生物化学与分子生物学技术原.ppt

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1、绪论,生物化学与分子生物学定义与其他学科关系发展简史实际应用,什么是生物化学？,简单说，生物化学是生命的化学。生物化学是用化学的理论和方法作为主要手段，研究生物体的基本物质的结构（如Carbohydrates,Lipids,Proteins and Nucleic acid)、性质及其生命活动的变化规律（生命活动如：生长、生殖、代谢、运动等）,是研究生物体的化学组成与性质（静态生化，Static Biochemistry)，以及机体内所进行的化学变化(Dynamic Biochemistry)的科学。,分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科

2、学。分子生物学(molecular biology)是生物化学的重要组成部分。,生物化学与分子生物学 同有关学科的关系,生物化学与分子生物学是生物学的最深层次；生物化学与分子生物学是化学的最高层次；生物化学与分子生物学为农学、医学和食品科学提供理论依据和研究手段；物理学、信息科学和数学为生物化学与分子生物学提供研究手段。,与生物化学的关系最为密切,但存在一定的差别,分子生物学的三大原则,1)构成生物大分子的单体是相同的共同的核酸语言 共同的蛋白质语言,2)生物遗传信息表达的中心法则相同,DNA,RNA,3)生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同,不同的高级结构 不同的生物大分子之间的互作

3、,不同的物种特性,准备和酝酿阶段 时间：19世纪后期到20世纪50年代初。两点重大突破：确定了蛋白质是生命的主要基础物质；确定了生物遗传的物质基础是DNA。,现代分子生物学的建立和发展阶段,时间：从50年代初到70年代初，1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。主要进展包括：遗传信息传递中心法则的建立对蛋白质结构与功能的进一步认识,初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段,时间：70年代后至今基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。,生物化学中的关键技术,电泳（1923）生物大分子的分离、分析超离心（

4、1925）蛋白质、细胞亚器官的 分离；分子量的确定同位素标记（1934）物质代谢途径、生物大分子结构测定层析（1944）生物大分子的分离纯化X-光衍射、NMR：生物大分子结构测定,超速离心（1920S）电泳（1930S）电镜（1930S）同位素示踪（1940S）柱层析（1940S）X射线衍射（1950S）氨基酸分析与测序（1950S）核酸杂交（1960S）核苷酸测序（1970S）重组DNA技术（1970S）DNA合成（1980S）单克隆抗体组织化学（1980S）聚合酶链式反应（1980S）,分子生物学常用技术,1901-2012111项生理医学诺贝尔奖中，69项（62%）颁给了生物化学与分子生

5、物学领域,发展历程,分子生物学中重大成就与突破者Nobel Prize的获得者构成了分子生物学发展的主要内容里程碑,1910 科赛尔 Kossel（德）,蛋白质、细胞及细胞核化学的研究（首先分离到A、T和组氨酸）,1958 莱德伯格 Lederberg（美）噬菌体转导,比德尔 Beadle&泰特姆 Tatum（美）One gene-one enzyme红色面包霉突变体,Lederberg,1959 奥乔亚 Ochoa(美籍西班牙裔)科恩伯格 Kornberg（美）,Ochoa,Kornberg,细菌的多核苷酸磷酸化酶，成功地合 成了RNA，基因（DNA）RNA蛋白质,实现了DNA分子在试管内（

6、细菌无细 胞提取液）的复制,1962 Watson（美）Crick（英）Wilkins（新西兰）,通过DNA分子的X射线衍射研究证实 DNA Double Helix Model,DNA双螺旋发现的深刻意义,确立了核酸作为信息分子的结构基础;提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；最后确定了核酸是遗传的物质基础；为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。,1962 肯德鲁 Kendrew 佩鲁茨 Perutz（英国）,Kendrew,Perutz,测定了肌红蛋白及血红蛋白的高级结构（三级）,成为研究生物大分子结构的先驱,1965 雅各布 Jacob 莫诺 Mono

