淋巴细胞标志检测.ppt
《淋巴细胞标志检测.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《淋巴细胞标志检测.ppt(69页珍藏版)》请在三一办公上搜索。
1、细胞免疫学检测(cellular immunoassay)一、淋巴细胞表面标志物检测(Assay of membran molecules for lymphocytes),一、免疫细胞分离技术(Technic of separation for immunocyte)二、免疫细胞表面标志检测技术(Assay of membran molecules for)三、免疫细胞功能检测技术(Assay for Immunocyte Tuntion)四、细胞因子与黏附分子检测技术(Assay for Cytokine and Adhesion molecule),免疫系统(Immune system)
2、,免疫器官(Immune Organs)免疫细胞(Immunocyte)免疫球蛋白(Immunoglobulin)主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex;MHC)细胞因子(Cytekine)白细胞分化抗原和粘附分子(Leukocyte Differentiation Antigen and Adhesion molecule),免疫细胞(immune cells),指:所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核吞噬细胞、树突状细胞及其他细胞,免疫细胞分离技术(Separation of immunocytes),人外
3、周血(peripheral blood)白细胞分离,一、原理(principle):红细胞/白细胞比例不同(6001000):1,密度不同,沉降速度不同。二、方法(method):1、自然沉降法(直立静置RT3060min,紧贴红细胞层上的白膜层)2、聚合物加速沉降法(加某些高分子物使RBC凝集成串加速沉降,如明胶),人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的分离,加入对倍稀释的血液样本,水平式离心20min时结果,聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque),(1.0770.001g/L),分离人外周血淋巴细胞以密度为1.077
4、0.001/g/L,Percoll混悬液(处理过的硅胶颗粒)原液密度(density)为1.135g/L+等量PBS,高速离心(centrifugation)由下而上的逐减的连续密度梯度(density gradient)淋巴细胞纯度98%,单核细胞纯度78%流程长,步骤繁,成本高,人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation),人外周血单个核细胞(PBMC)主含淋巴细胞,但混有单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯:(一)红细胞的去除(0.83%氯化铵、蒸馏水)(二)血小板的去除(离心、洗涤)(三)单核、粒细胞的去除(黏附去除,羰基铁粉吞噬)(四)淋巴细胞亚群的分离
5、,淋巴细胞亚群的分离,分离依据:1、淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志(specific membrane molecule/surface marker)2、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原(antigen of cluster differentiation;CD)分离方法:1、,Precipitation of E rosette,Erythrocyte Rosette forming cell;ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor(CD2)of sheep erythrocyte,which is called E re
6、ceptor for short.T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.Lymphocytes+sRBC,centrifugation-T lympho-cytes(底)/B lympho-cytes(界面),2、黏着性(理化):B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维(尼龙纤维)表面,而T淋巴细胞则不易附着(例)尼龙棉柱分离 直接流出的是T淋巴细胞。3、免疫学:用特异性抗体并使其固相化,捕获具特定膜抗原的细胞(例)1、亲和板结合分离(affinity)2、免疫磁珠分离(immunomagne
7、tic beads)3、流式细胞术分离(FCM),磁性微珠(magnetic beads):,磁性微珠是以金属离子为核心,外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体(直接法);也可标记羊抗鼠IgG抗体(间接法),使分离细胞的范围大大扩大,正选(positive selection)法:磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞负选(negtive selection)法:磁珠结合不需要的细胞,游离于上清液的细胞为所需细胞一般而言,负选法比正选法的磁珠用量大,评价(evalution):免疫磁珠分离法具有高纯度(8099),高得率(9095)、高细胞活性(9
8、9100%)的特点,仅次或相当于流式细胞仪(FACS)的分选效率。与FACS 相比,本方法操作简单、省时、经济;可用做FACS分选前的预分离,以减少FACS所用时间。另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度,通常可达9599。,注意事项(Attentions),如果分离细胞用作培养,全过程在超净台中完成。分离柱一般只能一次应用,再用时分离效率降低。抗体包被磁珠和死细胞常有非特异性结合,因而分选前应去除死细胞;上分离柱前,充分振荡混悬细胞,打散细胞团块。用分离柱分选,应用真空抽滤水,减少水中气泡,使分离柱不被气泡阻滞,荧光激活细胞分离仪原理(principle)(fluorescence a
