生物选修3专题1基因工程.ppt
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1、专题1:基因工程,基因工程的概念,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。是在生物体外,通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”,对生物的基因进行改造和重新组合,然后导入受体细胞内进行无性繁殖,使重组基因在受体细胞内表达,产生出人类所需要的基因产物。基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,1.1 DNA重组技术的基本工具,一.限制性核酸内切酶“分子的手术刀”二.DNA连接酶“分子缝合针”三.基因进入受体细胞的体“分子运输车”,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,(1)性质:一
2、种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。,(2)分布:主要在原核生物中。迄今从不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。(3)限制酶在原核生物中的作用是什么吗?原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵,限制酶是原核生物的一种防御性工具,当外源DNA侵入时,会利用限制酶将外源DNA切割掉,使之失效,达到保证自身的安全的目的。,(4)为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA?因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,对于外源入侵的DNA可以降解;含有某种限制酶的细胞,其DNA分子中或
3、者不具备这种限制酶的识别切割序列,或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。(5)限制酶所识别的序列有什么特点?所识别序列的中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。,(5)作用结果:产生的DNA片段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。,(6)用同一种限制性酶处理不同DNA片段,会形成同样的黏性末端,可进行重组。,2、DNA连接酶“分子缝合针”,(1)作用:将双链的DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,(2)种类:Ecoli DNA 连接酶 从大肠杆菌中分离得到,只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接起来,不能将双
4、链DNA片段平末端之间进行连接。T4 DNA 连接酶 从T4噬菌体中分离得到,既可“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低。,(3)DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?不是一回事。相同点:两者都是形成磷酸二酯键。不同点:DNA聚合酶是以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来,不需要模板。,3、基因进入受体细胞的运载体,常用运载体:质粒、噬菌体、动植物 病毒质粒存在:存在于细菌及酵母菌的染色体以外。特性:是很小的环状DNA分子,在细
5、胞染色体外能够自我复制。,大肠杆菌质粒的分子结构示意图,大肠杆菌质粒的分子结构示意图,天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗?为什么?作为运载体的条件:(1)必需有一个或多个限制酶的切割位点,以便目的基因可以插入到运载体上去,而且这些位点所处的位置,还必须是在质粒本身需要的基因片段之外,这样才不至于因目的基因的插入而失活。(2)必需具备自我复制的能力,或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。,(3)必需带有标记基因,以便重组后进行重组子的筛选。(4)必需是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到受体细胞外的其他生物细胞中的。(5)分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作。
6、故天然的DNA分子一般不能直接用做基因工程运载体。,1.2、基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取;2、基因表达载体的构建;3、将目的基因导入受体细胞;4、目的基因的检测与鉴定;,1、目的基因的获取,目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,还有植物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子贮藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,人工合成基因法1)反转录法:以目的基因转录成的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA(
7、即目的基因),反转录,合成,2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法:根据已知蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后按照碱基互补配对原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学方法,以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术?1)DNA序列自动测序仪:对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。2)PCR技术:使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,利用PCR技术扩增目的基因,利用PCR技术扩增,概念:PCR全称为_,是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件:
8、_、_、_(做启动子)、_.前提条件:,原理:_,方式:以_方式扩增,即_(n为扩增循 环的次数),结果:,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,PCR技术扩增过程,a、DNA变性(90-96):双链DNA模板 在热作用下,_断裂,形成_,b、退火(复性25-65):系统温度降低,引 物与DNA模板结合,形成局部_。,c、延伸(70-75):在Taq酶的作用下,从 引物的5端3端延伸,合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR原理,变性,3)从基
9、因文库中获取目的基因:基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,2、基因表达载体的构建核心,目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够在表达和发挥作用。单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能表达和发挥作用。,用一定的限
10、制酶切割质粒,使其出现一个切口,露出黏性末端。用同一种限制酶切断目的基因,使其产生同样的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,再加入适量DNA连接酶,形成了一个重组DNA分子(重组质粒)。,质粒,DNA分子,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子(重组质粒),经此过程,基因表达载体的构建就成功了?,同一种 限制酶,基因表达载体的组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因,启动子:一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。,终止子:也是一段有特殊结构的DNA片
11、段,位于基因的尾端,使转录在所需要的地主停止下来。,作为基因工程表达载体,只需含有目的基因就可以完成任务吗?为什么?不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用,还要有启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是:(1)生物之间进行基因交流,只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达(2)通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子,只将编码序列导入受体生物中无法转录;(3)目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记;,3、将目的基因导入受体细胞,转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。常用的受体细胞:有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母
12、菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,方法:将目的基因导入植物细胞:农杆菌转化法(双子叶植物和祼子植物)、基因枪法(单子叶植物)、花粉管通道法将目的基因导入动物细胞:显微注射法将目的基因导入微生物细胞:感受态细胞,将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:首先用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.第二
13、步目的基因在受体细胞内,随其繁殖而复制,由于细菌繁殖的速度非常快,在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,导入过程完成后,全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗?真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少要对受体细胞作怎样的处理?对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测怎样进行检测?通过目的基因上的标记基因,进行筛选和检测,4、目的基因的检测与鉴定,检测:(分子水平)检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因:方法DNA分子杂交(DNA+DNA)检测目的基因是否转录出了mRNA:方法DNA分子杂交(DNA+MRNA)检测目的基因是否翻译成蛋白质:方法抗原抗体杂交(如果有,表示目的基因已经进行了翻
14、译),DNA分子杂交技术,分子探针:核酸分子探针是指特定的已知核酸片段(目的基因片段),能与互补核酸序列退火杂交,用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。满足条件:(1)必须是单链;(2)带有容易被检测出来的标记物(如放射性同位素标记)。核酸分子杂交实质上是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交。,DNA分子杂交示意图,如果显示出杂交带,就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,DNA分子杂交示意图,用DNA分子杂交技术可鉴定两个物种之间的亲缘关系的远近。将两种生物的DNA分子的单链放在一起,如果这两个单链具有互补的碱基序列,那么,互补的碱基
15、序列就会结合在一起,形成杂合双链区;在没有互补碱基序列的部位,仍然是两条游离的单链。如果杂合部位多,则亲缘关系近,反之则远。,鉴定:(个体水平)抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,将每个受体细胞单独培养形成菌落,检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落,保留有表达产物的进一步培养、研究。,1.3、基因工程的应用,(一)、植物基因工程硕果累累(二)、动物基因工程前景广阔含基因工程药品异军突起(三)、基因治疗曙光初照(四)、基因工程与环境保护,(一)、植物基因工程硕果累累,转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良弄作物的品质和利用植物生产药物等方面.,1.抗虫转基因植物,转
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