与染色体的结构.ppt

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1、第二章 DNA与染色体的结构,从高等动植物到简单的病毒都含有核酸，核酸（Nucleic acid）是生物体的基本组成物质，是遗传信息的携带者，它在生物的个体生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命过程中起着极为重要的作用。1953年，由Watson和Crick提出的DNA双螺旋模型为人类进一步深入了解生命现象，从分子水平揭开遗传的奥秘开辟,了一个崭新的视野，为现代的分子生物学、分子遗传学和生物工程奠定了基础。70年代以后，由于核酸限制性内切酶的发现和DNA体外重组技术的兴起，核酸序列分析方法的突破以及核酸人工合成的成功，极大地推动了核酸的研究工作。人们可以按照自己的意愿创造出自然界不曾有的动植物新品

2、种。随着基因工程技术在工业、农业、医学和药学等领域的广泛应用，它将会为人类创造出更大的财富。本章主要介绍DNA和染色体的结构。,第一节 DNA结构的多态性与动态性,像研究蛋白质的结构一样，核酸的结构有一级、二级、三级结构之分。核酸的一级结构是指多核苷酸链中核苷酸的排列顺序。二级结构是指在核酸中由部分或所有核苷酸残基所形成的任何有规律的稳定的空间结构。三级结构则是指具有二级结构的核酸所形成的更复杂的折叠状态。,一、DNA一级结构 四种脱氧单核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）是DNA的基本组成单位，它们按照一定的方式、数量和排列顺序而形成的多核苷酸链即为DNA的一级结构。具体来说就是

3、一个脱氧核苷酸的C3羟基与另一脱氧核苷酸的C5磷酸基以3,5-磷酸二酯键相连，形成戊糖-磷酸骨架，碱基在内侧。这样，核酸大分子或多核苷酸链有两个末端，一末端有一个5位的,磷酸基叫5端，另一末端则为未结合的3-OH基叫3端（图2-1A）。在书写时习惯上把5端放在左边，3端放在右边，即按53方向书写。多用缩写式如 5pACGT3或pACGT、dACGT或5dACGT3、ACGT或5pACGT3表示脱氧多核苷酸的结构。多核苷酸链的几种表示方法，如右所示（图2-1B、C）。,在真核生物DNA一级结构中，常见到一些重复序列（repetitive sequence）。按其复性快慢分为三类。（1）高度重复序

4、列。重复频率高，次数从几十万到几百万次。重复序列较短5300bp，多数为515bp。其中有些是反向重复序列，也称回文结构（palindrome），即该片段的碱基顺序在互补链之间正读反读都相同。,还有一些反向重复序列，中间被一些不相关的序列隔开。反向重复序列都能形成十字架（交叉）和发卡结构（图2-2）。在高度重复序列中，还有一种简单的重复单位组成的重复序列。这类重复序列的重复单位一般由210bp组成，成串排列。这种重复序列的碱基组成与其他部分不同，富含AT，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因此把它叫做卫星DNA（satellite DNA）。又根据重复频率和,重复序列长度不同，可分为小

5、卫星DNA（minisatelletite DNA）和微卫星DNA（microsatelletite DNA）。相近种属的高度重复序列存在相似性，不同种属具有种属特异性。高度重复序列可能参与DNA复制及基因表达的调控，小卫星DNA和微卫星DNA常作为一种分子遗传标记。,（2）中度重复序列。重复频率和重复序列长度有很大差异，平均长度 6105bp，平均重复350次。有些成串地排列在DNA一级结构的一个大的区域，有些则与单拷贝序列间隔排列；有些是编码蛋白质的结构基因，有些序列不编码蛋白质。中度重复序列一般有种的特异性，可以作为探针，区分不同种间细胞DNA。,（3）低度重复序列。又称单拷贝序列，即序

6、列不重复或只重复几次、十几次。重复序列长度大于1000bp。此类序列携带大量能编码各种功能不同蛋白质的遗传信息，也有一些是基因间隔序列。DNA的一级结构实际上就是DNA分子内碱基的排列顺序。这些高度有序的碱基序列蕴藏了丰富的遗传信息。任何一种DNA序列都可以反映出它的高度个体性或种族特异性。一级结构决定了DNA的高级结构。,这些高级结构又决定和影响着一级结构的信息功能，即基因启动和关闭。因此，研究DNA的一级结构对阐明遗传物质结构、功能以及它的表达、调控都是非常重要的。,二、DNA的二级结构1953年Watson和Crick在Chargaff规则和DNA X-射线衍射结果的基础上提出了著名的D

