实验室使用前后均应开启紫外线消毒装置进行空气消毒，照射时间不低于30min。,4、进行细菌学检验操作时，用1000mg/L二氧化氯溶液或3-5的来苏儿溶液浸湿的毛巾铺工作台面，工作结束后，将毛巾和废弃物置浸泡缸消毒后高压处理。用75酒精擦拭工作台面，用500-1000mg/L二氧化氯溶液或3-5的来苏儿溶液擦抹地面。如发生工作面污染，培养物溅落等情况，在污染部位喷洒消毒液，保持十分钟，抹去消毒液，再以75%乙醇擦拭。5、鼠疫现场实验室可以定期用甲醛熏蒸，密闭过夜，充分通风后使用。生物安全实验室按规定操作。,2）实验室消毒方法：1、人员卸装消毒：在简易和普通鼠疫强毒实验室内，工作结束后

39、将手和脚（穿着胶靴和手套）在消毒液内浸1-3分钟，全身经喷雾消毒,然后在消毒间按着装相反顺序脱下(手术手套在偏衫后脱)，可高压的防护装备经高压灭菌，面罩或眼镜用75%酒精棉球消毒。最后洗手，用75%酒精棉球擦面部裸露部位,用3%硼酸水漱口后,方可离开实验室。2、实验器皿：玻璃、搪瓷和不锈钢制品的实验器材可以采用浸泡方式消毒，消毒液为5来苏儿（或石炭酸）或1000mg/L的二氧化氯溶液，浸泡24小时以上。,3、鼠疫菌培养物和其它严重污染器皿浸泡消毒后还应进行121（0.105MPa）30分钟高压灭菌。4、鼠疫感染的动物尸体原则上行焚烧处理；没有焚烧条件的消毒液浸泡处理24h以上，,进行蒸汽高压灭

40、菌后深埋（2m以上的深度）。5、精密仪器和不便用消毒液消毒的仪器设备必须用75酒精擦拭3遍以上，或用甲醛熏蒸48小时以上。6、污水和废水处理：实验室的污水和废水未经消毒严禁排入公共下水道。实验室用水应有搜集容器，并根据搜集的废水容积，加入适量含氯消毒剂，使终浓度含有效500-1000mg/L，消毒处理24h后排放。,3）野外实验室监测工作开始前和结束后的清洁与消毒 1 监测工作开始前：（1）认真清扫并用甲醛熏蒸。（2）用来苏尔和杀虫剂喷洒地面。（3）封闭一天后，开窗通风。2 监测工作结束后：（1）彻底处理污染物品后，用甲醛熏蒸。（2）来苏尔喷洒实验台及地面。（3）封闭一天后，开窗通风。（4）彻

41、底清扫并进行安全检查。,（八）鼠疫菌种管理 实验室单位必须认真按照国务院（424）条例做好菌种管理工作。并落实以下工作。（1）建立感染性材料菌种、样本的采集、接收、保管、领取、发放、使用销毁的批准、登记制度。（2）一般情况县级卫生部门不可设长期菌种库。在试验期间，可建立临时样品或菌种保藏室，但务必严防丢失、被盗，必须设立双锁。（3）储藏室的双锁的钥匙应由2人分头负责保管，只有2人同时到场才能索取菌种。,（九）鼠疫材料的运输包装分类 按国际民航组织文件Doc9284危险品航空安全运输技术手则的分类包装要求，将相关病原和标本分为A，B两类，对应的联合国编号分别为UN2814和UN3373；A类中传

42、染性物质特指菌株或培养物，应按UN2814的要求包装和空运，其他相关样本和B类的病原和相关样本均按UN3373的要求包装和空运；通过其他交通运输的可参照以上标准包装。,（十）实验室意外事故和应急处置 1、一般实验室事故，如培养物跌落破碎等，应立即在污染区域喷洒消毒液，待消毒液彻底渗透污染物后，再进行清理。清理时特别注意防止破碎玻璃等锐利物品割伤皮肤。清理出来的污染物应立即泡入消毒液中，清理后的场所再用消毒液擦拭后，方能重新开始工作。,2、可能造成人身伤害的实验室事故，如污染物溅落在身体表面、割伤、被感染动物咬伤等情况，应立即紧急处理：未破溃的皮肤表面用消毒液清洗，伤口用碘酒酒精消毒，眼睛用生理盐水冲洗后滴加氯霉素眼药水，事故的情况应及时向领导报告。根据感染鼠疫的可能性，决定预防性使用对鼠疫有效的抗菌药物，并对受伤害者进行隔离观察。判明确实感染鼠疫时，按有关规定报告处理。,3、工作人员从事鼠疫强毒操作后，7日内发生不明原因的咳嗽、发烧和可疑为鼠疫的症状时，必须向领导报告，不得擅自到医院就诊。不能排除实验室感染时，应按鼠疫进行隔离观察和治疗。只有在排除鼠疫感染情况下方可到医院就医。,谢 谢！,