生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离.ppt

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1、第二章生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离,概 述,微生物或动植物细胞在合适的培养基，值，温度和通气搅拌（或厌气）等发酵条件下进行生长和合成生物活性物质，因为在其培养（发酵）液中包含了菌（细胞）体，胞内外代谢产物，胞内的细胞物质及剩余的培养基残分等。不管人们所需要的产物是胞内的还是胞外的或是菌体本身，都首先要进行培养液的预处理和菌体回收，只有将固，液分离开，才能从澄清的滤液中采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出发进行破碎、碎片分离和提取胞内产物。,发酵（培养）结束后，首先将菌体或细胞、固态培养基等固态悬浮颗粒与可溶性组分分离，即固液分离。如固态悬浮颗粒较粗大，可直接进行。如固态悬浮颗粒

2、较细小，应先进行预处理。如产物在胞内，还应先进行细胞破碎。,第一节确定预处理方法的基本条件,一、了解生物活性物质存在的部位胞外：细胞产生后，分泌到培养液中胞内：游离在胞浆中、结合在质膜上等,二、稳定性分离提取时，生物活性物质处于不断变化之中，可被细胞本身的酶所破坏，或为微生物所分解，还可能在制备时受到pH值、酸、碱、温度、金属离子、盐、机械搅拌等的作用。如青霉素稳定性较差，发酵液酸化pH需控制在4.85.2，并且低温。多粘菌素E稳定性较好，可在pH2.0、95处理，可提高过滤速度。,三、提取工艺对滤液质量的要求不同工艺路线对滤液要求不同离子交换法：无机离子、灰分要求低溶剂萃取法：要求蛋白质含量

3、较低，减轻乳化直接沉淀法：对滤液质量要求高，需反复过滤，结晶前还要脱色处理。如四环类抗生素。,第二节生物材料的预处理,预处理的目的（1）改变发酵液的物理性质，以利于固液分离。主要方法：加热、凝聚和絮凝。（2）去除发酵液中部分杂质（可溶性胶状物质和无机盐等），以利于后续各步操作。可溶性胶状物质：杂蛋白、核酸、不溶性多糖等，可使溶液黏度增加，影响固液分离速度及后续操作（如堵塞层析柱头）。,一、菌丝体和蛋白质的处理,（一）等电点沉淀等电点时蛋白质溶解度最小（调pH）（二）变性沉淀变性蛋白质的溶解度较小，而产生沉淀加热：使蛋白质变性、凝聚，同时降低液体黏度，加快过滤速度链霉素生产中，采用调pH至酸性（

4、pH3.0），加热至70，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。柠檬酸发酵液，采用加热至80以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。,（三）加各种沉淀剂沉淀某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀，如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等,（四）加入凝聚剂（小分子）可使细胞、细胞碎片及蛋白质等胶体颗粒去除。凝聚：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。胶体稳定的因素：电荷、水化层电解质能中和电荷、破坏水化层与蛋白质盐析的机理相同。,发酵液的带电现象,发酵液中的细胞、菌

5、体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分，在相距胶核表面约一个离子半径的stern平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层或stern层；在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模

6、型。,（五）加入絮凝剂（高分子）絮凝剂：天然或人工合成的有机高分子化合物，具长链线状结构，易溶于水，有大量的活性基团。吸附胶粒，产生架桥连接，形成粗大的絮凝团，有助于过滤。可与凝聚剂配合使用，提高絮凝效果。影响因素：（1）分子量：链越长，吸附架桥效果越好，但自身在水中溶解度也降低。（2）用量：增加用量，有助于架桥，但过多会引起吸附饱和，降低絮凝效果。（3）PH值：影响电离度，从而影响链的伸展形态。（4）搅拌速度和时间：适当搅拌，可使絮凝剂迅速分散，但过快会打碎絮凝团。,常用的絮凝剂,聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）类和聚乙烯亚胺（polyethyleneimine）衍生物，根据活性基