7、NA双螺旋（double helix）结构模型，即B-DNA模型（图2-3）。模型的结构特征如下：（1）两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕成右手双螺旋。（2）糖与磷酸在外侧形成螺旋的轨迹，彼此通过3,5-磷酸二酯键相连。,（3）碱基伸向内部，其平面与螺旋轴垂直。（4）两条核酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键相连系而结合在一起，且总是A与T，G与C配对。（5）双螺旋的平均直径为2 nm，每个螺旋圈上升10对核苷酸，螺距为3.4 nm。（6）沿螺旋中心轴方向看去，双螺旋结构上有两个凹槽，一个较宽深，称大沟（major groove），另一个较浅小，称,小沟（minor groove）。DNA双

8、螺旋结构一般情况下比较稳定，维持其稳定的作用力主要有：两条多核苷酸链间的互补碱基对之间的氢键作用。螺旋中碱基对疏水的芳香环堆积所产生的疏水作用力和上下相邻的芳香环的电子的相互作用即碱基堆积力。这是一种最主要的作用力。磷酸基团的氧原子带负电荷，与细胞中的碱性组蛋白、亚精胺,以及Mg2+等阳离子化合物结合所形成的离子键，从而抵消负电荷之间的排斥作用。DNA是遗传信息的载体，它的核苷酸序列不仅编码各种蛋白质，而且也与基因表达的调控有关，这主要是通过其与一些蛋白质因子间的相互识别和结合来实现的。目前认为发生这一过程的部位主要是大沟，它较之小沟能够携带更多的形成氢键的信息（图2-4）。图中的圆圈代表螺旋

9、的截面，大于180的一侧表示大沟，,另一侧为小沟。在大沟中裸露的是碱基对顶部的基团，这些基团在不同的碱基对中排列的次序不同，也就制约了与之结合的蛋白质因子结构。这些基团在4种碱基对的顺序为：大沟：A-T 环氮，氨基，酮基 小沟：A-T 环氮，酮基 T-A 酮基，氨基，环氮 T-A 酮基，环氮 G-C 环氮，酮基，氨基 G-C 环氮，氨基，酮基 C-G 氨基，酮基，环氮 C-G 酮基，氨基，环氮可以看出，大沟中显示的信息明显多于小沟，则蛋白质因子沿大沟所形成氢键的专一性更强。而小沟则相对信息少，,专一性较弱。当然，这并不意味着小沟对 DNA的功能并不重要。三、DNA二级结构的多态性除B-DNA外

10、，人们还发现到了其它的、结构参数有一定差异的双螺旋DNA，如A-DNA,Z-DNA等。这一现象称为DNA结构的多态性（polymorphism）。产生的原因在于多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单链，从而使糖环可采取不同的构象。,（一）A-DNA当DNA钠盐纤维在相对湿度为92%时，所处的状态为B-DNA。当DNA钠盐纤维相对湿度为75%时所处的状态就叫A-DNA。A-DNA所形成的右手螺旋比B-DNA较大且较平，每旋转一圈的螺距为2.8nm，每圈包含11个碱基对，直径为2.55nm，每对碱基转角为33，碱基平面与轴夹角为20，这样使A-DNA的大沟窄而极深，而小沟浅（图2-5）。造成这些差异的

11、原因是A-DNA中,脱氧核糖残基折叠方式为C3内折，而B-DNA中则为 C2内折（图2-6）。A-DNA双螺旋不仅限于在A-DNA分子中存在，RNA的双股发夹结构及RNA-DNA杂交产物也有类似于A-DNA的双螺旋。从不少实验结果可以推断生物体内某些DNA分子中可能存在A-DNA双螺旋片段。,图图2-6 脱氧核糖的一些构象图2-6 脱子氧核糖的一些构象,（二）Z-DNA1979年,Rich等通过对人工合成的脱氧六核苷酸dCGCGCG的X射线晶体衍射分析，发现两分子的上述片段以左手双螺旋结构的形式存在于晶体中，其中碳与磷原子相连成锯齿形（Zig-Zag），因此被命名为Z-DNA。其主要特征为：（

12、1）以二聚体dGC或dCG为一个单位，并由6个这样的单位构成一个左手螺旋构象，即每个螺旋包含12对碱基，螺距为4.5 nm，螺旋直径为1.8nm，整个分子显得细,而长。在Z-DNA中，嘧啶的糖苷键为反式构象，而嘌呤的糖苷键则为顺式构象。（2）GC碱基对不是对称地位于螺旋轴附近，而是移向边缘伸展。从而使大沟外凸，小沟则变得窄而深（图2-7）。,图2-7 Z-DNA,（三）三链DNA在正常的DNA双螺旋结构基础上还可形成三股螺旋。依据三螺旋的形成机理和生物学意义，可分为三类：（1）分子间的三螺旋DNA。在一定条件下，合成的脱氧核苷酸插入DNA双螺旋特定区域的大沟内，通过氢键形成局部的分子间三螺旋结