7、d（法国）,提出并证实了Operon作为调节细菌细胞代谢的分子机制首次提出mRNA分子的存在,1969 Nirenberg（美）Holly Khorana,尼伦伯格 Nirenberg,克拉纳 Khorana,霍利 Holley,破译了遗传密码,酵母phetRNA的核苷酸序列并证明了所有tRNA三级结构的相似性,第一个合成了核酸分子，并人工复制了酵母基因,1975 Temin，Baltimore(美)&Dulbecco,特明 Temin,巴尔的摩 Baltimore,发现了逆转录酶（以RNA为模板，逆转录生成DNA RNA肿瘤病毒）,杜尔贝克 Dulbecco,桑格 Sanger,吉尔伯特 G

8、ilbert,伯格 Berg,1980 Sanger（英）Gilbert&Berg（英）,酶法核苷酸测序的设计者,化学测序法的设计者,DNA重组，在细菌中表达胰岛素DNA重组技术的元老,Sanger还由于测定了牛胰岛素的一级结构而获得1958年诺贝尔化学奖。,1984 Kohler（德）Milstein（美）Jerne（丹麦）,科莱尔Kohler,米尔斯坦Milstein,杰尼 Jerne,发展了单克隆抗体(Monoclonal Antibodies McAb)技术，完善了极微量蛋白质的检测技术,1988 麦克林托克 McClintock(美),可移动的遗传因子（jumping gene or

9、 mobile element）,McClintock,50年代初发现88年获奖,1989 奥尔特曼 Altman（加）切赫 Cech（美）,核酶即核糖核酸质酶（Ribozyme）的发现者（即某些RNA具有酶的功能）,1989 BishopVarmus（美）正常细胞同样带有原癌基因,1993 Roberts Sharp（美）断裂基因（splitting gene）,Mullis（美）PCR仪的发明者 Smith 基因定点突变,1994 Gilman Rodbell 发现G蛋白在细胞信号传导中的作用,1995 Lewis（美）、NussleinVolhard（德）、Wieschaus（美）20世

10、纪4070年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因,1990.10：被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的人类基因组计划（HGP）启动。1998.5：美国科学家克里格文特创建的塞莱拉遗传公司，目标是投入亿美元，到年绘制出完整的人体基因组图谱，与国际HGP展开竞争。：国际HGP联合研究小组宣布，他们完整地破译出人体第22对染色体的遗传密码。：当时的美国总统克林顿和英国首相布莱尔发表联合声明，呼吁将人类基因组研究成果公开，以便世界各国科学家都能自由地使用这些成果。2000.5：国际HGP完成时间预计从原定的2003年6月提前至2001年6月。：科学家公布人类基因组“工作框架图”。2001.2：国际HGP

11、(美、英、日、德、法和中国)的科学家和美国塞莱拉公司分别宣布完成绘制人类基因组测序草图。分别在15日出版的Nature和16日的Science公布。,人类基因组计划(Human Genome Project),“Whats Human Genome Project?”“One base One dollar!”-by a taxi driver(and a tax payer),全基因组已经测序的一些生物,生物化学与分子生物学的意义,1.生物化学是各门生物科学的基础，也是揭开生命奥秘的重要基础。2.生物化学在工业上广泛应用例如：食品工业中的酱油 大豆蛋白 曲霉水解 氨基酸 美拉德反应 酱油啤酒

12、生产：大麦芽+大米 麦芽糖、葡萄糖+氨基酸 啤酒酵母（7天）乙醇、糖、双乙酰 低温发酵（20天）啤酒,生物有效物质的提取,制药工业：链激酶、尿激酶、氨基酸、核甘酸（所谓基因营养物）、SOD、紫杉醇等。生物制品：疫苗 皮革工业：角质酶脱毛 生物化学不但为这些生产过程建立了科学基础并为其技术改造创造了条件,与农业方面有密切联系,举例作物病理研究 a.玉米大斑病（每年损失20-40%产量）抗病蛋白 b.水稻白叶枯病（损失20-30%产量）奶牛产奶量与营养的关系 中国奶牛 一般4-5吨/年产 国外奶牛 8-10吨/年产 食量自动化，营养个体化,重组DNA技术的应用,抗棉铃虫棉花,抗虫水稻,全球转基因农

