生化实验技术专题.ppt

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1、生化实验技术专题,主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离心技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。,目录,第一节 生物大分子物质的制备第二节 几类主要的生化实验技术第三节 蛋白质、核酸的检测,第一节 生物大分子物质的制备,一一般过程和原则,二注意事项,三纯化方案的设计和评价例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化,确立有效成分的测定方法材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的抽提有效成分的纯化和浓缩,生物大分子分离纯化的一般步骤和原则,层析法 电泳法 超离心法 透析和超滤,盐析（硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀

2、离心,前处理 粗分级 细分级,材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）,生物组织 提取液 粗产品,结晶,分子大小溶解度电荷性质吸附性质生物亲和力,依据原理,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,注意事项,基本原则：防止生物分子变性、降解 1控制适当的pH 2控制低温 3注意提取过程中的溶液环境 4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基,宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化,纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）,1、粗酶液 80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀 21 2980 1

3、41 2.64 694、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶 0.12 130 1072 19.70 3,第二节 几类重要的生化实验技术,一、层析技术二、电泳技术三、离心技术四、透析和超过滤,一层析技术（chromatography）,1层析技术一般原理2层析技术分类3常用层析技术及应用,层析技术原理,层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析,都是由互不相溶的两个相组成:一是固定相(固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度

4、等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的分配情况，一般用分配系数(distribution coefficient,Kd）来描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。物质在层析系统中的行为并不直接决定于其Kd，而取决于它的有效分配系数Keff:,层析法分类（按装置分类）,纸层析 薄膜层析 柱层析,氨基酸分析仪图解,气液色谱图解（gas-liquid chromatigraphy）,层析柱,恒温装置,载气（流动相）,样品）,进样室,检测器,记录仪,出口,高效液相层析（

5、HPLC）图解（high performance liquid chromatigraphy）,各类层析的原理和载体,类别 分离原理 基质或载体吸附层析 化学、物理吸附 硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析 两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析 分子筛效应的排阻效应 sepharose、sephadex离子交换层析 离子基团的交换反应 离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析 分离物与配体之间有 带配基的sepharose 特殊亲和力 或sephadex聚焦层析 等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）,几种主要沉淀方法比较,常用层

6、析技术及应用,吸附层析分配层析凝胶过滤（分子筛层析）离子交换层析亲和层析 聚焦层析,吸附层析（absorption chromatography）,原理：,载体：硅胶 氧化铝 羟基磷石灰,应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物质,以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。,分 配 层 析（distribuption chromatography）,原理：,载体：纤维素 硅藻土 硅胶,

7、应用：各种生化物质的分离鉴定,分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。,逆流分溶原理示意图,物质Y(Kd=1)的分配情况,溶剂 A,物质Z(Kd=3)的分配情况,溶剂 B,总量,总量,总量,总量,总量,总量,平衡后,转移 1,转移 2,转移 3,分溶管号,转移 4,上相转移,下相转移,上相转移,分子筛层析（gel-filtration chromatography）,基质 葡聚

8、糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（sepharose）,应用 测定分子量 脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子 除去热原物质,原理：凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。,分子筛层析原理示意图,分子筛层析与洗脱曲线,凝胶颗粒,收集蛋白质管,蛋白

9、质混合物,大分子,从柱上面加缓冲溶液,小分子,洗脱体积（Ve）,凝胶柱,大分子,小分子,Ve1,Ve2,V0,蛋白质Mr=49,000,洗出液中的蛋白质浓度,洗脱体积（mL）,未知,logMr,洗脱体积与相对分子质量的关系,Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo),离子交换层析（ion-change chromatography）,原理基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用 制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合,2.吸附阶段：样品与反离子进行交换,3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物

10、质,5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用,原始缓冲溶液的反离子,样品溶液,梯度浓度,离子交换层析原理示意图,NaCl梯度,梯度混合器,常用的阳离子交换剂,离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构,CM-纤维素（弱酸型）羧甲基,P-纤维素（中强弱酸型）磷酸基,SE-纤维素（强弱酸型）磺乙基,SP-纤维素（强弱酸型）磺丙基,常用的阴离子交换剂,AE-纤维素（弱减型）氨基乙基,离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构,PAB-纤维素（弱减型）对氨基苯甲酸,DEAE-纤维素 二乙基氨基乙基,DEAE-Sephadex 二乙基氨基乙基,DEAE-纤维素（强减型）二乙基氨基乙基,QAE-纤维素

11、（强减型）,二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基,（中弱减型）,（中弱减型）,亲和层析（affiuity chromatography）,应用 分离纯化酶、抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能,a.理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性,原理：,基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex,亲和层析原理示意图,蛋白质混合物,配体,与配体结合的蛋白质,加入的可溶性配基,专一性结合蛋白质,没有结合的蛋白质,基质,聚焦层析（Chromatofocusing）,该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度