13、构（图2-8）。（2）分子内的三螺旋DNA。DNA 双螺旋特定区，通过氢键作用，发生自身折叠，,形成局部的分子内三股螺旋结构，同时解离出一段DNA单链。（3）平行的三螺旋结构。是指三螺旋结构中的第三条链的序列与第一条链的序列相同，方向也相同，这种结构的DNA又叫R-DNA（图2-11），是因其与基因的重组（recombination）有关而得名。上述形成三螺旋的三条链一般均由Hpu或Hpy组成。碱基配对方式是第三个碱基以A=T，G=C+配对，C必须质子化(C+)，并且与G配对，只形成两对氢键。,三螺旋中常见的碱基配对方式见图2-12。（四）四链DNA 染色体的端粒DNA上常有T4和G4重复序列

14、。体外研究表明含有端粒重复序列的单链寡核苷酸可以形成四联体螺旋结构。由于该结构由鸟嘌呤之间的氢键所维系，故又称为G四联体螺旋（G-quadruplex），其结构的基本单元是G四联体（G-quartet），它由四个鸟嘌呤在一正方形平面内以氢键环形连接而成，,因此，每一个G既为氢键的受体同时也为配体（图2-13）。在四联体的中心是由4个带负电的羰基氧原子围成的“口袋”，被认为是与阳离子相互作用的位点。通过G四联体的堆积，这类寡核苷酸可形成分子内四联体螺旋、双分子间四联体螺旋、四分子间四联体螺旋结构甚至更高级的结构（图2-14）。四链DNA的生物学功能可能在于参与端粒DNA的复制。,四、DNA结构的

15、动态性由上述讨论可知，DNA分子存在有B、A、Z型、三链、四链DNA等二级结构形式。随着对DNA结构研究的不断深入，人们逐步认识到在天然DNA分子中，以B型结构为主，但同时可能存在有其他类型的结构形式，即DNA分子的基本结构是B型，但在这个分子的某些区段会出现A、Z，甚至三链、四链，并且这些不同的结构处于动态变化中，也就是说，条件不同，,各不同结构之间还会相互转变造成相应的功能发生变化。这种不同 DNA结构形式相互转变的现象称为DNA结构的动态性.。实验证明，水合的B-DNA在脱水时，或由于加入乙醇或盐而使水的活度降低 时即转变为A型。这是由于B-DNA中，2-脱氧核糖的构象发生了变化，使得同

16、股核苷酸链中相邻磷酸基间的距离缩短了0.1nm，也使得每匝螺旋的碱基对数由,10转变为A-DNA的11。A-DNA中碱基对也由B-DNA的集中于中心轴变化为向大沟方向移动了约0.5nm，也就使A-DNA具有粗短，大沟更细更深的外形。另外还发现，转录过程中，在DNA单股上合成RNA时，DNA与RNA所形成的杂交双螺旋，可能是A型。在B-DNA向Z-DNA转变中，碱基平面相对于螺旋轴转动了180（图2-15）。这一翻转对交替d（GC）序列中的两种残基的构象产生了不同影响，胞嘧啶核苷残基整个,转动了180，仍保持反式构象，而鸟嘌呤核苷残基中的碱基则绕苷键转动了180，结果导致多脱氧核苷酸主链的走向呈

17、“Z”形（图2-16）。研究表明，在大多数细胞的阳离子条件下，交替的CG区段很可能处于B型，而在胞嘧啶被甲基化后，就转向Z型。这样甲基化所处环境就由B-DNA中的亲水区转而进入Z型的疏水区，也就增加了稳定性，进而有利于DNA生物功能的发挥。DNA在发挥其生物功能过程,中，会呈现与其功能相适应的各种特异性结构，如三链，四链DNA等。但需要指出的是，无论DNA结构形式如何多样，B-DNA仍然是DNA的最基本构象。五、DNA结构的呼吸作用双链DNA中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态之中，特别是稳定性较低的富含A-T的区段，氢键的断裂和再生更为明显。在微观上，它们常常发生瞬间的单链泡状结构，这种现

