石蜡制片2电镜3徒手切片法.ppt

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1、第五章 园艺植物制片方法 植物制片是进行园艺植物科学研究所需用的一种基本方法，比如进行植物各个器官的解剖构造观察、花芽分化研究、授粉受精观察、贮藏营养观测以及染色体观察等都需要进行制片。通过对切片结果的分析，可以比较不同试验处理的效果以及了解不同树种和品种相应的生物学特性等。植物制片技术是一个相对独立的体系，内容繁多。在本章内容中，将介绍在园艺植物科学研究中常用的一些基本方法和原理。,第一节 徒手制片 一、徒手制片（切片）及特点 徒手制片一般指徒手用刀片把新鲜的植物材料切成薄片的制片方法。此制片法主要优点是：（1）能及时观察研究植物生活组织的结构和天然色彩；（2）方法及用具简单，不需切片机等机

2、械设备，短时间即可完成。主要缺点是（1）对于微小、柔软、水分过多以及坚硬的材料，难以用徒手切成薄片；（2）对于操作不熟练者，往往切成厚薄不匀或不完整的切片。,二、徒手制片的方法及注意事项 徒手制片最主要的工具就是刀片，常可用单面保安刀片。要获得良好的切片，首先要保持刀口的锋利。切片方法及步骤为：（1）准备工作（盛好清水的培养皿、显微镜、载玻片、盖玻片、刀片等用具）。（2）拿取材料进行切片，材料可以是新鲜的材料，也可以是经过固定的材料（切片时，将欲切材料断面和刀片上滴上清水以保持材料湿润）。,（3）以左手拇指、食指、中指捏住材料，拇指应低于食指，以免切伤手指；材料高出指尖。（4）右手执刀，将刀平

3、放在食指上，刀口朝内，刀面与材料断面平行，然后以均匀快捷的动作自左前方向右后方以臂力带动刀片水平切割移动，不要用腕力。同时还要注意，切时动作要迅速，材料一次切下，切忌停顿或拉锯式切割。,（5）连续切数片后，将切下的薄片轻轻移入盛水的培养皿中备用。然后挑选薄而透明的切片，放在载玻片上的水滴中，加上盖玻片制成临时制片进行观察。在试验中，有时因各种情况所取材料无法马上进行制片。可以将其保存在固定液中，常用的固定液为固定液，它不但是优良的固定液也是优良的保存液，其配方为：5ml福尔马林（甲醛）：5ml冰醋酸：50-70%的乙醇90ml。,用徒手切片的材料不宜过大，一般以表面不超过5-8mm 为宜。对于

4、过于柔软或微小的材料（如叶片、细小的根尖等）需要借助一些夹持物方可进行切片，如果临时制片需保存一段时间，（1）将材料封在水中，每隔20-30分钟再加一滴水，此法可保持数小时；（2）用10%-30%的甘油水溶液代替清水封片，并将制片放在铺有湿滤纸的大培养皿中保存，或用石蜡或指甲油封边保存，可保存1-2周或更长时间。,第二节 压片及涂片 涂片和压片是进行植物染色体观察研究常用的制片方法。涂片是将新鲜的材料或者是经过固定的材料于载片上，托涂成均匀一层，经染色后盖上盖玻片镜检。压片是将处理后的材料于载片上分散后加盖片，用拇指或镊子轻轻挤压盖片，使组织分散成一片，然后镜检。,进行染色体观察时注意，若进行

5、染色体数目测定要求取样个体数在5个以上，细胞总数在30个以上；若进行染色体核型分析（组型分析)则要求取样应是来源于不同个体的5个细胞。一、常规压片法1.取材：于细胞分裂旺盛时期取样。一般取根尖、茎尖。2.预处理：防止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期阶段；使染色体收缩变短，便于观察统计。常用药剂有秋水仙碱溶液、8-羟基喹啉、对二氯苯饱和水溶液、富民隆。预处理的时间一般为2-12小时。,3.固定：把细胞迅速杀死，使蛋白质变性沉淀，尽量保持材料结构的原有状态，以备进一步处理。常用的固定液为卡诺固定液，即3：1的纯酒精:冰醋酸溶液。固定时间一般为1-24小时。4.解离：根尖、茎尖等体细胞组织，需经过

6、某些处理，除去细胞之间的果胶层并使细胞软化，这种细胞分离和软化后的组织才便于压片。最常用的是酸水解和酶处理两种。,染色：常可用孚尔根染色法或醋酸洋红等核染色剂进行染色。压片：将材料移至载玻片上，盖上盖玻片，用解剖针或用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞分散，再用拇指轻挤压盖片使组织成为一薄层。镜检：将压片置于显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行统计记数，并可照相绘图，以便进行核型分析。同时可用记号笔在载玻片和盖玻片上分别做记号，以便再次观察和照相。,封固：好的压片，可采用冷冻干燥后，用光学树胶封固保存。也可进行脱水透明等步骤制成永久切片。若临时保存，可以用石蜡封边，放于培养皿中于冰