13、作物销售额及预测,生物工程,作物防虫（转基因棉花、转基因西红柿）生物制药（转基因动物-人血白蛋白）作物育种（转基因水稻-抗除草剂）,A tobacco plant expressing the gene for firefly luciferase.Light was produced after the plant was watered with a solution containing luciferin,the substrate for the light-producing luciferase enzyme(see Box 132).Dont expect glow-in-th

14、e-dark ornamental plants at your local plant nursery anytime soon.The light is actually quite weak;this photograph required a 24-hour exposure.The real pointthat this technology allows the introduction of new traits into plantsis neverthelesselegantly made.,烟草表达萤火虫荧光素基因,表达抗虫基因的西红柿,Glyphosate-resista

15、nt soybean plants.The photographs show two areas of a soybean field in Wisconsin.(a)Without glyphosate treatment,this part of the field is overrun with weeds.(b)Glyphosateresistant soybean plants thrive in the glyphosate-treated section of the field.Glyphosate breaks down rapidly in the environment.

16、Agricultural use of engineered plants such as these proceeds only after considerable deliberation,balancing the extraordinary promise of the technology with the need to select new traits with care.Both science and society as a whole have a stake in ensuring that the use of the resultant plants has n

17、o adverse impact on the environment or on human health.,转草甘膦基因大豆,Cloning in mice.The gene for human growth hormone was introduced into the genome of the mouse on the right.Expressionof the gene resulted in the unusually large size of this mouse.,表达人生长激素的老鼠,喷洒工程菌清除石油污染,美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利

18、，用于清除石油污染。,生化与司法鉴定,司法鉴定是健全法制中的一个必需的工作环节，它包含了法律上要鉴定的一切事、屋和人。受伤与死亡现象中的生化 a.DNA含量随死亡时间而下降 b.心肌丁二酸脱氢酶、细胞色素氧化酶 随死亡时间而上升 c.精子DNA,DNA指纹技术的应用,亲子鉴定（VNTR）,亲子鉴定风行意大利（几十万）,现代家庭“情流感”,犯罪分析,血液、唾液、头发、精液和其他出现在犯罪现场的样品成为嫌疑犯被监禁或释放强有力的证据,误差率在百万分之一以下，结果非常精确。,DNA身份证,个人DNA基因身份证,第一章：生物大分子的提取、沉淀和离心分离,第一节 生物大分子的提取,蛋白质（包括酶），核酸

19、，脂类，糖类等生物大分子的制备分四个阶段：一.选择材料和预处理 二.细胞的破碎及细胞组分的分离 三.提取和纯化 四.浓缩，干燥和保存,一.选择材料及预处理 动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据试验目的来确定。有效成份是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其它物质则统称杂质。,1.动物组织：选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料变质影响纯度操作和制品的率。保存：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。a.冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：10的冰箱内；长期保存：

20、70低温冰箱内。b.干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备 用；对于含耐高温有效成分（如：肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长期保存。,2.植物材料：选材：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。a.提取核DNA：选用黄化苗（生长710天小麦，水稻），防止叶绿体DNA的干扰 b.提取RNA：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。保存：冷冻采样后尽快放于420冰箱内。DNA,RNA 采样后，N2速冻，至70冰箱。对RNA样，如不立即使用，冷冻保存尤为重要。,3.微生物：选材：应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核

21、酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：a.利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等。一般用离心法收集上清液，上清液只能在低温下短期保存 b.利用菌体含有的生化物质，如：蛋白质，核酸和胞内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保存，冻干粉可在4保存数月。3.,二.确定测定方法 在效成分在原材料中含量较低，纯化是使其纯度增高的过程，因此，提取和分离的每个步骤均要测定有效成分的含量。测定方法要专一、准确、灵敏和简便。使用较多的测定方法有分光光度法、荧光分析法、生物活性(如酶活力、激素活性)测定、电泳分析等，有时可用电化学法和免疫分析法。,三.细胞的破碎1.机械破碎：(

22、1)研磨法：剪碎的动物组织如鼠肝、兔肝等置研钵中，用研磨棒研碎。为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用匀浆器处理，也能破碎动物细胞。细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法。,(2)组织捣碎器法：用捣碎器(转速8000-10000r/m)处理30-45s可将植物和动物细胞完全破碎。但是在捣碎期间必须保持低温，捣碎的时间不易太长，以防温度升高引起有效成分变性。现在多用细胞破碎仪。(3)超声波法：借助声波的震动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。多用于微生物细胞的破碎，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。,(4)压榨法：是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用30MPa左右的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小