18、象称为双螺旋的,呼吸作用。这对于一些识别双链DNA开链成单链的蛋白质结合到DNA上具有重要作用，这些蛋白质需要处于呼吸状态的双链DNA来阅读和识别DNA内部所含信息（如碱基序列、碱基上可以作用的氢供体、氢受体的数目和方位等）。,第二节 DNA的精细结构,70年代末，人们对化学合成的具有确定序列的DNA片段晶体进行射线衍射发现，DNA双螺旋实际上不是完全均匀的，它的许多结构参数在一定范围内是随碱基序列的不同而有所变化，这称为DNA的局部构象。如具GCGAATTCGCG的DNA片段的射线衍射分析指出，它的螺旋扭转角,(helix twist angle)是在28-42（图2-17）之间变动而不是3

19、6。同样，其它的参数如螺旋桨扭角（propeller twist angle），碱基转动角（roll angle of base pair）等也都会因碱基序列的不同而发生不同程度的变动，碱基对之间也发生不同的滑动，使得碱基堆积情况发生变化（图2-18）。这种碱基序列的不同引起的碱基堆积的变化，是由于碱基对中，嘌呤的双环结构大于嘧啶的单环结构，,在碱基配对中，嘌呤碱会超越中点占据嘧啶碱的一部分空间，这既增加了碱基的堆积程度，又使碱基功能团间发生挤压，而序列不同挤压的情况不同。对嘌呤-（3-5）-嘧啶序列，来自鸟嘌呤6、腺嘌呤N6间的挤压出现在大沟中；对于嘧啶-（3-5）-嘌呤序列，来自鸟嘌呤N3

20、，N2 腺嘌呤N3间的挤压在小沟中发生（图2-19）。可见小沟中的挤压更为严重。,为减少不利的挤压，使碱基堆积更加有利，双螺旋结构就要做出局部调整，如改变各个结构参数等，甚至形成交叉氢键，这些变化就形成了DNA的精细结构（fine structure）。而这些精细结构正是相应蛋白质因子与靶位点进行专一性识别和结合从而发挥DNA功能的标志。另据观察，DNA与一些蛋白质因子的结合部位是一些弯曲结构，这些弯曲（blend）是由连续的A残基产生的，每,组连续的A的数目一般为36个，并且要求连续的A之间需被其它核苷酸隔开。含G-T、A-C、G-A碱基对的寡聚核苷酸的晶体分析说明，这些错配的碱基对都能包容

21、在B-DNA中，它们的构象参数一般处于允许范围内，如G-A的一种配对方式仅宽1.07nm，与G-C对的尺寸十分接近，也不引起螺旋方向改变，因此，这一错配 对DNA的结构并不产生明显的影响，但腺嘌呤官能团所处位置与螺旋的其余部分,明显不同，这一特点就为修复酶提供了识别标志。对错配的碱基包容于双螺旋，以及它们所产生的构象变化与其所处序列环境（sequence environment）间的关系的深入研究，将有利于对复制过程的校对以及复制后的修复和重组酶系的进一步认识。另外，Z-DNA的形成与特定的d（GC）序列有关，这也说明DNA的局部构象对特定序列的依赖性。,DNA的局部构象与其功能有着密切的联系

22、。DNA所携带的遗传信息，一类是编码蛋白质，它们通过核苷酸三联体与各个氨基酸间的对应关系使遗传信息由DNA流向蛋白质，但遗传信息的这种流动不是靠基因自身的功能，而是通过独立于该基因之外的蛋白质合成机构实现的。同时，蛋白质基因的表达不总是构成型的，它是受调控的。DNA所携带的第二类信息即是与基因表达调控有关的信息，它们就,贮存在DNA的精细结构中，直接表现为特定的空间结构，即密码结构域（code domain）,它能被相应的蛋白质因子识别并结合，从而控制蛋白质基因的表达。凡能结合于DNA的蛋白质叫作DNA-结合蛋白（DNA-binding protein）。它包括各种酶（如DNA聚合酶、RNA聚

23、合酶等）和调节蛋白（如CAP等）。这些蛋白质与DNA的结合涉及到遗传个体发育等生物学中的一些基本问题。因此核酸蛋白质的,交互作用（nucleic acid-protein interaction）已成为分子生物学的研究热点。DNA和蛋白质的结合实质上是一个双向过程，DNA的局部构象既提供了识别标志和发生交互作用的结构条件，而蛋白质的结合又促使该处DNA的构象发生进一步的变化或使交互作用深化。,第三节 DNA的超螺旋结构和拓扑异构酶,一、DNA的超螺旋结构 DNA的三级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的构象，包括线形双链中的纽结（kinked）、超螺旋（supercoiled,super

