鼠疫实验室检测技术.ppt
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1、鼠疫实验室检测技术,鼠疫实验室检测,针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性的检测:鼠疫菌的染色检查;鼠疫菌的培养及鼠疫噬菌体试验;鼠疫菌的生化检查、营养需求、毒素检测、毒力测定等。针对病原体特异性抗原结构的检测:鼠疫F1抗原抗体检测;鼠疫菌外膜蛋白的检测。针对病原体遗传基因的检测:鼠疫菌的质粒检测;鼠疫菌特异性核酸片断的检测;鼠疫菌全基因组测定;插入序列的检测。,一、鼠疫菌菌体形态检查,典型的鼠疫菌呈短而粗,菌体长12m,宽0.50.7m,中段膨大,两端钝圆,且两极浓染的卵圆形小杆菌,有荚膜,无鞭毛,无芽胞。革兰氏染色阴性。染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压印片,可见到两端钝圆、两极浓染
2、的典型鼠疫菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌,对于鉴别杂菌污染材料极有价值。鼠疫菌染色方法有革兰氏染色(菌体染成红色)、美兰染色(菌体染成兰色,两极浓染明显)、姬姆萨染色(菌体染成色,荚膜染成色),鼠疫菌染色检查(脏器压印片),美兰染色,革兰氏染色,鼠疫菌染色,鼠疫菌涂片的革兰氏染色,鼠疫菌染色检查,Wayson stain(魏申氏染色)呈现的两极浓染特征,荚膜染色墨汁负染色,二、鼠疫菌的培养特性,鼠疫菌是典型的异养菌。鼠疫菌为需氧菌,亦为兼性厌氧菌。鼠疫菌在普通培基上生长良好,培养的最适温度为28,最适pH为6.9-7.1,发育初期的最适氧化还原电位(Eh)约为100150mV,接种后
3、至少20h以上才能形成肉眼可见的菌落,一般2448h形成肉眼可见的小菌落。强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性,缺乏时生长不良。37缺钙条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达和分泌毒力蛋白V抗原(LcrV)。此现象称为低钙反应,受70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养24h以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色,反射光线下菌落圆形隆起呈淡灰白色,镜下见菌落中心发暗,有黄褐色粗糙颗粒,周边围绕一圈宽窄不等,边缘不整呈锯齿状、薄而透明的花边。,鼠疫噬菌体试验,在培基上密集平行划线培养鼠疫菌,鼠疫噬菌体滴于上端划线中部,直立平板
4、,使噬菌体液垂直划线自然流下,置20培养24h,有明显的噬菌带。在1822鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假结核菌,具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异性),是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验,20h左右即可获得结果。分离到鼠疫噬菌体,可以间接判定检材中存在鼠疫菌。,鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验,典型鼠疫菌菌落形态,噬菌带,鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验,鼠疫菌培养特征,鼠疫噬菌体试验,三、鼠疫F1抗原、抗体检测,鼠疫F1抗原检测1.反向血球凝集试验(RIHA)2.酶联免疫吸附试验(ELISA)3.胶体金免疫层析法(
5、GICA)4.免疫荧光技术(IFT),鼠疫F1抗体检测1.间接血球凝集试验(IHA)2.酶联免疫吸附试验(ELISA)3.胶体金免疫层析法(GICA),间接红血球凝集试验(IHA),鼠疫菌特异性F1抗原致敏经单宁酸鞣化处理的醛化绵羊红血球,制备成F1抗原致敏血球,检查鼠疫特异性F1抗体。试验方法和结果判定均为常规操作。IHA微量法结果:,反向血球凝集试验(RIHA),用F1抗体致敏血球,检查鼠疫特异性F1抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。RIHA微量法结果:,酶联免疫吸附试验(ELISA),测抗体.双抗原夹心法:F1抗原包被反应板,加入待测标本28反应1.5h洗板,加入HRP-F1抗原28
6、反应1h洗板,加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液(2mol/L硫酸)。间接法:已知F1抗原包被反应板,加标本37反应1h洗板,加入酶标二抗37反应1h洗板,加入底物(如OPD或TMB)蔽光反应30min显色后加终止液。用肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值(A),测抗原双单抗夹心法:F1-McAb包被反应板,加入标本28反应1.5h洗板,加入HRP-F1McAb 28反应1h洗板,加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液。双抗体夹心法(改良法-美国CDC鼠疫诊断技术实验室操作手册):鼠疫免疫血清特异性抗体(F1Ab)包被反应板,加标本37反应1h洗板,加小鼠F1McAb 液37静
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