23、孔(细胞直径的孔)，致使其被挤破、压碎。(5)冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40左右)迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。,2.溶涨和自溶：溶涨：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。应用此法时要特别小心操作，因为水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，同时也可将某些有效成分在自溶时分解。3.化学处理：用脂

24、溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂(如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠)处理细胞时，可将细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类或DNA等物质，并导致整个细胞破碎。,4.生物酶降解：生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用了加溶菌酶(来自蛋清)破坏细胞壁的步骤。当有些细菌对溶菌酶不敏感时，可加巯基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促进细胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K来提高破壁效果。,四.抽提1.抽提的含义：抽提通

25、常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分分离出来的过程。经过处理的原材料中的有效成分可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（如丙酮、乙醇）等抽提，有时还可用蒸馏水抽提。一般理想的抽提液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。,2.抽提的影响因子 在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极性等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。因此选择抽提液必须考虑这些因素。（1）pH值：改变溶质解离状态。对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白

26、质选用高pH值的溶液抽提。,(2)溶剂的极性和离子强度：有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2 mol/L蔗糖水溶液。一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。,提高离子强度：在水溶液中加中性盐（KCl,NaCl,NH4Cl,(NH4)2SO4）一般离子强度较低的中性盐溶液可促进蛋白溶解

27、（盐溶），高离子强度的中性盐可引起蛋白质沉淀，析出（盐析）。高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA溶解度增加（核酸分离依据）。常用的盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mol/L为宜。但是在提取核蛋白或细胞器中的蛋白质时，为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器分离，则宜用高浓度(0.5-2.0mol/L)的盐溶液。,(3)水解酶：细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活化，采

28、用68的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸调节），在1315抽提3h，可得到较高的回收率。因为68乙醇可使胰蛋白酶暂时失活，草酸可除去蛋白酶的激活剂Ca2+，酸性环境也抑制酶蛋白活性。RNA提取需防止RNase的水解作用，RNase活性很高,(4)温度：一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0左右)时最稳定。例如：在生产人绒毛膜促性腺激素(HCG，糖蛋白)制品时，一定要在低温下进行。当温度低于8时，从200公斤孕妇尿中可提取约100克HCG粗品(活力为160u/mg)；当温度高于20时，从400公斤孕妇尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。此外，高温下制备的HCG粗品很难进一步纯化至3500u

29、/mg，原因是高温会使HCG受到微生物和/或糖苷酶的破坏。一般提高温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。小分子物质：5070；生物大分子：010，最好控制在04,（5）搅拌：搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。（6）氧化：一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。,（7）金属离子：蛋

30、白质的巯基还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法：用无离子水或重蒸水配制试剂；在配制的试剂中加入1-3mmol/L的EDTA(金属离子络合剂)。（8）抽提液与抽提物的比例：在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以51为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。,第二节 沉淀分离技术,沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子的原理是根据物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH值、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中有效成份的溶解度发生变化，从而达到从抽提液中

31、分离有效成份的目的。蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面有明显差异，所以制备这两种大分子时，所用的试剂和操作方法也不完全相同。,一.蛋白质的沉淀分离,（一）盐析沉淀法1.盐析的原理 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。,2023年10月16日星期一,SWAU,2.盐的选择：蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵

32、。硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小(25时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。,3.硫酸铵浓度的计算与调整方法:通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示(不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在 80%硫酸銨飽和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的

33、总体积，很难由浓度百分比來計算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种：（1）加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V=V0(S2-S1)/（1-S2）V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至5060，趁热滤去沉淀，再在0或室温平衡12天，有固体析出时达100饱和度。,(2)加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(S2-S1)/（1-AS2）S2，S1:分别

34、代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1L S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G,A：常数，与温度有关。实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0，25两张表，室温用25）,4.影响蛋白质盐析的因素：（1）蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2530g/L。（2）离子强度和离子类型的影响 a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来 c.离子强度相同时，高价离子，