24、helix）、多重螺旋、分子内局部单链环和环状DNA中的超螺旋及连环等拓扑学性质。超螺旋结构是DNA三级结构中最常见的一种结构。,环状DNA分子，线形双螺旋分子两端连接起来或因与蛋白质结合而固定时，进一步扭曲都可形成超螺旋。双螺旋DNA处于拧紧状态时所形成的超螺旋称作正超螺旋（左手超螺旋）（positive supercoil）(图2-20)，处于拧松状态则形成负超螺旋（右手超螺旋）（negative supercoil）。天然DNA分子都处于负超螺旋。DNA形成超螺旋结构便进入另一种热力学上的稳定状态，但不会改变环形双,螺旋DNA分子中一股多核苷酸链与另一股多核苷酸链的交叉次数，DNA分子的

25、这种变化可用一数学式来描述：L=T+W L称为连接数（linking number）是指环形DNA分子的两条链彼此盘绕的次数，它是环型双螺旋DNA分子的拓扑性质，只要不发生链的断裂，它就是一个定值。右手螺旋时规定为正值。T称为盘绕数（twisting number），它代表DNA的一,股链绕双螺旋轴所做的完整旋转数，数量上等于碱基对总数除以每一圈的碱基对数，即等于双螺旋的总转数。W为超盘绕数（writhing number），代表双螺旋轴在空间的转动数。T和W是变量。因为在一个完整的环状双螺旋分子中L为常数，所以当其形成超螺旋时，T和W数值相等，方向相反。例如：SV40DNA含5226核苷酸对

26、，T=5226/10.5=497，实际测得W=26，则 L=T+W=497+(-26)=471。当LT即拧松状态，DNA形成负超螺旋。,DNA分子形成超螺旋的生物学意义在于，一是超螺旋DNA具有更紧密的形状，因此在DNA 组装中具有重要作用。二是DNA的结构具有动态性，这有利于其功能的发挥，而DNA超螺旋程度的改变介导了这种结构的变化。B-DNA是一种热力学上的稳定结构，超螺旋的引入就提高了它的能量水平。负超螺旋的存在会影响DNA结构变化的平衡，具超螺旋的DNA能实现松弛态DNA所不能实现的结构转化。,二、拓扑异构酶 细胞内存在一类能催化DNA拓扑异构体（topoisomer）相互转化的酶，它

27、们称为拓扑异构酶（topoisomerase）。它们能与DNA形成共价结合的蛋白质-DNA中间体，从而在其骨架的磷酸二酯键处造成暂时性的裂口，使DNA的多核苷酸链得以穿越，结果改变了分子的拓扑状态。在这一过程中，DNA的连接数虽然改变了，但其核苷酸序列并无任何变化。,拓扑异构酶共有两类:型和型拓扑异构酶。（一）型拓扑异构酶作用特点：仅切断双链DNA的一条链，即催化瞬时的单链断裂和连接，不需要能量辅助因子如ATP和NAD等，因而不能催化需能的超螺旋化结构。目前研究较为清楚的是大肠杆菌拓扑异构酶（过去叫做蛋白）。其作用机理是，当酶与DNA结合时，可形成稳定的,复合物，这个复合物是切断DNA链的5-

28、磷酸基与酶的酪氨酸羟基以酯键连接而成的，同时酶的另一端共价连接在3-OH基上。在此发生的是磷酸二酯键的转移反应，由DNA转移到蛋白质。当DNA的一股链穿越切割点绕另一股旋转一圈后，原来断裂的DNA重新连接，酶被释放。即磷酸二酯键又由蛋白质转移到DNA（图2-21）。整个过程并不发生键的不可逆水解，没有能量的丢失。因此不需要外界供给能量，结果由于L由n变为n+1,而增加了正超螺旋或减少了负超螺旋。,图2-21 拓扑异构酶的作用机制,（二）型拓扑异构酶型酶作用的共同特点是：同时切断、缝合DNA的两条链，不需要单链切口存在，因而每个反应后改变两个链环数；需要能量辅助因子。大肠杆菌的拓扑异构酶又叫旋转

29、酶（gyrase），作用的可能机制如图2-22所示。当反应开始时，DNA围绕着酶卷起，然后将两条链切断，2个A亚基分别与5-磷酸基结合，在酶构象改变的牵引下，,另一双链穿越酶蛋白提供的裂隙（切口），最后断裂的2条链又重新连接。ATP水解产生的能量用来恢复酶的构象，从而可进行下一次循环。拓扑异构酶功能是将复制叉前的正超螺旋转为负超螺旋，从而释放由复制叉移动造成的张力。其每将一个正超螺旋转为负超螺旋，就将DNA的连接数L的符号从+1变为-1，则L的变化为 L=-2。在细胞中，拓扑异构酶和拓扑异构酶的量是相互抗衡，并受到精细地,调节的，这能保证DNA的负超螺旋程度达到一个最佳状态。,图2-22 E.