12、环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。,层析时的聚焦效应示意图,几种主要层析方法比较,二、电泳技术,1电泳的一般原理 2.电泳技术的类别 3、常用电泳技术4、电泳技术的拓展,电泳的一般原理,电泳是带电颗粒在电

13、场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。,电泳技术分类,垂直板电泳,水平板电泳,圆盘电泳,常用电泳技术,1、醋酸纤维薄膜电泳2、聚丙烯酰胺凝胶电泳3、琼脂糖电泳 4、毛细管电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）,1、一般PAGE2、SDS-PAGE3、PAGE等电点聚焦,

14、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresis，PAGE）,PAGE是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶(PAG)作为支持物，采用电泳基质的不连续体系(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性)或 连续体系（一层凝胶、一种pH和一种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TE

15、MED 光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED 不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应,不连续PAGE的浓缩效应,样品,浓缩胶,分离胶,快离子,慢离子,蛋白质,A,B,C,+,+,-,-,SDS-PAGE,原理：当SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。

16、可用下式表示：Log Mr=a bmr应用:测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数,Mr（相对迁移率）,mr（相对迁移率）,Log Mr,等电点聚焦（isoelectric focusing）,原理:在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量,pH10,pH3,pI1=pH8,pI2=p

17、H7,pI3=pH5,-,+,线性梯度,琼脂糖电泳,琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，这种多糖链在1000C左右时呈液态，当温度下降到450C以下时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶用作电泳的固相支持物具有分子筛效应，其对生物分子的分离作用不仅与其分子的构象及其相对分子质量大小有关，而且与凝胶的浓度也有密切关系，故可根据分离对象分子量大小选择适当浓度的凝胶。琼脂糖电泳常用于核酸分离，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为2OObP至5Okb的DNA，琼脂糖凝胶还常用作免疫电泳的固相支持物。,不同浓度琼脂糖凝胶

18、分离DNA的范围,琼脂糖凝胶浓度(%)可分辨的线性DNA大小范围(kb)0.3 60-5 0.6 20-1 0.7 10-0.8 0.9 7-0.5 1.2 6-0.4 1.5 4-0.2 2.0 3-0.1,DNA相对分子质量标准物,水平型平板电泳槽,毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE),毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（2-75m）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。,毛细管电泳是近年来发展起

19、来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。,毛细管电泳原理示意图 毛细管电泳检测技术的发展 毛细管电泳分离模式的发展,毛细管电泳装置示意图,30KV高压电源,光源,光电倍增管,数据采集,石英玻璃毛细管,缓冲液-样品,缓冲液,正极,负极,毛细管电泳检测技术的发展,（一）紫外可见光吸收 石英毛细管因可透过20nm波长以下的紫外光，因此不仅允许从紫外到可见光这一波长范围内对样品组分进行检测。而且可将透光窗口直接开在毛细管上，进行“在柱”检测。（二）荧光检测法 是毛细管电泳

20、中一种常见的“在柱”检测法，尤其是激光诱导荧光检测法(LIF)，其灵敏度可高达10-1210-16mol/L-1，是目前毛细管电泳中最灵敏的一种检测方法。（三）电化学检测方法电导检测、电位检测、安培检测是电化学检测常用的三种方法，对电活性组分的检测具有灵敏度高、线性范围宽、选择性好以及价格低廉等特点。（四）集成毛细管电泳芯片 该项技术以晶体硅、玻璃、塑料(指有机玻璃)、陶瓷和硅橡胶为基本材料，借助毛细管电泳技术，将样品进样、反应、分离、检测等过程集成到一起的多功能化的技术，该项工作与分析仪器的微型化、小型化和集成化紧密相连,使得其能符合现代生物化学、制药工业的低成本和高产出的需求。,毛细管电泳

21、分离模式的发展,（一）毛细管区带电泳 又称毛细管自由电泳，毛细管内只充入缓冲溶液，在直流高压驱动下，溶质以不同的速率在分立的区带内进行迁移而被分离。可用于氨基酸、多肽、离子、对映体等物质的分析。（二）毛细管凝胶电泳 将板上的凝胶移到毛细管中作支持物而进行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用，溶质按分子大小进行分离。常用聚丙烯酸胺在毛细管内交联制成凝胶柱，可用于分离测定蛋白质和DNA等，但制备繁琐，使用寿命短。（三）毛细管等电聚焦(CIEF)将普通等电聚焦电泳转移到毛细管中进行，在高压作用下，毛细管内部建立pH梯度，蛋白质在毛细管中向各自的等电点聚焦，形成明显的区带，再通过检测器分别加以确

