流式细胞术的原理和应用.ppt

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1、细胞因子及免疫细胞功能检测方法简介,刘素侠山东大学医学院免疫学研究所2011-2-23,内 容,细胞因子检测的常用方法免疫细胞功能的常用检测方法,一、免疫学检测的基本原理,抗原与抗体反应的特异性是各种免疫学检测技术的基本原理,二、细胞因子检测方法,细胞因子的临床意义常规测定法 胞内细胞因子检测方法细胞因子检测的主要临床应用,（一）细胞因子的临床意义,细胞因子与疾病：正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。细胞因子与治疗：重组细胞因子做为生物应答调节剂。已批准生产：I

2、FN-、，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在进行临床试验的：IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-等,（二）常规检测方法,分子生物学测定法 生物活性检测法 免疫化学测定法,1.分子生物学测定法,是测定细胞因子mRNA的表达水平，主要有两种方法：分子杂交技术多聚酶链反应技术（PCR）,分子杂交技术,制备细胞因子的基因探针；Northern 杂交或细胞原位杂交；优点：高度敏感和高度特异；缺点：操作较繁琐 测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。,多聚酶链反应技术（PCR）,PCR（polymerase chain reaction)技术，是

3、一种高效的基因体外扩增技术；将细胞因子产生细胞的RNA提取出来，再经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增；优点：灵敏度高 操作简便缺点：测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。,PCR原理,PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：dsDNA ssDNA退火(复性)：模板DNA与引物的互补配对延伸：DNA模板与引物按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新DNA 链新链又可成为下次循

4、环的模板,可将待扩目的基因扩增放大几百万倍,5,3,5,3,变性,退火,延伸,第二循环,dsDNA,ssDNA,加入引物,5,3,3,5,dNTP,Taq酶,5,3,5,5,3,3,3,5,5,3,5,5,反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR),RT,PCR,RT-PCR反应过程,反转录PCR：mRNA-cDNA-PCR抽提RNA 反转录合成cDNAPCR 扩增,RT反应体系,模板：总RNA，mRNA引物：随机引物，Oligo(dT)，基因特异性引物（GSP)逆转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase,PCR反

5、应体系,模板：逆转录产物cDNA目的基因特异性引物；反应混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg+,RT-PCR反应产物检测,凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性。酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究。分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变核酸序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法,实时荧光定量PCR(Fluorescence Quantified real time PCR),与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。,（1）原理,实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累

6、实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,1)常用名词概念,扩增曲线荧光阈值Ct值,扩增曲线,设定荧光域值,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号；荧光域值的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold=10 SDcycle 3-15 意义：大于荧光背景值和阴性对照荧光最高值，进入指数期的最初阶段；真正荧光信号：荧光信号大于阈值,荧光阈值（threshold）,Ct值,Ct值的含义是：扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数C代表Cycle（循环数）t代表threshold（荧光域值）,Ct值的确定,横坐

7、标：PCR循环数纵坐标：荧光信号强 度黑线：荧光域值红线：无模板-域值下一 直线绿线：样品Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值）,Ct值与起始模板的关系,研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,（2）常用标记方法,非特异性荧光标记：SYBR Green I特异性荧光标记：TaqMan Probe；分子信标,SYBR Green I染料法,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I染料法原理,注意事项,因为SYBR

8、 Green I可以与所有dsDNA结合而激发荧光，因此，如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体，也可以同时被检测，将导致结果不准确；关键：设计特异性引物！,结果判定融解曲线,（3）qPCR结果分析相对定量解析,1）相对定量的必要性,必须用内对照基因（管家基因）进行校正,2）管家基因筛选,管家基因：维持细胞生命活动代谢所必须的基因，如GAPDH,beta-Actin,18s rRNA等；筛选方法：根据文献提供；通过具体实验。,3）分析方法,双标准曲线法2-Ct法（Ct值比较法）,1）双标准曲线法,通过标准曲线对对照样品、待测样品目的基因及管家基因进行定量，然后根据公式计算相对值，即为相对表达

9、量。公式：,校正值,目的基因定量结果,管家基因定量结果,相对值,待测样品校正值,对照样品校正值,=,=,校正值,=,目的基因定量结果,校正值,=,管家基因定量结果,目的基因定量结果,校正值,=,对照样品校正值,待测样品校正值,对照样品校正值,=,待测样品校正值,对照样品校正值,优缺点,优点：分析简单，实验优化相对简单；缺点：对每一个基因，每一轮实验均需要做标准曲线；应用：基因表达调控研究,2）2-Ct法,2-Ct法：假设目的基因、对照基因扩增效率均是100%Ct（处理前/对照组）=18-17=1 Ct（处理后/实验组）=16-17.4=-1.4 Ct=Ct（处理后）-Ct（处理前)=-2.4

