生物制药工艺学第14章微生物药物制造工艺.ppt

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1、第十四章 微生物药物制造工艺,第一节 微生物药物概述,一.微生物药物的定义和发展 1.定义（Microbial Medicines）：微生物在其生命活动过程中产生的生理活性物质及其衍生物，包括抗生素，酶抑制剂，免疫调节剂等一类化学物质的总称，是人类控制感染等疾病，保障身体健康，以及用来防治动、植物病害的重要化疗药物。,2、发展,抗生素：(antibiotic）,1942年，Waksman首先定义：抗生素是微生物在其代谢过程中所产生的、具有抑制它种微生物生长及活动甚至杀灭它种微生物性能的化学物质,1947年,1948年,1950年,1952年,1953年,195080，我国译为抗菌素,1980年

2、后，抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素的不断发现，超出对微生物作用范围，又改译为抗生素,微生物来源的其他活性物质 酶抑制剂:亮肽素 bestatin 免疫抑制剂：环孢菌素A 羟基-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂：,二.微生物药物的分类,抗生素类药物维生素类药物氨基酸类药物核酸类药物酶与辅酶类药物酶抑制剂免疫调节剂甾体类激素,（P12页）,1.抗生素类药物的分类,根据抗生素的生物来源分类：（1）放线菌产生：链霉素,放线菌素（2）真菌产生：青霉素（3）细菌产生：杆菌肽（4）植物及动物产生：蒜素、黄连素,根据抗生素的化学结构（1）-内酰胺类抗生素 青霉素、头孢菌素、硫霉素、亚胺培南,（2）氨基糖苷类抗生素 链霉

3、素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素,（3）大环内酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素,（4）四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素,（5）多肽类抗生素 多粘菌素、放线菌素、杆菌肽,（6）多烯类抗生素 两性霉素、曲古霉素、制霉菌,（7）蒽环类抗生素 柔红霉素、阿霉素、正定霉素,（8）苯羟基胺类抗生素 氯霉素、甲砜氯霉素（9）环桥类抗生素 利福霉素（10）其他抗生素 磷霉素、创新霉素,根据抗生素的作用对象分类 抗革兰氏阳性细菌：青霉素、红霉素 抗革兰氏阴性细菌：主要有多粘菌素 抗真菌：制霉菌素、灰黄霉素、两性霉素 抗结核分枝杆菌：链霉素、新霉素、卡那霉素 抗癌:放线菌素D、博来霉素、阿霉素 抗病毒：四

4、环类抗生素、艾霉素(ehrlichin)抗原虫的抗生素 巴龙霉素、抗滴虫霉素、蒜素,根据抗生素的作用机制分类、抑制细菌壁合成：青霉素、影响细胞膜功能：多烯类抗生素、抑制核酸合成：如影响DNA结构的博来霉素、丝裂霉素C及柔毛霉素等；、抑制蛋白质合成：四环素、氯霉素、链霉素、抑制生物能作用：如抑制电子转移的抗霉素(antimycin)、抑制氧化磷酸化作用的短杆菌肽S(gramicidin S)和寡霉素(o1igomycin)等。,维生素B2维生素C-胡萝卜素,2、维生素,-胡萝卜素,3.氨基酸,目前大部分氨基酸可用发酵法生产,4.核酸类药物,如肌苷酸，腺苷酸，肌苷，腺苷等,5.酶与辅酶类药物,链激

5、酶、L-天冬酰胺酶,6.酶抑制剂,7.免疫调节剂8.甾体类激素,克拉维酸、洛伐他汀,三、微生物药物研发进展,1、寻找新的微生物资源 稀有放线菌 极端微生物 海洋微生物,分离放线菌的方法,通过 预处理的方法可以减少真菌及细菌的数量，增加放线菌的数量，如1）土样自然风干5至30天，可大大减少细菌的数量；2）风干土样在120干热处理1小时，可减少真菌、细菌的数量；3）综合处理，如用0.05的SDS（5mmol/L磷酸缓冲液配制）加1%的腐殖酸或6%的酵母膏，40 震荡20min。,一种产生antimycin的链霉菌（垂直型）,一种产生ankinomycin的链霉菌（松螺旋型）,一种产生deoxyla