30、coli DNA 旋转酶导入负超螺旋的作用机理,第四节 DNA的变性、复性与分子杂交,一、DNA的变性在物理和化学因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双链解旋成单链，这一过程称为核酸的变性（denaturation）。核酸的变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局部的双螺旋节段上（局部变性），但无论哪一种情况，均不涉及核苷酸中二酯键,的断裂。引起变性的因素有酸、碱、尿素、胍等变性剂和乙醇、丙酮等化学因素以及热、紫外线等物理因素。变性后的DNA，由双链变为单链，原来隐藏在双螺旋内部的发色基团暴露出来，其一系列的物理、化学性质都发生变化。其中最明显、最有用的变化是在2

31、60nm处紫外吸收值增高，此现象称为增色效应（hyperchromic effect）（图2-23），另外还有粘度下降、沉降速度增加、,浮力密度上升等现象。所以实验室常利用这些性质来追踪变性过程。由加热引起的变性叫热变性。当将DNA稀盐溶液加热到80左右，双螺旋结构受到破坏，氢键断裂，两条链彼此分开形成无规则线团，这种由双螺旋转变成线团的过程称螺旋-线团转移（helix-coil translation）（图2-24）。加热变性一般在较窄的温度范围内发生，象结晶物质的熔点只在很狭窄的范围内,发生一样，如果以温度对紫外吸收作图，可得一S形曲线，称为熔解曲线（melting cure）（图2-25

32、）。熔解曲线的中点，即一半的DNA双螺旋解为单链所对应的温度称为熔解温度或解链温度（melting temperature,transition temperature，Tm）。每一种DNA都有一个解链温度，通常Tm值在85-95之间。事实上Tm值并不是一个固定常数，它受以下因素的影响：,（1）DNA碱基组成。DNA的Tm 值主要与组成DNA分子中的碱基对组分有关，G-C含量越高，Tm值就越高;A-T含量越多，Tm值就越低（图2-26）。这是因为G-C对中三个氢键较A-T对中两个氢键牢固的原因。在标准条件下即0.15mol/LNaCl-0.0015mol/L柠檬酸钠溶液中,Tm值与碱基对组成之

33、间的经验公式是：Tm=69.3+0.41(G+C),（2）DNA的均一性。DNA分子序列组成越均一，如多聚A-T或多聚G-C，其变性过程同步性越好,Tm范围较窄，表现为一条很陡的熔解曲线；反之，非均一性 DNA分子，则Tm范围较宽。（3）溶液的离子强度。DNA双链骨架上磷酸基因带有较多的负电荷，它们之间的静电排斥作用是造成双链不稳定的因素之一。同一种 DNA分子在不同离子强度溶液中其Tm值不同（2-27）。在低离子强度中，Tm值较低，而且解链的温度,范围较宽;在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。这是由于溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，即正离子可以封闭磷酸基团的负电性使

34、DNA比较稳定，需更多能量才能使其变性，故Tm值亦升高。（4）pH值。核酸溶液的pH在59范围内，Tm值变化不明显。当溶液pH小于4时，碱基A、G、C上的氮原子质子化；当pH值大于11时，碱基G和C上的氮原子去质子化，,这些均不利于氢键的形成。二、DNA的复性变性的DNA重新恢复为双螺旋的过程，叫做复性（renaturation）或退火。DNA复性时，其紫外线吸收值降低，这种现象称为减色效应（hypochromic effect）。复性过程并不是变性反应的简单逆过程，变性过程可以在一个很短时间内完成，而复性则需要相对较长时间才能完成。复性可分为两个阶段，首先是成核,（nucleation），其

35、次是拉链（zippering）。复性开始时，两条DNA单链随机碰撞形成局部双链，若在此时局部双链周围的碱基不能配对则会重新解离，继续随机碰撞，一旦找到了正确的互补区形成一定长度的碱基对即成核。在此基础上两条单链的其余部分就像“拉链”那样完成整个复性过程。一个稳定的成核区有10-20个碱基对。在一定条件下，复性速度的变化可用,Cot值来衡量。Co表示变性DNA的最初浓度(bp，mol/L)，t为复性时间（秒），即变性DNA的最初浓度与复性时间的乘积（mols/L）。DNA所含信息量越少复性越容易，Cot值越小。反之，亦然。即Cot值与复性速度成反比。例如，大肠杆菌的分子大小是T4DNA的30倍，