10、比率（处理后/处理前）=2-Ct=2-2.4=5.3结论：JUN处理后表达水平是处理前的5.3倍修正：扩增效率不是1，而是E，2-Ct可修正为（1+E）-Ct,优点,特异性好；简单、安全、自动化程度高；速度快、高通量；线性关系好、线性范围宽,2.生物活性检测法,测定细胞因子的生物学活性：刺激细胞增殖、维持细胞生长和存活、抑制细胞生长、溶解或杀灭细胞、抗病毒、促进细胞趋化、刺激细胞生成集落等活性；指示细胞：多选用造血系统或淋巴系统细胞，最好用依赖性细胞株细胞；显示细胞反应：用3H-胸腺嘧啶核苷参入，或用四唑盐转化引致的颜色反应。,（1）依赖性细胞株,一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖

11、，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的细胞因子；优点：敏感性高，特异性强；缺点：应用有限。,（2）功能检测,利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。优点：敏感性高；缺点：特异性不够，容易受一些扰因素的影响。,A.增殖或增殖抑制法,其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些指示细胞的增殖，通过3H-TdR掺入或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。,B.集落形成法,其基本原理是应用骨髓干细胞

12、体外半固体培养系统，根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。,C.直接杀伤靶细胞,细胞因子TNF-、TNF-具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细胞株L929，以WEHI164亚克隆13（鼠纤维肉瘤细胞系）作为指示细胞，通过3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。,D.抗病毒效应,靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击；常用的病毒是水疱性口炎病毒（vesicular

13、 stomatitis virus,VSV），敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株Hep2和羊膜的上皮细胞WISH，通过干扰素（IFN-、IFN-、IFN-）抑制病毒致病变的程度，计算出待测样品中IFN的活性单位。,E.趋化作用,IL-8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用，可用小室法或软琼脂趋化法，PMN或淋巴细胞作为指示细胞，以细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。,F.抗体形成法,IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生和分泌免疫球蛋白；指示细胞：分泌IgG的ARH-77、CESS 分泌IgM的SKW6.CL-4方法：在一定条件下，待检样品中IL-6水平与培养细胞上清IgG或IgM水平正

14、相关，通过标准IL-6的对照可推算出待检样品中IL-6的活性。,IL-2的诱生及生物活性测定（试验四）,一般方法,细胞因子敏感的细胞株 细胞因子的标准品及待测品指示剂：MTT，3H-TdR酶联免疫吸附测定仪测定OD值绘制标准曲线标准品50%最大OD值找出与标准品50%最大OD值相对应的标准品稀释度(S)找出与标准品50%最大OD值相对应的待测品稀释度(A)待测品单位数=S/A标准品单位,稀释度,OD值,1/8 1/4 S 1/2 A 1,100%OD,50%OD,标准品,待测品,对生物学活性测定法的评价,优点：灵敏度高；测定的是有生物活性的细胞因子缺点：维持靶细胞株，操作繁杂和难定量 特异性差

15、 实验周期较长 易受其它因素的影响,3.免疫化学测定法,用来检测细胞因子蛋白质的抗原特性，利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。基本原理是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。免疫标记技术,RadioimmunoassayImmunofluorescence酶免疫分析(EIA)：ELISA：体液中的细胞因子 免疫组织化学 ELISPOT：分泌细胞因子的T细胞（频率）,60,（三）胞内细胞因子检测方法,测定的是细胞因子的前体分子，是单一细胞行为；一般要用先

16、活化细胞，使之合成欲测细胞因子。在活化过程中加入蛋白质运输抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲尔德菌素A，阻止了细胞因子分泌，提高了胞内检测的阳性率；检测方法：ELISPOT 荧光标记：荧光显微镜或FCM,活化剂,活化T细胞：除特异性抗原外，主要植物血凝素(PHA)、巴豆酯(PMA)、离子霉素（ionomycin）、钙离子载体A23187、T细胞受体抗体或CD3的抗体等；活化B细胞：特异性抗原，脂多糖（LPS）、金黄色葡萄球菌肠内毒素A、B细胞受体抗体；活化单核细胞：LPS和某些细胞因子。,人外周血单个核细胞IL-17A流式检测方法,人外周血单个核细胞（PBMC）的分离；调整细胞浓度