7、箱冷冻室内短期保存。二、去壁低渗法（涂片法）1.取材：同上述常规压片法。2.预处理（前处理）：同上述常规压片法。3.前低渗：将处理后的材料防灾0.075M KCl低渗液中，在20-25条件下处理30分钟左右.,具B染色体的黑麦基因组核型,4去壁：倒去KCl溶液，加入2.5%混合酶液（纤维素酶与果胶酶各占2.5%），在温度25-30下处理2-5小时左右。酶液与材料的比例适当，酶液不能过少。5.后低渗：倒去酶液，用蒸馏水冲洗2-3次，然后在蒸馏水中停留5-10分钟左右后进行后低渗。6.固定：用甲醇:冰醋酸（3:1）固定液固定。7.涂片：将去壁固定的材料放在载玻片上，加一滴固定液，然后用镊子将材料夹

8、碎，去掉大块残渣，然后从载玻片一侧向材料轻轻吹气，使组织分散成一薄层。,8.火焰干燥：将载片于酒精灯上微微加热烤干。9染色：用40:1的Giemsa染液染色4-30分钟或更长，蒸馏水清洗，空气干燥后可用树胶封片。10.镜检：于显微镜下观察。第三节 石蜡制片 石蜡切片是光学显微镜的制片技术中最常用的一种方法，属于永久制片。一般的植物材料都可以用此法制片。但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。,操作程序如下：1.材料的采集与分割：根据制片的目的和要求采集材料，材料要有代表性。材料采后应尽快进行分割固定。为使固定液能迅速的渗透材料，要进行材料分割。分割块宜小不宜大，一般不超过1c

9、m3，分割后立即杀死固定。2.杀死与固定：利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。常用的固定液有固定液、卡诺固定液等，前者还可作保存液。,3.脱水：除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包埋等步骤的进行。常用的脱水剂为酒精。脱水采用等级脱水（系列脱水），即从较低浓度酒精开始，逐渐替换到高浓度酒精。4.透明：将脱水剂从材料中除去，使材料透明，增加折光系数；便于下步的浸蜡和包埋等程序。透明剂是一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的药剂。常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也是逐级进行，可减少材料收缩。,5.浸蜡：逐渐除去透明剂,并为包埋剂所代替。常用的包埋剂是石蜡。浸蜡过程是使石蜡慢慢溶

10、于浸有材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡渐渐深入到材料的细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取代，以便切片。6.包埋：将浸蜡后的材料包埋在石蜡中。此步骤要迅速，且不要使石蜡块中有气泡。注意将样品编号封于蜡块上，以免样品混淆，以备切片。,7.修块和切片：将已包埋好的蜡块切成小块，每一小块包含一块材料。然后按照所需的切面，进行修整。把蜡块粘接在载蜡器上，用切片机将蜡块切成连续的蜡带。8.粘片：将切下来的切片粘在洁净的载玻片上。粘片时先在载玻片上滴上一小滴粘片剂，加几滴蒸馏水，然后用镊子小心把切片放在水上，在35-40下，用拨针将切片伸直、展平，倾斜载片，使水流去并烘干。9.脱蜡、染色、脱水透明和封片

11、：粘片后要经过脱蜡、染色、再次脱水透明，然后封片永久保存。,脱蜡、染色和脱水透明的过程仍采用等级法逐渐进行。最后加拿大树胶封片，然后贴标签镜检及保存。以上是石蜡制片的一般步骤；为了获得良好的制片效果，需要制片者的大量实践并在实践中不断摸索、积累经验方可。,亮叶忍冬叶片解剖构造,韭菜根横切面,女贞茎横切面（皮孔）,南瓜茎横切面局部,第四节 电镜制片,电子显微镜（简称电镜）大体上分两类，一是扫描电镜，二是透射电镜。扫描电镜能直接观察到样品表面的三维立体结构，如植物的花、叶、果实的表面结构等；投射电镜可观察到植物组织的超微结构，如叶绿体的膜结构韧皮部疏导组织结构等等。它们的制片方法有很大不同。,一、

12、扫描电镜常规制片方法（一）取材 基本要求是：动作应迅速、部位要准确；刀片要锋利；尺寸不宜过大；采取易分散的材料，要注意防尘、样品分散；数量必需取够。（二）清洗 共清洗3次。清洗掉样品表面杂质等附着物；除掉没有和样品成分发生反应的固定剂。常用的清洗液有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液以及含酶的清洗液，可依具体情况选择。,（三）固定 目的是 尽量完善的稳定和保存样品细胞内的各种成分和结构，使其接近生活时的状态。常用的方法是戊二醛四氧化锇双固定法。先用1-3%的戊二醛/缓冲液固定数分钟至数小时，再用1%锇酸/缓冲液在4下固定30-60min。（四）脱水和置换 采用系列乙醇或丙酮逐级脱水，一般为：30%5