7、团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和

8、不污染环境。,凝聚和絮凝：均是破坏发酵液中胶体的稳定性，增大颗粒尺寸，增大颗粒的沉降或浮选速率。（六）吸附加入反应剂，相互反应生成沉淀，能吸附蛋白质和菌体等胶粒，同时起助滤剂作用。如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾K2Zn3Fe(CN)52的胶状沉淀，能将杂蛋白和菌体黏附而除去。在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。,（七）酶解法去除不溶性多糖 不溶性多糖会增大溶液黏度，使固液分离困难，可加入淀粉酶进行水解，将发酵液中多余淀粉水解。,二、高价金属离子的去除,对提取和成品

9、质量影响较大。（一）离子交换法通过阳离子树脂如四环素发酵液通过122型树脂，除去Fe3+，同时也吸附色素，提高滤液质量。（二）沉淀法形成不溶性沉淀去除Ca2+，常用草酸钠或草酸，形成草酸钙沉淀去除Mg2+，可用草酸、磷酸盐、三聚磷酸钠等去除Fe3+，加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀,问题,1、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？2、除去发酵液中杂蛋白的常用方法有哪些？3、如何去除发酵液中的多糖、金属离子？4、凝聚和絮凝有哪些不同之处？,第三节 细胞破碎,一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位成

10、分等。这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。,细胞破碎,胞内产物：青毒素酰化酶、碱性磷脂酶等但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。,几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物,细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞

11、壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。胞内的生物活性物质的稳定性差,条件不适极易失活。特别是微生物细胞十分微小,细胞壁结构比较紧密,一般方法不易将细胞打破,有些技术虽然可以,但条件严苛,胞内生物活性物质在此条件下很易失活,限制了一些技术的应用。在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。,细胞破碎,细胞破碎,通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被

12、胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。,细胞壁的成分,细菌细胞壁主要成分是肽聚糖革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层组成（2080nm)，较难破碎。革兰氏阴性菌的细胞壁的肽聚糖层较薄（23nm)，还有两层外壁层。,肽聚糖（peptidoglycan）,肽聚糖是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。,破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于

13、聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,细胞壁的成分,霉菌细胞壁较厚，100205nm，多数由几丁质和葡聚糖构成。酵母细胞壁主要成分是葡聚糖，还含有甘露糖、蛋白质和几丁质。幼时较薄，以后逐渐变硬。较革兰氏阳性菌的细胞壁更厚，更难破碎。藻类的细胞壁非常复杂，主要结构是纤维状的多糖物质。其强度取决于聚合物网状结构的交联程度。,细胞破碎方法,液体裁切：超声波、搅拌、压力机械法固体裁切：研磨、压力细胞破碎 干燥：空气、真空、冷冻、喷雾非机械法溶胞：物理法、化学法、酶法,高压匀浆器,操作原理,它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pu

14、mp）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,高压匀浆法,影响细胞破碎的主要因素：压力、循环次数、温度。操作压力：5070MPa，一般为55MPa一次破碎率：12%6

15、7%，达到90%要多次提高操作压力，有利于破碎，减少循环次数温度由5提高到30，酵母破碎率提高1.5倍适用于酵母和大多数细菌的破碎。不适用于高度分枝的微生物，因为会堵塞阀。,高压匀浆法,细胞种类、生长环境、生长速率和产物位置对操作条件的影响大肠杆菌较酵母易破碎生长在复杂培养基的大肠杆菌比生长在合成培养基中的大肠杆菌难破碎非结合酶处理一次即可（压力54.5MPa，菌体浓度10%20%），膜结合酶则需3次破碎。大肠杆菌的破碎效果随生长速率的减少而降低。,高压匀浆器的操作温度上升约/10MPa为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保

16、护产物活性。,高压匀浆法使用时注意事项,高速珠磨法,利用细胞与玻璃小珠在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂。,高速珠磨机工作原理,水平位置的磨室内放置玻离小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。在料液出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，易造成某些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。,高速珠磨法,影响因素有：搅拌速度、料液循环速度、细胞浓度、珠粒大小和数量、温度等。提高搅拌速度

17、、降低细胞浓度、增加小珠装量。过大搅拌速度和过多的小珠会增大能耗，产热增加磨珠越小、破碎速度越快，但磨珠太小易于漂浮。对真菌菌丝和藻类的细胞破碎效果较好。,超声波法（Ultrasonication),超声波破碎法利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。,超声波法（Ultrasonication),超声波在流体中传播时，出现细小的空穴，又迅速闭合，产生强烈的冲击波压