9、ctivated cell sorter,FACS),细胞经荧光染色后,通过高速流动系统,细胞排成单行,逐个流经检测区。当细胞从流动室喷嘴处流出时,超声振荡搅动液流,使液流断裂成一连串的均匀小滴,每小滴内最多含一个细胞(其中只有百分之几的液滴中含细胞)。细胞经激光照射产生荧光和散射光,信号经计算机系统处理,分辨细胞的类型。如识别的是所需的细胞时(如T细胞),使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷,使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管。,评价(evalution):用FACS分离细胞准确快速、纯度高、回收率高,能保持细胞活力,并可在无菌条件下进行。仪器昂贵,极少用于常规,而多数仅作为研究的手
10、段,吞噬细胞(phagocytosis)分离,Phagocytes-mononuclear macrophage neutrophil、eosinophil、basophil分离(Separation):Mononuclear 参照Percoll分层液法 Macrophage 斑蝥敷贴(诱发无菌性皮炎)Other 很少分纯,树突状细胞(Dendritic cell),Dendritic cells(DCs)are the most potent antigen presenting cell(APC)known,which have numerous specialized features
11、that make them extremely efficient at capturing and presenting antigen and activating T cells and mediating immune response.树突细胞是体内功能最强的专职抗原提呈细胞,可把抗 原特异性地提呈给T淋巴细胞而产生抗原特异性免疫应 答。,树突状细胞(Dendritic cell)制备,DCs can be generated,in vitro,from many different samples of human beings.DCs only constitue 0.51.0
12、%of the peripheral blood mononuclear cells.DCs can be generated from monocyto/M+IL-4 and GM-CSFIdentifing DCs by CD marker,免疫细胞功能检测(Assays for immunocytes)一、功能简介二、测定方法,T lymphocytes,外周血中T细胞占淋巴细胞总数的65%70%来源于骨髓干细胞(胚胎期为卵黄囊和胎肝,Bone-marrow stem cells),在胸腺中发育和分化。分化成熟(be derived)后离开胸腺进入外周免疫器官的胸腺依赖区定居。淋巴细胞再
13、循环(recycle)(血液组织淋巴血液),T细胞亚群(Subset),根据TCR不同分为T细胞和T细胞根据表面标志和分化抗原的不同,T可分为CD4和CD8 T细胞CD4 T细胞根据其分泌的细胞因子和介导的功能在分为Th1和Th2CD8 T细胞依据其功能不同分为细胞毒性(cytotoxicity)T细胞和抑制性(suppresion)T细胞NK 1.1 T细胞专一识别脂类(lipid)抗原、非MHC限制,Type-I/2 T helper(Th1,Th2),Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-和TNF-,介导细胞免疫Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10,介导体液免疫Th1
14、和Th2是一对重要的调节(regulation)细胞,同时又互为抑制(inhibition)细胞,二类细胞的相互平衡(balance)与否直接影响(influence)机体的免疫功能,T-cytotoxic cells,Tc/CTL(1),CD8+T细胞免疫应答的主要效应(effect)细胞特异性杀伤靶细胞(target cells)在肿瘤免疫和抗病毒感染的免疫中发挥重要作用功能发挥受MHC I类限制,Tc/CTL(2),除细胞毒效应外,CTL还可分泌一系列细胞因子,调节(regulation)免疫功能;也分泌趋化性(tend to)细胞因子如IL-8、IP-10(IFN inducible
15、protein 10)、IP-1(巨噬细胞炎症蛋白)等,介导炎症反应(inflammatory reaction)。依据CTL分泌细胞因子的不同可分为Tc1和Tc2。,T-suppresion cells,Ts,通过过继转移实验(passive transfer test)加以确认(confirm)。可能(may be)作为单独的功能细胞群体存在多年来未能找到Ts特有(specific)的表面标志(surface marker)。,B淋巴细胞的分化成熟(be derived),骨髓干细胞前B细胞未成熟B细胞成熟B细胞激活B细胞浆细胞(plasma cells)经过Ig基因重排、活化、转录最终表
16、达BCR。(B-cell-receptor complex,BCR),前(pro/pre)B细胞,细胞浆出现链,并诱导轻链的重排(rearrange);不表达BCR不具有任何已知的生物学功能 BCR(B-cell-receptor):B-cell surface immunoglobulin and its associated signalling molecules,CD79a and CD79b.,未成熟(immature)B细胞,替代轻链(SL)preBCR 细胞质IgM 膜IgM膜IgM是B细胞分化成熟中首先出现的BCR,也是未成熟B细胞的表面标志此时B细胞具有识别(recognit
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 淋巴细胞 标志 检测
链接地址:https://www.31ppt.com/p-6310634.html