13、0%70%80%95%100%，每步15-20min。（五）干燥 是制片关键一步。目的是去除样品中的游离水或已取代游离水的脱水剂，使样品中不含有液态物质。临界点干燥法是目前公认的较好方法。,（六）粘样 将干燥好的样品用导电胶将样品粘在样品台上，并做好标记。常用的有银粉导电胶、石墨粉导电胶、双面胶带、普通胶水等。（七）镀膜（喷涂）是把粘贴到样品台上的样品和样品台表面同时喷涂上一层金属膜，使样品具有良好的导电性，以便下一步观察。一般喷涂10-20nm厚的金属膜，常用的金属有金、铜、铝、金-钯。,（八）观察 喷好的样品就可以用扫描电镜进行观察了（一般20kv）。如果一时不能观察，需把样品放入干燥器中

14、保存，以防受潮或被污染。,OK！,扫描电子显微镜,苹果花粉粒,蜀葵花粉粒,一串红花粉粒,二、透射电镜制片基本方法（超薄切片）（一）取样 要求取样要有代表性、迅速、准确、及时、体积小、低温、防损伤。一般要求体积2。（二）固定 目的是要在分子水平上真实的保存细胞超微结构的每一细节。常用的方法是化学固定法，目前大部分植物材料采用的固定方法是戊二醛锇酸双固定法，即先用戊二醛作预固定，然后用锇酸作后固定。对于一般植物叶、幼茎、幼根可用3%的戊二醛固定2小时，用1-2%四氧化锇固定2-3小时。,（三）脱水 常用的脱水方法是逐级脱水，即采用的脱水剂浓度梯度为30%50%70%80%90%95%100%（10

15、0%浓度中换3次），常用的脱水剂为乙醇或丙酮。每一级脱水剂中停留时间为10-20min，脱水剂用量一般为样品体积的10倍以上。（四）渗透与包埋 将脱完水的组织先后经过脱水剂和环氧树脂渗透液（是常用的包埋剂，目前常用的型号为Epon812），比例分别为3：11：11：3，每步30-60min。将渗透好的样品块放到适当模具中，灌上包埋液包埋，经过加温聚合形成一种固体基质（也叫包埋块），已备切片。,（六）超薄切片 标准的超薄切片应该是厚度适中、均匀、平整、无刀痕、无颤纹和皱褶。基本步骤为：准备切片刀和铜网修整包埋块切片捞片。铜网准备：超薄切片要放在载网上才能进行染色等操作，并最终放到电镜中观察。载网

16、是用无磁性金属材料做成的，厚50微米，直径一般为3mm，一般用铜材料，所以又叫铜网。铜网要经过清洗，方可使用。目前清洗方法主要有：超声波清洗法、酸碱清洗法。支持膜的准备：铜网的网孔很小，但对于放置超薄切片及其他样品来说，网孔还嫌大，不足以平坦地支持切片，所以要在铜网上覆一层透明的膜支持膜。,切片刀准备：超薄切片刀有两种，一是金刚刀，二是玻璃刀。前者价格昂贵、质地坚硬、经久耐用；后者制作方便、价格低廉、但刀刃较脆、不耐用、不能切硬质材料。制刀用玻璃为硬质玻璃，含硅量72-75%以上。切片：是用超薄切片机切出50nm后左右的超薄切片，以供观察。展片与捞片：切下的超薄切片漂浮在刀槽液面上，需要将它捞

17、至于铜网上，才能染色和电镜观察。由于切片很薄，在切片过程中易皱褶，使样品结构重叠，因此在捞片前需进行展片。捞片后，用滤纸吸去多余水分，然后将载网放入样品盒，至于干燥器中保存，待染色。,（七）切片染色（电子染色）要进行电子染色后才利于电镜观察。所谓电子染色是使铀、铅、锇、钨等重金属盐类中的重金属与组织中某些成分结合或被吸附，以此达到染色目的。经过电子染色处理可以提高样品的反差，增加图像的清晰度。常用的电子染色剂有醋酸铀和铅盐。常用的染色方法是双染色法，即先用醋酸铀染色，然后再用柠檬酸铅染色。染色时间，室温下染色15-20min。（八）电镜观察 染色完成的样品立即上机观察，如受时间限制，样品应放置于干燥器中防受潮。,透射电子显微镜,透射电子显微镜,油菜花粉粒-小孢子胚胎发生诱导,油菜花粉粒单核液泡期,NaCl+Si处理Ch：叶绿体SG：淀粉粒,