18、力，在悬浮细胞上造成剪切力，使细胞破碎。超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。,化学法,化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞组分。碱处理：溶解除细胞壁外的大部分组分。脂溶性有机溶剂：溶解细胞膜上脂类化合物。如丁醇、丙酮、氯仿等。表面活性剂（两性化合物）：细胞溶解或使某些组分从细胞中渗透出来。如SDS等。,化学法对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。但该法容易引起

19、活性物质失活破坏，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。另外，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。,化学法,酶解法,酶促反应破坏细胞壁上的特殊化学键，以达到破壁的目的。加入酶或自溶。优点：（1）产品释放的选择性高（2）抽提的速率和收率高（3）产品的破坏最少（4）反应条件温和（5）不残留细胞碎片,细胞外形较完整缺点：成本高，可用固定化酶反应使用。,酶解法,选择适宜的酶和酶系统，控制特定的反应条件，特定的生长阶段。微生物细胞，常用溶菌酶。专一分解细胞壁上的1,4糖苷

20、键。自溶：利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。可是，改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。可采用加热法或干燥法。采用抑制细胞壁合成的方法。(如生物素的营养缺陷型),物理法（渗透压冲击法）,先把细胞放在高渗溶解中，使水分外渗，再转入水或缓冲液中，使水分迅速渗入，细胞快速膨胀而破裂。蛋白质释放量仅为菌体蛋白总量的4%7%。是较温和的一种破碎方法，此法对革兰氏阳性菌不适用。,物理法（冻结融化法）,将细胞放在低温下冷冻（-15），在室温中融化，反复多次，使细胞壁

21、破裂。一方面，冷冻过程会促使细胞膜的疏水键结构破裂。另一方面，冷冻时胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。蛋白质释放率仅10%左右。,干燥法,菌体干燥后，细胞膜的渗透性发生变化，部分菌体自溶，再用丙酮、丁醇或缓冲液等抽提。空气干燥：2530热空气吹干。常用于酵母菌。真空干燥：常用于细菌。冷冻干燥：不稳定的活性物质。,细胞破碎率的评价,细胞破碎率：被破碎细胞占原始细胞数量的百分数。（N0N）Y（%）100%N0Y：破碎率N0:原始细胞数量N：经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。,直接计数法,直接对稀释后的样品计数。采用平板计数或血球计数板，通过显微镜观察染色细胞的数量。平板计数所需

22、时间长，只有活细胞才能计数。死亡的完整细胞虽量大但未能计数。显微镜计数：快速而简单，但难区分未损害细胞和稍有损害细胞。可用涂片法染色。革兰氏试剂染色后，完整细胞呈红色或无色，细胞碎片呈绿色。,间接计数法,细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（如可溶性蛋白、酶等）。将破碎后的细胞悬浮液离心分离，去掉固体（完整细胞和碎片），对清液进行含量或活性分析。最常用是蛋白质含量，或某种酶的活性等。,常用细胞破碎方法比较表,细胞破碎方法比较,机械法：大规模处理，产热大化学法：所用溶剂不得对活性物质产生损害酶法：条件温和，成本高渗透压冲击和冻融法：破碎作用较弱干燥法：较剧烈，易变性失活,选择破碎方法

23、原则,破碎细胞的目的、提取产物的类型、产物在细胞中的位置、细胞的数量和细胞壁的强度、产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性、要达到的破碎率、破碎的速度、规模应用、后期提取。细胞碎片的大小产物释放率、低的能耗、便于后步提取,问题,（1）常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。（2）简述破碎方法的选择依据。,第四节发酵液的固液分离,固液分离：指将发酵液（培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。过滤沉降离心,过滤,利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子。常规过滤 错流过滤,常规过滤,料液流动方向与过滤介质垂直。,常规过滤,阻力：过滤介