6、idlomycin的链霉菌（双轮螺旋型）,稀有放线菌的分离,链霉菌已经有过太多研究，因此淘汰常见的链霉菌，增加“稀有”或特殊的链霉菌的出菌率就是一个重要问题，可采用1）从特殊环境（如酸碱性土壤、放射性地区、温泉等）采集样品；2）可在培养基中加入大剂量抗生素，如白霉素等；3）可加入特殊的碳氮源，如Vickers等曾发现棉子糖和组氨酸对一些“稀有”链霉菌有选择作用。,小单孢菌,小双孢菌,小四孢菌,2.新的筛选模型及手段 新药物作用靶标 微生物产物库 高通量筛选 虚拟筛选,3、组合生物合成技术的应用,酮基合成酶(KS)、酰基转移酶（AT）、脱氢酶（DH）、烯醇还原酶（ER）、酮基还原酶（KR）和酰基

7、载体蛋白（ACP）等功能域,4、代谢调控与基因敲除,5、基因改组（DNA Suffling）,第二节 抗生素制造工艺,-内酰胺类抗生素氨基糖苷类抗生素大环内酯类抗生素,一般制备过程,培养发酵：发酵液预处理固液分离,胞内产物 细胞破碎 固液分离 胞外产物 初步纯化 精制,初步纯化方法：沉淀、吸附、萃取、超滤精制方法：层析、电泳、结晶,选择方法依据,1、产品性质：化学组成、分子量、稳定性、溶解度、解离特性等2、主要杂质属性：3、方法前后衔接要求4、产品质量要求,一、-内酰胺类抗生素（一）结构与性质,a 青霉烷*b 青霉烯 c 头孢烷 d 头孢烯*e单环-内酰胺 f 碳青霉烷*g 碳青霉烯*h 碳头

8、孢烷 I 碳头孢烯 j 氧青霉烷*k 氧青霉烯 l 氧头孢烷 m 氧头孢烯*天然产物,九十年代各国首次应用的抗细菌杭生素共24种，其中有头孢菌素14种，碳青霉烯2种，青霉烯1种，一内酰胺酶抑制剂与其制剂1种，氨基糖苷、大环内酯与安莎类抗生索各2种。新上市的合成抗菌药共10种，包括喹诺酮类化合物9种和二氢叶酸还原酶抑制剂1种。,Site of penicillinase action.Breakage of the-lactam ring.,STRUCTURE OF PENICILLIN,共性：羧基有弱酸性：影响溶解度-内酰胺环不稳定,（二）、青霉素的制备,（A）、理化性质：1、溶解性：受pH影

9、响 游离酸：易溶于有机溶剂，难溶于水 盐：易溶于水，几乎不溶于有机溶剂2、酸碱性：有机弱酸,3、稳定性：温度、pH对其稳定性的影响,4降解反应,5、聚合反应 氨苄青霉素在水溶液中易形成聚合物，是氨苄青霉素过敏反应的主要过敏原之一。,6.过敏反应 可能为青霉噻唑多肽和青霉噻唑蛋白,（B）、制备工艺,1、菌种最早的原始菌种是点青霉菌(Penicillium notatum)；现用产黄青霉菌(Pen.chrysogenum)按菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。国内青霉素生产厂大都采用绿色丝状菌。,2、发酵工艺流程,丝状菌发酵工艺流程,3、提炼工艺流程,工业钾盐生产工艺流程,p581,5、提炼工艺要点

10、,1）发酵液预处理和过滤 放罐后，首先要冷却 目前采用鼓式过滤及板框过滤，加助滤剂。酸化时pH应控制得高些(pH45)，再加些絮凝剂如十五烷基溴化吡啶(PPB)等,过滤。随着高效高速萃取离心机的出现，如德国Westfalia公司出品的倾析器(decantor)，可革去过滤工序，比用板框过滤除去菌丝后再提取的收率高出23%。,2）影响青霉素提取的主要因素 青霉素提取效果除了已选定适当的有机溶媒，破乳化剂和离心分离设备外，还与下列主要因素有关:pH值 一般从滤液萃取到醋酸丁酯时，pH选择2.02.5，而从丁酯反萃取到水相时，pH选择6.87.2之间。温度 要求提取在低温(10以下)条件下进行较为有