22、认，常用于分离离子型物质。（四）亲和毛细管电泳(ACE)建立在生物分子之间的亲和作用基础上，利用亲和分子（如抗原与抗体、酶与底物、配体与受体等）相互选择性，通过毛细管电泳来测定这些分子，从而具有高选择性和灵敏性。传统的亲和分析有很多优点，但在技术上操作繁琐，自动化程度低，测定周期长，因而亲和分析与毛细管电泳的联用正可弥补其局限性和缺点。,电泳技术的拓展,1、免疫电泳(immuno electrophoresis)2、单细胞凝胶电泳技术(single cell gel electrophoresis assay，SCGE)，又称彗星试验(Cometassay)3、双向电泳(two dimensi

23、onal electrophoresis，2DE)4、脉冲凝胶电泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)5、连续型逆向色谱电泳(continuous counteraction chromatographic electrophoresis，CACE)6、介体电泳(preparative electrophoresis)7、温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis）,双向电泳图谱,正常小鼠结肠组织蛋白质组的双向电泳,人胃癌SGC7901细胞蛋白质组的双向电泳,第一向：PAGE等电点聚焦（IEF），第二

24、向：SDS PAGE,连续型逆向色谱电泳(CACE)分离原理示意图,载液,色谱,阳极,阴极,目标产品富集区,填料（排阻区）,填料（嵌入区）,净速度,电泳,色谱,净速度,电泳,目标蛋白的迁移情况,三、离心技术,1离心机类别 普通离心机 1000转/分 高速离心机 2-3万转/分 超速离心机 3万转/分,2沉降系数（sedimentation coefficient,s）,3超离心法类别 密度梯度离心法（density gradient）沉降速度法（sedimentation velocity）沉降平恒法（sedimentation eguilibrium）,离心机结构示意图,转头,转头腔,沉降样

25、品,驱动马达,真空,冷冻,沉降系数（sedimentation coefficient）,生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。,数学定义式为：,沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于110-13介于10-13到20010-13s的范围，为方便起见，把110-13s作为沉降系数的一个单位，用Svedberg单位，用即S表示。,密度梯度离心法（density gradient）,生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒

26、沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。,滴加样品,离心管,蔗糖密度梯度,蔗糖浓度,1、核酸密度的测定=o+4.2 2(2-02)10-102、测定DNA中G-C之含量 Rolfe-Meselson公式：=0.100 xG-C+1.6583、溶液中核酸构象的研究：单链DNA双链DNA 蛋白质 双链DNA RNA4、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心,密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用,沉降速率法（sedimentation velocit

27、y）,在离心场的作用下，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方向（径向）移动，并产生沉降界面，界面的移动速度代表蛋白质的沉降速度。在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助适当的光学系统，如schlieren光学系统（也称暗线光学照相系统），观察到这种界面的移动。在schlieren光学系统中，利用溶液的折射率梯度（d/d）和样品的浓度梯度（dc/d）成正比这一特点，巧妙地设计光路，使移动的界面以峰形曲线呈现在照相图片上，峰顶代表移动界面。离心机的装置允许在离心机转头旋转时，对界面的移动进行观察和拍照。,分析型超速离心机,光源,柔性驱动轴,热敏温度计,样品池,准直透镜,液面,沉降界面,溶剂,配衡池,沉降

28、界面,聚光透镜,马达,滤光片,溶质,空气,沉降方向,照相机透镜,园柱型透镜,底板,Schlieren光闸,真空,冷冻,1,2,c,d/d,沉降平衡法（sedimentation eguilibrium）,在较低速度（8,000-20,000r/min）的离心场中，离心开始时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度。因而产生了扩散作用，扩散力的作用方向正与离心力相反，当净离心力与扩散平衡时，在离心池内从液面到池低形成一个由低到高的恒定浓度梯度。如果测得相关参数即可算出生物分子的分子量。,透 析（dialysis）,透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机

29、盐单糖等分开。常用的半透膜：玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper）火绵纸（赛璐玎纸,celloidin paper）其他改型纤维素材料,超过滤（ultrafiltration）,利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。,滤膜,抽气,滤膜,离心,A,B,蛋白质、核酸的定性定量检测,1、蛋白质的测定 凯氏定氮法（含N量 6.25）双缩脲法、Folin-酚法 紫外光度法（max=280nm）离心法、电泳法、层析法2、酶活力的测定 终点法、动力学法3、氨基酸的测定 茚三酮法 Sangerf法、Edmam法、DNS法4、核酸的测定 紫外光度法（max=260nm）分子杂交法 离心法、电泳法,