36、实验结果表明，大肠杆菌DNA的Cot 是9mols/L，而T4的Cot 是0.3mols/L，说明大肠杆菌DNA分子结构和信息含量要比T4DNA复杂得多；,也说明在相同条件下，大肠杆菌DNA 互补单链数量比T4DNA单链数量少得多，分子碰撞机会也少，故复性的速度也慢得多。影响复性速度的因素有下列几种：（1）DNA的大小。DNA片段小的比大的容易复性。（2）离子强度。DNA溶液的离子强度对复性影响较大，这是因为盐可以减少两条互补链负电荷的排斥作用。通常增加盐浓度，可加速两条补链重新结合的速度。,（3）DNA浓度。DNA浓度越大，两条互补链彼此相遇的可能性越大，复性速度也越快。DNA复性反应的初始

37、浓度Co与反应完成一半所需时间的乘积用Cot1/2表示，它是个常数，亦称DNA分子的复杂度（complexity,C）。图2-28表示各种不同的DNA的复性动力学曲线。从图中可以看出，一种DNA分子的分子量越大，其完成复性所需的时间越长，则Cot1/2越大。,三、酸的分子杂交相同或不同来源的二个DNA分子，或DNA和RNA分子混合在一起，如果含有彼此互补的序列，通过变性和复性处理，DNA-DNA同源序列间及DNA-RNA异源序列间都可形成杂交体，称核酸的分子杂交（Nucleic acid hybridization）。核酸分子杂交是目前分子生物学最广泛应用的技术之一。利用此技术，可以求出特定基

38、因的频率、基因组织的,特点、基因结构和定位、基因表达等。根据核酸分子杂交的原理，有目的地人工制备或从基因组中分离一段已知序列的DNA，使其带上标记，经变性后成为单链，在一定条件下与待测DNA单链杂交，如两者序列有同源性，就形成带有标记的双链DNA分子，这也就等于检测到了待测的DNA。这段带有标记的核苷酸序列称为核酸探针（Nucleic acid probe）或基因探针（Gene probe）。,核酸的分子杂交方法有多种，下面简要介绍常用的几种。（一）Southern印迹杂交（Southern bloting）这一技术是由E.Southern于1975年首先设计出来的，因此将其命名为Southe

39、rn 印迹杂交技术。具体步骤是将DNA样品用一种或几种限制性内切酶消化后，再进行琼脂糖凝胶电泳分离，经碱变性等预处理，使其中的DNA双链分子变性为单链，然后,利用毛细管作用原理或其它物理方法，将凝胶中的单链DNA分子转移并固定到固相支持物表面上（一般为硝酸纤维素膜或尼龙膜），此时的DNA片段还保留着原来 谱带的模式。此时用核酸探针与膜上的DNA片段杂交，那么，与探针有同源性的DNA片段在膜上的位置便可通过放射自显影被检测出来（图2-29）。此法灵敏度很高，可以检测出仅含2ng的DNA电泳条,带。它几乎可以同时用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图。,图2-29 Southern分子杂交技术用于检

40、测特异DNA 序列的存在,（二）Northern 印迹杂交（Northern bloting）这种方法由于与Southern印迹杂交技术十分类似而得名。所不同的是：Northern印迹杂交是将RNA分子从凝胶转移到硝酸纤维素膜或其它化学修饰的活性滤纸上，从而进行核酸杂交的一种实验方法。此法因测定的是细胞的总RNA或mRNA，所以操作时需注意：（1）RNA极易被环境中存在的RNA酶系所降解，因此在提取,过程中应谨防RNA酶的污染，（2）为保持RNA电泳时呈单链线形状态，防止其形成发夹式二级结构，琼脂糖凝胶电泳时需在变性剂（乙二醛或甲醛、甲基氢氧化汞）的存在下进行。（3）印迹前须将变性剂用水冲洗去

41、掉。（三）斑点杂交（dot blotting）斑点杂交是在Southern 印迹杂交的基础上发展而来的快速检测特异核酸（DNA或RNA）分子的杂交技术。操作是通过抽,真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后按如同Southern或Northern 印迹杂交一样的方式同核酸探针分子进行杂交。因加样时使用了特殊设计的加样装置，使众多待测的核酸样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵，因此称为斑点印迹杂交。此法更适用于核酸样品的定量检测。而不是定性检测。可通过扫描仪扫描斑点的放射性脉冲数，来确定样品中RNA或DNA分子的相对含量。,（四）原位杂交（i