35、半径小的离子盐析力强,（3）pH的影响 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。（4）温度的影响 a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；b.在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。一般在室温下进行盐析;温度敏感的蛋白质在低温4进行;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25比0时溶解度低，更容易盐析。,5.盐析时的注意事项：（1）添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不断搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀；（2）同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。盐析通常与等电点沉淀法配

36、合使用。（3）选择好温度，一般在室温下进行；（4）蛋白浓度不易过高，一般2530g/L；低浓度盐析，可用离心分离；高浓度盐析（7080），用过滤（因为粘度大，离心操作慢）；盐析沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。,（二）等电沉淀法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。,（三）有机溶剂沉淀法：作用机理：（1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；（2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶

37、剂是乙醇和丙酮。优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。,缺点：有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。,注意：（1)低温操作（2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。（3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pH，即与等电点共沉淀结合使用。（4)注意离子强度，离子种类的影响。,（四）选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液

38、中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。例如：利用加热，改变pH或加进某些重金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全面的了解。,（五）非离子多聚物沉淀法：聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌。沉淀机理：空间位置排斥效应。试剂溶解度大，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞机率。优点：（1）操作条件温和，不易引起变性；（2）具有极高的沉淀效率；（3）沉淀后多聚物容易除去。,二.核酸的提取与沉淀分离,核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶

39、剂沉淀法沉淀分离。从生物材料中分离出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白质（DNP）或RNA-蛋白质（RNP）复合物形式存在。因此，要制备初步纯化的核酸时，首先要分离出DNP或RNP，再将复合物解聚，除去蛋白质，然后通过沉淀法得到核酸。DNP 在0.14mol/L的氯化钠溶液中，RNP 的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的1%；当氯化钠的浓度达到1mol/L的时候，RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。,DNP,1.DNP/RNP复合物的解聚：主要采用加入去污剂、有

40、机溶剂和蛋白水解酶等试剂来实现。去污剂：在破碎细胞的溶液中，加入适量的阴离子去污剂SDS、Triton X-100、Tween 40 和 NP-40 等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，将DNP/RNP复合物解聚，进而释放出核酸。有机溶剂：苯酚、氯仿等是蛋白质的变性剂。根据抽提液中蛋白质的含量和溶剂的纯度，用变性剂反复处理抽提液，直到离心后，上层水相（含核酸）和下层有机相之间的界面处无变性蛋白为止。蛋白水解酶：用此法除去复合物中的蛋白质的操作比较温和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E，可以避免剪切和破坏核酸。,2.多糖的消除：采用动物或植物作材料提取核酸时，动物在宰杀前饥饿12h，植物在取材前

41、暗室培养数天，其体内的糖原和淀粉类物质均会减少。混杂于核酸提取液中的多糖类物质，一般可用选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）可达到分离目的。或用等体积的2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积的乙二醇甲醚处理，离心后，多糖位于中部，核酸存在上层乙二醇甲醚中。,3.RNA的提取：tRNA(约占细胞内RNA的15%)的相对分子质量较小，在细胞破碎以后溶解在水溶液中，滤液用酸处理，调节到pH5得到的沉淀的中可分离得到tRAN。mRNA占细胞RNA的5%左右，很不稳定，提取条件要严格控制。rRNA约占细胞内RNA的80%，一般提取的RNA主要是rRNA。由于RNA是基因表达过程中非常重要的

42、生物分子，如mRNA携带了DNA为蛋白质编码的信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。RNA的提取方法主要有稀盐溶液提取和苯酚溶液提取。,稀盐溶液提取：将细胞破碎制成细胞匀浆，然后用0.14mol/L的氯化钠溶液反复抽提，得到核糖核蛋白提取液，再进一步与脱氧核糖核蛋白、蛋白质、多糖等分离，可得RNA。苯酚溶液提取：在细胞破碎制成匀浆后，用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿在一定条件下振荡一定时间，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA，将RNA与蛋白质分开。,4.DNA的提取：从细胞中提取DNA，一般在细胞破碎后用浓盐法提