24、质和滤饼，后者为主要因素。提高速度过滤和过滤质量。预处理：絮凝、凝聚等使用助滤剂,助滤剂,（1）无毒，惰性物质（2）颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的固体颗粒。可使滤饼具格子结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，保持良好渗透性。既能使发酵液中的细小颗粒截留在格子骨架上，又能使清液有流畅的沟道。（3）来源方便，成本低廉。常用的有硅藻土、珍珠岩、纤维素、石棉等。,错流过滤,料流流动的方向与过滤介质平行，能清除过滤介质表面的滞留物，使滤饼不易形成，保持较高的滤速。过滤介质通常为微孔膜或超滤膜。优点：（1）收率高（97-98%）（2）滤液质量好（3）减少处理步骤（4）容易进行扩大生产,板框压滤机,板框压滤机

25、,优点：过滤面积大，能耐受较高压力差，适应性强（对不同性质的料液），结构简单，造价较低，动力消耗少缺点：不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长（解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等）、劳动强度大，生产能力低。自动板框压滤机：能自动清除滤饼，缩短非生产时间，减轻了劳动强度,真空鼓式过滤机,真空鼓式过滤机,优点：连续操作，可自动控制基本原理：真空吸滤分四个阶段：吸滤、洗涤、吸干、卸渣压力差较小，主要适用于菌丝较粗的真菌，对菌丝较细或黏稠的发酵液，需预铺助滤剂。,centrigugal separation,离心分离,在生物技术产业中，微生物发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或各种提取

26、液，常常是由固相(固形物)与液相组成的悬浮液，这种悬浮液的液-固分离是生化产品生产过程中的重要操作之一，其分离方法除了前面介绍的过滤分离外，还有一种非常有效的分离方法-离心分离。它是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提炼操作。,离心分离对那些固体颗粒很小或液体粘度很大，过滤速度很慢，甚至难以过滤的悬浮液十分有效，对那些忌用助滤剂或助滤剂使用无效的悬浮液的分离，也能得到满意的结果。但是离心分离结果得到的是浆状物而不是干的滤饼，而且存在离心设备复杂、价格昂贵的缺点。,离心分离不但可用于悬浮液中液体或固体的直接回收,而且可用于两种互不相溶液体的分离,如液-液萃取，

27、和不同密度固体或乳浊液的分离，如制备超离心技术等。,离心分离可分为以下三种形式：离心沉降，利用固液两相的相对密度差，在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液的分离操作；离心过滤，利用离心力并通过过滤介质，在有孔转鼓离心机中分离悬浮液的操作；离心分离和超离心，利用不同溶质颗粒在液体中各部分分布的差异，分离不同相对密度液体的操作。,1 离心沉降1.1 离心沉降的原理,最终沉降速率与粒子直径的平方成正比，与粒子和流体的密度差成正比，而与流体的粘度成反比；也就是说粒子的沉降速度仅仅是液体性质及粒子本身特性的函数。,固体的沉降 离心沉降的基础是固体的沉降。当固体粒子在连续流体中沉降时，受到两种力的作用，一种是

28、连续流体对它的浮力，另一种是流体对运动粒子的粘滞力。当这两种力达到平衡时，固体粒子将保持匀速运动。,1.2 离心沉降设备,沉降式离心机，包括实验室用瓶式离心机和工业用无孔转鼓离心机，其中无孔转鼓离心机又有管式、多室式、碟片式以及卧螺式(decanter)等几种型式，见下图。,瓶式离心机：这是一类结构最简单的实验室常用的低、中速离心机，转速一般在30006000rpm，其转子常为外摆式或角式，操作一般在室温下进行，也有配备冷却装置的冷冻离心机。,图 离心沉降设备类型,管式离心机：分为液-液分离的连续式管式离心机和液-固分离的间歇式管式离心机，它结构简单，仅是一根直管形的转筒,其直径较小，长度较大

29、，转速很高，可达到50000rpm，从而产生强大的离心力，除此之外它还可以冷却，这有利于蛋白质的分离。操作时，悬浮液或乳浊液从管底加入，被转筒的纵向肋板带动与转筒同速旋转，上清液在顶部排出，固体粒子沉降到筒壁上形成沉渣和粘稠的浆状物。运转一段时间后，当出口液体中固体含量达到规定的最高水平，澄清度不符合要求时，需停机清除沉渣后才能重新使用，因此操作是间歇式的。管式离心机转筒一般直径为40150mm，长径比为48，离心力强度可达1500065000，处理能力为0.10.4m3/h，适合的固体粒子粒径为0.01100m，固液密度差大于0.01g/cm3，体积浓度小于1%的难分离悬浮液，常用于微生物菌