11、利。在设备上要考虑用冷盐水进行冷却，以降低温度，特别是酸化岗位，温度要求更低些。,时间 酸化时速度应快些。碱化时速度可放慢些，因青霉素在中性下半衰期要长些，破坏要缓和些，故以能分离得清为原则。萃取方式和浓缩比 萃取剂和萃取方式选择 目前生产上采用二级逆流萃取方式。浓缩比的选择也很重要，因为丁酯的用量与收率和质量都有关系。丁酯用量为滤液体积的2530%时，色素相对含量低，浓缩比为1.52.5倍。,二、氨基糖苷类抗生素,(一)、结构与性质,胍基pK 11.5,甲氨基pK 7.7,链霉素的理化性质,1、溶解性：易溶于水，难溶于有机溶剂2、酸碱性：强碱性3、稳定性：较稳定 pH47溶液数周内稳定 pH

12、4.04.5最稳定 降解反应：酸、碱条件下水解出链霉胍等4、醛基反应：与伯胺形成席夫碱,在不同pH下各种型式的链霉素的平衡浓度,6,7,8,9,10,11,12,pH,%,100,80,60,40,20,Str-H33+,Str,Str-H22+,Str-H+,5、成盐：与磷钨酸、苦味酸、甲基橙等成盐沉淀，用于鉴别 与磺酸、羧酸、磷酸酯成盐，可溶于有机溶剂中，可用于溶媒萃取法。与某些盐形成复盐，用于精制，如：链霉素盐酸盐与氯化钙（在甲醇中）形成复盐，从甲醇中析出。复盐溶于水，可通过阴离子交换树脂（SO4）转为硫酸盐。,(二）、链霉素的制备,p585,影响工艺的因素,1.发酵液的过滤处理2 树脂

13、的吸附、洗脱3 活性炭脱色、低温浓缩,三、大环内酯类抗生素,（一）、概述：结构特点：以大环内酯为母体,共性：1、无色弱碱性化合物 2、微溶于水，在水中溶解度随温度上升而下降 3、酸性条件苷键易水解，碱性内酯环易破坏,（二）、红霉素的主要性质,1、酸碱性：二甲氨基呈碱性2、溶解性：易溶于醇、丙酮、氯仿、酯，微溶于乙醚和水，在水中溶解度55时最小3、稳定性：pH68最稳定,（三）、制备工艺,工艺要点：发酵液的预处理和过滤；树脂的吸附、洗涤和解吸、反萃取、结晶,四、四环类抗生素,（一）、概述结构上都含有四并苯母核,（二）、四环素性质,1、溶解性：在pH4.57.5之间难溶于水 游离碱能溶于吡啶、甲醇

14、、丁醇等有机溶剂和稀酸、稀碱 盐酸盐能溶于水，不溶或微溶于有机溶剂2、稳定性：干燥低温稳定 水溶液碱性条件下不稳定，酸性条件下（pH45）较稳定,3、化学反应 差向异构化：弱酸性pH26 脱水反应：较强酸性pH2时脱水 碱性条件下降解：弱碱性pH8，C环打开 螯合反应：与高价金属离子 成盐：四环素与尿素形成复盐，用于精制 与长链季胺碱成盐，带同萃取反应,（三）、提取工艺,工艺要点：发酵液的预处理中酸化的作用、纯化剂的选择；结晶与尿素复盐,第三节 其他微生物药物,一、微生物产生的酶抑制剂（一）-内酰胺酶抑制剂 克拉维酸 舒巴坦,克拉维酸，英文名称Clavulanicacid，简称CVA，又名棒酸

15、,1975年，美国哈佛大学教授Woodward提出如把青霉素和头孢菌素的骨架进行组合的青酶烯一定会有很强的抗菌活力的假说,S-oc-3-羟基乙叉取代基C-6 上没有酰氨基,1976年从棒状链霉菌的代谢产物中分离得到了克拉维酸，本身抗菌活性很弱，但与羟氨苄青霉素组成的复合剂奥格门汀、与羧噻吩青霉素组成的复合剂timentin都具有很好的协同作用，并应用于临床。,克拉维酸提取纯化工艺,工艺要点：萃取与浓缩 沉淀：与碱性有机胺成盐而沉淀析出；10，搅拌加入5%（2（二甲氨基）乙基）醚的乙醇溶液 转型,（二）降血脂作用的酶抑制剂：洛伐他汀-胆固醇的生物合成途径,洛伐他汀lovastatin,1223A