43、取。即用1mol/L的氯化钠溶液从细胞匀浆中提取脱氧核糖核蛋白，再与含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质。或者先以0.14mol/L氯化钠溶液(也可用0.1mol/L NaCl加上0.05mol/L柠檬酸代替)反复洗涤除去核糖核蛋白后，再用1mol/L氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白，经氯仿戊醇(辛醇)或水饱和酚处理，除去蛋白质，而得到DNA。,5.核酸的沉淀分离：核酸分离纯化应维持在0-4的低温度条件下，以防止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。常用的沉淀分离法有：(1)有机溶剂

44、沉淀法(2)等电点沉淀法(3)钙盐沉淀法(4)选择性溶剂沉淀法,（1）有机溶剂沉淀法：由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下来。(2)等电点沉淀法：脱氧核糖核蛋白的等电点为pH4.2；核糖核蛋白的等电点力；tRNA的等电点为pH5。所以将核酸提取液调节到一定的pH，就可使不同的核酸或核蛋白分别沉淀而分离。,(3)钙盐沉淀法：在核酸提取液中加入一定体积比(一般为1/10)的10%氯化钙溶液，使DNA和 RNA均成为钙盐形式，再加进1/5体积的乙醇，DNA钙盐即形成沉淀析出。(4)选择性溶剂沉淀法：选择适宜的溶剂，使蛋白质等杂质形成沉

45、淀而与核酸分离，这种方法称为选择性溶剂沉淀法。在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都进入水层，而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。在DNA与RNA的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中的RNA分离。,三.利用膜的分离技术,1.透析：透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质

46、，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。,影响透析速度的因素：（1）半透膜的通透性：常用的半透膜是玻璃纸或赛璐玢纸、火绵纸或其他改型的纤维素材料。（2）透析外液的更换：反复更换透析外液，增加透析速度；对流水透析，可进行初期透析；搅拌，使梯度差变得均匀，可增加透析速度。（3）温度：温度增加，则透析速度增加，但要注意生物活性。（4）压力：增加压力可加快透析速度，如真空透析。,2.超滤：利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩、不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。原理：在外力作用下，超滤膜对大分子物质的截

47、留主要是筛分作用，决定截留效果的主要是膜的表面活性层上孔的大小与形状。除了筛分作用外，膜表面、微孔内的吸附和粒子在膜孔中的滞留也使大分子被截留。使用中最需注意的问题是滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，使超滤速度减慢，被截留物质的Mr变小。,超滤的主要应用：浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。,梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法，适用于分离相对分子质量相差10倍以上的分子组分。在超滤过程中，虽然截留的大分子被浓缩，但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。,脱盐纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非

48、水性溶剂和小分子物质的过程。具体方法为：在溶液进行超滤的同时，不断向溶液中补充溶剂，补充溶剂的速度与溶液滤过速度相同，使体系始终保持恒定，这种方法又称透析超滤法。,超滤法的典型用途：A:对蛋白质、酶、DNA、单克隆抗体、免疫球蛋白进行浓缩和脱盐；B:药物、激素分离；C:从PCR扩增仪的DNA中去除引物；D:去除标记的氨基酸和核苷酸；E:HPLC样品制备；F:从样品中除蛋白；G:从生物体液、发酵肉汤培养基中纯化抗生素、激素和药物；H:从细胞悬液、裂解液中回收生物分子；I:对蛋白质、酶、细胞、DNA、生物分子、抗体和免疫球蛋白进行浓缩和脱盐；J:哺乳动物细胞的收集；K:清洗细胞、纯化病毒、去除细胞

49、碎片、除热原。,第三节 离心分离技术,离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广泛的应用，离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备.生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。,一.基本原理：离心力（centrifugal force，Fc）：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到的离心作用力“Fc”由下式定义：Fc=ma=m2 r a：粒子旋转的加速度，m：沉降粒子的有效质量，：粒子旋转的角速度，r：粒子的旋转半径(cm)。,

50、相对离心力（relative centrifugal force，RCF）:由于在转速相同的情况下，离心力会随离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟的转数（revolutions per minute,简写成r/min,或rpm）。,2,2,一般在低速离心时（转速小于5000 r/min），离心力的大小常用r/min来表示，而超速离心时则用g或g来表示。由于离心管中从管口到旋转中心的距离是不