30、体和蛋白质的分离等。,教材P51页,多室式离心机：多室式离心机的转鼓内有若干同心圆筒组成若干同心环状分离室(见图），这样可加长分离液体的流程，使液层减薄，以增加沉降的面积，减少沉降的距离，这同时还具有粒度筛分的作用，悬浮液中的粗颗粒沉降到靠近内部的分离室壁上，细颗粒,则沉降到靠近外部的室壁上,澄清的分离液经溢流口或由向心泵排出。多室离心机的出渣比较困难，一般在运转一段时间后，待分离液澄清度不符合要求时，停机清理。这种离心机有3-7个分离室,离心力强度为20008000，处理能力为2.510m3/h。适于处理直径大于0.1m的颗粒，固相浓度小于5的悬浮液，常用于抗菌素液-液萃取分离，果汁和酒类饮

31、料的澄清等。,图 多室式离心机的构造,碟片式离心机：这是一种应用最为广泛的离心机，它有一密封的转鼓，内装十至上百个锥顶角为60100o 锥形碟片，悬浮液由中心进料管进入转鼓，从碟片外缘进入碟片间隙向碟片内缘流动，由于碟片间隙很小，形成薄层分离固体颗粒的沉降距离极短，分离效果较好。颗粒沉降到碟片内表面上后向碟片外缘滑动，最后沉积到鼓壁上。已澄清的液体经溢流口或由向心泵排出。碟片式离心机的离心力强度可达300010000，由于碟片较多并且间隙小，从而增大了沉降面积，缩短了沉降距离，所以分离效果较好。碟片间距离一般为0.52.5mm，与被处理物料的性质有关。锥顶角的大小应大于固体颗粒与碟片表面的锥顶

32、角。根据卸渣方式，碟片离心机又可分为下面几种类型。a人工排渣的碟片离心机；b喷嘴排渣碟片式离心机；c.活门(活塞）排渣碟片式离心机；d.活门排渣的喷嘴碟片式离心机。,见教材P51页,图3 碟式分离机转鼓及物料流动示意图,图4 喷嘴排渣碟式离心机,图5 环阀(活塞)排渣碟式分离机示意因,SGZ型三足式刮刀卸料自动离心机,螺旋卸料沉降离心机：螺旋卸料沉降离心机有立式和卧式两种，后者又称卧螺机，是用得较多的形式，如图6,图6 卧式和立式螺旋卸料沉降离心机结构示意图：(a)卧式；(b)立式1进料管；2三角皮带轮；3右轴承；4螺旋输送器；5进料空；6机壳；7转鼓；8左轴承；9行星差速器；10过载保护装置

33、；11溢流孔；12排渣孔,卧式螺旋离心机,并流离心机,逆流离心机,卧式螺旋卸料沉降离心机,2 离心过滤,2.1 离心过滤的原理,离心过滤是将料液送入有孔的转鼓并利用离心力场进行过滤的过程，以离心力为推动力完成过滤作业，兼有离心和过滤的双重作用，其工作原理如图所示。从图可知，过滤面积和离心力随半径的增大而增大。,离心过滤工作原理图,利用离心力代替压力差作为过滤推动力。转鼓壁上有均匀密集的小孔，覆盖过滤介质（滤布）。,以间歇离心过滤为例，料液首先进人装有过滤介质(滤网或有孔套筒)的转鼓中，然后被加速到转鼓旋转速度，形成附着在鼓壁上的液环，与沉降式离心机一样，粒子受离心力而沉积，过滤介质则阻止粒子的

34、通过，形成滤饼。当悬浮液的固体粒子沉积时，滤饼表面生成了澄清液，该澄清液透过滤饼层和过滤介质向外排出，在过滤后期，由于施加在滤饼上的部分载荷的作用，相互接触的固体粒子经接触面传递粒子应力，滤饼开始压缩。所以离心过滤一般分滤饼形成、滤饼的压紧和滤饼压干三个阶段，但是根据物料性质的不同，有时可能只需进行一个或两个阶段。,2.2 离心过滤的设备,离心过滤机设有一个开孔转鼓，可以分离固体密度大于或小于液体密度的悬浮液。它可分连续式和间歇式。间歇式离心机通常在减速的情况下由刮刀卸料，或停机抽出转鼓套筒或滤布进行卸料。连续式离心机则用活塞推料和振动卸料两种方法：活塞推料离心机借助活塞的往复运动带动推料盘而