42、n situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，是在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与RNA或DNA杂交，杂交反应在载物片上的细胞内进行。其基本步骤是通过适当处理使细胞通透性增加，探针进入细胞内与DNA或RNA杂交、冲洗等。用放射自显影或免疫酶法显示杂交结果。用于原位杂交的探针可以是单链或双链,DNA和RNA探针。所用的探针要短，才能尽量使探针掺入细胞内。一般用具50300bp长度的探针较合适。新近研究表明，人工合成的1630bp的寡核苷酸短链能自由进出组织细胞壁，杂交效率也高，是原位杂交的优良探针。探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物和半抗原等。原

43、位杂交可以用来确定探针的互补序列在,细胞内的空间位置，用标记的探针与细胞分裂中期染色体DNA杂交以研究染色质中特定核酸序列，与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞和组织中的分布和特定基因表达水平。原位杂交是一种发展极为迅速的新技术，但敏感性、特异性和稳定性仍需进一步完善和提高。,第五节 DNA序列分析及进展,遗传信息储存在DNA分子一级结构的核苷酸序列中，特定的序列表达的信息是什么？首要的任务是序列测定。人类基因组基本框架已经建立，并期望尽快弄清全部基因组序列，以便掌握人类生、老、病、死的奥秘。因此，DNA序列分析技术与方法，当之无愧成为揭开生命之秘的一把金钥匙。它对于从分子水平,研

44、究基因结构与功能的关系以及克隆DNA片段，都具有广泛的实用价值。二十世纪60年代以前，由于分离分析技术和研究方法上的限制，DNA序列分析进展比较缓慢。为了使DNA核苷酸序列分析成可能，著名华裔生物化学及分子生物学家吴瑞士，在1968年独巨匠心地设计出一种崭新的引物-延伸测序策略，开创性的建立了DNA序列测定的新方法，并于1971年首次成功地测定了噬菌体两个,粘性末端的完整序列。之后，F.Sanger在他的引物-延伸策略基础上，发明了快速测定DNA序列的末端终止法；K.Mullis采纳了F.Sanger方法，完善了聚合酶链反应（PCR）扩增DNA的方法；M.Smith根据K.Mullis方法，发

45、明了碱基定点突变技术。这三位科学家独到的研究成果和方法的启迪性显为人知，先后荣登诺贝尔领奖台。由于技术方法的建立，许多基因的DNA序列测定进展顺利。已测核苷酸,序列所包含的信息被科学家们广泛地用于医学、农业和工业在内的生物学的各个领域。已经和即将对人类带来更多福音。一、Sanger法1Sanger双脱氧末端终止法基本原理剑桥大学著名生物化学家F.Sanger于1977年发明的一种简单快速DNA序列测定新方法，该方法要求的基本条件是：选取高纯度的待测单链DNA作模板；供给5标记的短链DNA引物和dNTP底物；具有,热稳定性好、活性高的DNA聚合酶 如Kelenow片段或Taq酶等）；尤其需要加入

46、可随机终止链式聚合反应的试剂2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。ddNTP与dNTP结构区别见图2-32。F.SangerDNA序列测定方法的要点是：把待测DNA样品分出四份，分别置于编号试管；加入底物dNTP、聚合酶、5被放射性标记的DNA引物；给各试管分别加入一种ddNTP；保温反应后，从各管,分别取样，并在同一块凝胶上进行PAGE分离、放射性自显影；根据显带拼读碱基序列。试管反应液中如果加入ddNTP的是ddATP（如图2-33中的第1号试管），聚合酶在链式聚合反应过程中的某一次反应，会在标记的引物新生链3-OH上，根据模板（T）的要求掺入ddAMP。一旦掺入ddAMP后，由于其3-

47、端无游离的-OH，因此该标记的新生链的延伸即告终止。因为反应掺入,ddAMP是随机的，结果会在反应液中存在以ddAMP为结尾的各种长度的新生DNA片段。其它试管则类似存在以ddCMP、ddGMP、ddTMP结尾的各种长度的片段。四种反应液分别作样品，在同一胶面上进行PAGE电泳分离。由于PAGE方法有很高的分辩率，即使相差一个单核苷酸的标记片段也能使之分开。最后通过放射性自显影术显带后，便可以读出待测DNA核苷酸顺序。通过F.Sanger法，有经验的工作者可以测定,含有200300核苷酸的DNA顺序。有关测定原理见图2-33。双脱氧法的特点是需要单链模板、寡核苷酸引物和高质量的DNA聚合酶。该方法的优点是简单、快速。缺点是聚合反应会因为二级结构而提前终止，常常测不到准确的DNA序列；由于需要经模板与引物结合后，才能反应并测序，因此对于寡聚核苷酸DNA序列，例如对引物DNA的序列不能测定。该法直接分析的是合成,的新链序列，而不是模板链，因此不能分析模板中甲基化部位；需要适当的引物和能合成单链模板的载体。,