16、,2000年，降血脂药（降胆固醇药）成为全球第二大治疗药物类别，全年销售额达159亿美元，比同期增长21%。而他汀类降血脂药是降血脂药的主力军，主要品种有:辉瑞的Lipitor（阿伐他汀）默克的Zocor（辛伐他汀）BMS的Pravachol/Mevalotin（普伐他汀）拜耳公司的Lipobay/Baycol（西立伐他汀）诺华的Lescol（氟伐他汀）,Mevacor(洛伐他汀)1991年世界销售额为10.92亿美元，1992年为12.85亿美元，1993年达13.5亿美元，然后逐年下降，1998年为7.45亿美元，1999年下降到4.59亿美元，而到了2000年，洛伐他汀的销售额出现反弹，

17、上升到5.20亿美元，比上年增长了4.16%,并且这种反弹的趋势还将有一段延续。之所以会有这种变化，可能与洛伐他汀增加适应症有关。,氟伐他汀（Fluvastatin）为第二代调血脂产品，由瑞士山道士公司开发成功，上品名为来适可，1993年12月通过美国FDA批准，次年在英美上市。该药由诺华公司生产，1998年已在80多个国家地区上市，1996年获我国行政保护。2000年的全球销售额为4.283亿美元，较1999年增长了5.1%，占他汀类药物的2.8%。2001年来适可的全球销售额为4.82亿美元，同比增长了12.4%，日本田边的氟伐他汀也有近亿美元的收入。,洛伐他汀为第一个上市的HMG-CoA

18、还原酶抑制剂，它具有显著的降血脂效果，一般可使血浆总胆固醇下降30%40%，低密度脂蛋白下降35%40%，甘油三脂中等程度下降，还有升高高密度脂蛋白的作用。,溶解性：易溶于有机溶剂,游离酸不溶于水,洛伐他汀生产工艺,1,2,1.发酵液的预处理 发酵生成的洛伐他汀以游离酸为主，由于游离酸在水中的溶解性很小，因而大部分存在于菌丝体中。为将洛伐他汀溶出，可将发酵液调节至碱性，再过滤2.醋酸乙酯萃取3.硅胶柱层析,二、微生物产生的免疫调节剂 免疫抑制剂 环胞菌素A 免疫增强剂 乌苯美司,最早是1968年Lazary等从真菌中筛选到ovalicin 1969/1970年瑞士山道士公司分离光泽柱孢菌和多孔

19、木霉，产生具窄谱抗真菌活性的环孢菌素A。1978年首次应用于临床肾移植实验。1983年FDA批准上市。,微生物来源的免疫增强剂,1976年 Umezawa从橄榄网状链霉菌的发酵液种分离得到Bestatin。,三 微生物来源的具有神经保护作用的物质 难点：神经保护作用 血脑屏障四 微生物来源的受体拮抗剂 CytosporinA B C 从链霉菌分离得到的六肽类催产素受体拮抗剂,建议经常翻阅的有关期刊,1 Annual Review of Microbiology2 Antimicrobial Agents and Chemotherapy3 Journal of Bacteriology4 Jo

20、urnal of Antibiotics5 Biocatalysis and Biotransformation6 Current Opinion in Biotechnology7 Current Opinion in Chemical Biology8 Current Opinion in Microbiology9 Drugs10 Enzyme and Microbiology11 FEMS Microbiology Review12 Journal of Biotechnology13 Trends in Biotechnology14 Trends in Microbiology,建议经常翻阅的有关期刊,1 生物工程学报2 生物工程进展3 药物生物技术4 中国抗生素杂志5 国外医药抗生素分册6 中国医药工业杂志7 国外药学生化制剂分册8 全国工业微生物杂志9 药学进展10 抗感染杂志,