35、进行脉动卸料，另有多级活塞推料离心机，它是活塞推料离心机的改进型式，其网孔转鼓为多级阶梯结构，振动卸料离心机为立式结构，其网孔转鼓为锥形，物料由小端进入，转鼓的轴向振动和固体粒子的重力产生指向大端方向的总推动力，该推动力克服了轮子与转鼓间的摩擦力，使粒子从转鼓小端穆向大端，达到卸料的目的。,还有一种连续沉降过滤式螺旋卸料离心机，它集连续沉降离心机和连续过滤式离心机于一体，在连续沉降式离心机的锥部小端至卸渣口设置一个柱形网孔转鼓段，液体借助于粒子的沉降而澄清，粒子则借助于压缩和锥部排沉而脱水，但最终脱水和洗涤在网鼓段进行。,卧式螺旋卸料过滤离心机,LWL型离心机内部结构及工作原理图,卧式螺旋沉降

36、离心机(卧式螺旋卸料沉降离心过滤),3 超离心法,根据物质的沉降系数、质量和形状不同，应用强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法称为超离心法。它在生物化学、分子生物学以及细胞生物学的发展中起着非常重要的作用。应用超离心技术中的差速离心、等密度梯度离心等方法，已经成功的分离制取各种亚细胞物质、如线粒体、微粒体、溶酶体、肿瘤病毒等。用5105g以上的强大离心力，长时间的离心(如17h以上)，可获得具有生物活性的脱氧核糖核酸(DNA)、各种与蛋白质合成有关的酶系、各种信使核糖核酸(mRNA)和转移核糖核酸(tRNA)等，这为遗传工程、酶工程的发展提供了必需基础。超离心法是现代生物技术领

37、域研究中不可缺少的实验室分析和制备手段。,超离心,根据物质的沉降系数、质量和形状的不同，应用强大的离心力，将混合物中的各组分分离、浓缩、提纯的方法。各种细胞器的分离提取，如线粒体、溶酶体等，各种蛋白质、核酸的提取等。沉降速度的不同，而将各组分分离。制备性超离心 分析性超离心,3.2 超离心技术的分类,制备性超离心,制备性超离心的主要目的是最大限度地从样品中分离高纯度目标组分，进行深入的生物化学研究。它可以分离量非常大的物质，例如从成批的或连续的培养液中收集微生物细胞，从组织培养液中得到动植物细胞以及从血液中分离血浆；也可以从已通过某些预纯化的制剂中分离像蛋白质那样的大分子。制备性超离心分离和纯

38、化生物样品一船用四种方法：差速离心法、一般密度梯度离心法、等密度梯度离心法及平衡等密度梯度离心法。,差速离心法,粒子差速离心(Differential Pelleting)粒子差速离心法，简称差速离心法逐渐增加离心速度或交替使用低速和高速进行离心，用不同的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。如取均匀悬浮液，控制离心力及时间进行离心，使最大的粒子先沉降，而上清液中不再含有这种粒子，取出上清液，增加离心力再分离较小的粒子，如此逐级分离。,该法的缺点是每次沉降的沉淀粒子不是均一的，在等离心力下除了大粒子都沉淀以外，部分中粒子及少部分小粒子也可能沉淀下来，且数目随着离心时间的延长而增加，故不容易

39、得到粒度均匀的粒子需要将沉淀重新悬浮、洗涤、再次离心，反复数次，才有较好的效果。差速离心一般用于分离沉降系数相差较大的粒子，如常用于细胞匀浆中细胞器的分离,一般密度梯度离心法,一般密度梯度离心法(Density gradient centrifugation 或称Rate-Zonal centrifugation)也称分级区带离心,它是把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续分离区带。该法仅用于分离有一定沉降系数差的粒子，与粒子密度无关。因此大小相同，密度不同的粒子(如线粒体

40、、溶酶体和过氧化物酶体)不能用此法分离。这种方法已用于RNADNA混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离。,等密度离心法(Isopycnic Centrifugation)当不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上(即等密度点)并形成区带，此即等密度离心法。位于等密度点上的粒子没有运动，区带的形状和位置都不受离心时间的影内，体系处于动态平衡。等密度离心的有效分离仅取决于粒子的密度差。密度差越大，分离效果越好，与粒子的大小和形状无关，但是此二者决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。根据梯度产生的方式，可分为预形成梯度（Prefo

41、rmed gradient）和自形成梯度（Self-formed gradient）的等密度离心，后者又称平衡等密度梯度离心。,等密度离心法,预形成梯度等密度离心：本法需要事先制备密度梯度，常用的梯度介质主要是非离子型的化合物(如蔗糖、甘油等)。离心时把样品铺放在梯度介质的液面上，这个密度包括了所需要研究的密度范围，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才发生沉降，并排列成不同的区带。用这一技术可以定量的从线粒体和过氧化物酶体中分离溶酶体。等密度分离也可不用密度梯度来进行，这时样品需先在一个足够使较重粒子沉降的速度下离心，分离除去这些较重的粒子后，再把含有所需粒子的样品悬浮在一个与被分离组

42、分具有相等密度的介质中，重新离心直至所需的物质沉降为止，密度低于所需物质的粒子漂浮在弯月面上。,自形成梯度的等密度离心(平衡等密度离心)：平衡等密度离心常用的梯度介质有粒子型盐类如铯盐或铷盐和三碘化苯衍生物等。离心时是把密度均一的介质溶液和样品混合后装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中进行再分配。离心达到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度点的特定位置上，形成不同的区带。粒子达到等密度点的时间与转速有关，提高转速可缩短平衡时间，延长时间可弥补转速不高的问题，一般离心所需的时间应以最小粒子达到平衡的时间为准。这一方法已用于分离和分析人血浆脂蛋白。,等密度离心法,使用一种能

43、形成密度梯度的溶剂系统，离心后各物质颗粒能按其各自的相对密度平衡在相应的溶剂密度中形成区带。在离心作用，溶剂系统能形成底部浓而顶部稀的密度梯度。常用CsCl或蔗糖溶液。一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。,分析性超离心,研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是收集某一特定组分。由离心系统、真空系统和光学系统组成。可通过光学系统（紫外吸收、折射率等方法）监视离心时正在沉降的物质。应用：（1）测定生物大分子的相对分子质量（2）生物大分子的纯度估计（3）分析生物大分子的构象变化,离心方法的选择,含有粒度大于0.01mm颗粒的悬浮液，可用过滤离心机。悬浮液中颗粒细小或可压缩变形的，宜用沉降离心机

44、悬浮液固体量低，颗粒微小和对液体澄清度要求高时，宜用离心分离机。,4 离心机在生物工业中的应用,在生物工业中离心机通常用来处理液相粘度在12mPa.s，固液密度差为0.1g/ml和粒子大小为0.5100m的悬浮液，其中的固形物，例如细胞碎片、絮凝废水的细菌和蛋白质沉淀，大多是形状不规则、性软、易碎的物质。被加工的物质，例如酶可能是热和氧敏感的。当待处理的是基因操纵，致癌的或其他毒性物质时，则在离心机设计时必需考虑灭菌和防止气溶胶。而当蛋白质纯化需采用色层分离纯化步骤时，则常常要求离心操作能提供澄清的上清液。碟片式离心机在应用中是受欢迎的设备，它们备有密封和蒸汽灭菌等多种型式，配有温度控制，并且

45、有些型号能在物料流量达2000L/h下，回收尺寸为0.5m 的粒子。,来自发酵罐的菌体经过离心法除去培养液后再加入缓冲液，通入高压匀浆机中反复破碎3次，匀浆液经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促溶剂以除去脂蛋白和末破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，变性剂为6mol/L盐酸胍。变性的同时通入空气氧化以打断错误连接的二硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后通过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀也用离心除去。整个流程中多次采用离心法将包含体与细胞碎片及可溶性蛋白质分开，使后继的分离纯化简单化。,牛生长激素的分离提取工艺,牛生长激素的分离提取工艺,离心机的类型,