17、接种24孔板或96孔板；加入Brefeldin A，PMA和ionomycin（离子霉素），进行细胞培养；一定时间后，收集细胞进行表面抗原染色（如CD4或CD8）、固定和通透、细胞内细胞因子染色、流式细胞仪测定和结果分析。,(1)抗凝静脉血,(2)加等量NS,(4)密度梯度离心,(3)混匀后，缓慢加于分离液上,图1.表达IL-17和IFN-的CD4+T细胞分析,图2.CD4+T细胞表达转录因子FoxP3的检测,（四）细胞因子检测的临床应用,机体免疫状态的评估；疾病预后及治疗监测指标；病理变化和损伤机理研究；辅助诊断。,三、常用免疫细胞功能检测方法,评价机体的特异性和非特异性免疫功能,内容,淋巴

18、细胞的功能检测 T细胞功能检测 B细胞功能检测 NK细胞功能检测吞噬细胞功能检测免疫细胞功能检测的临床应用,（一）淋巴细胞功能检测,淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验；体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定,淋巴细胞,T细胞：介导细胞免疫B细胞：介导体液免疫NK细胞：固有免疫,1.T细胞功能检测,体外实验：T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验.体内试验,（1）T淋巴细胞增殖试验,A.原理：,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细

19、胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,B.刺激物,特异性刺激物：异种抗原：破伤风类毒素、链球菌激酶、纯化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，PPD）和白色念珠菌 同种组织抗原：HLA非特异性刺激物：PHA：人T细胞 ConA：小鼠T细胞 PWM：T、B细胞 LPS：B细胞,T细胞,非特异性抗原刺激,植物血凝素(PHA)-人刀豆蛋白A(ConA)-小鼠,淋巴母细胞化,核酸、蛋白合成增加细胞体积增大分裂、增殖,模拟特异性抗原刺激下T细胞的分裂、增殖过程反映T细胞功能和机体细胞免疫水平,常用方法,形态计数法,同位素掺入法,CCK-8法,MTT法,FCM法,第4次实验,形

20、态计数法,外周血或分离的淋巴细胞,PHA,涂片染色,共培养,形态学观察计算转化率,方法评价,优点：简便易行，普通光学显微镜便能观察结果。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。,同位素掺入法,外周血或分离的淋巴细胞,PHA,共培养,DNA合成增加,3H-TdR,3H掺入到DNA中,液体闪烁仪检测信号,SIPHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值,优点：敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。,CCK8法(Cell Counting Kit 8),外周血或分离的淋巴细胞,PHA,共培养,DNA合成增加,CCK-8,

21、存活细胞内线粒体脱氢还原酶,还原CCK-8,水溶性、黄色甲躦颗粒,光密度值,酶标仪,MTT法CFSE染色检测淋巴细胞增殖,(2)T细胞分泌功能测定,体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。,(3)T细胞介导的细胞毒实验,T细胞介导的细胞毒性是致敏的T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用。评价机体细胞免疫水平；测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一；选用适当的靶细胞，常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃

22、癌等细胞株，经培养后制成单个细胞悬液，按一定比例与受检的淋巴细胞混合，共温一定时间，观察肿瘤细胞被杀伤情况。,A.原理：,靶细胞抗原,T细胞,观察杀伤活力,致敏CTL,靶细胞,形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞同位素法：淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定射线,B.方法,意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力,（4）体内试验,特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验,2.B细胞功能检测,B细胞增殖能力的试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验,(1)B细胞增殖能力检测,抗IgM细菌脂多糖SPA,B细胞增殖,形态学,3HTdR掺入法,（2）体外抗体形成

23、细胞检测,微量溶血分光光度法测定抗体形成细胞QHS 溶血空斑实验 PFC液相小室法 固相琼脂法ELISPOT检测特异性抗体形成细胞功能,溶血空斑试验,又称为PFC（Plaque forming cell）测定技术，是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。分为直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验；直接溶血空斑试验：测定产生 IgM 型抗体的细胞，只加细胞和补体；间接溶血空斑试验：检测产生 IgG 或 IgA的细胞，加靶细胞、显斑剂、补体；显斑剂：抗各类 Ig 高纯度的抗血清,原理,将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分

24、子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。,溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响;评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。,B细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法,该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。,(4)体内实验,体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。,染色计

25、数,离心取上清测LDH或AKP,离心取沉淀测活细胞荧光,测发光强度,测CPM值,形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法,3、NK细胞活性测定,靶细胞溶解,常用靶细胞:K562细胞株,（二）吞噬细胞功能检测,吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法中性粒细胞功能检测技术巨噬细胞功能检测技术,1.中性粒细胞的功能检测,细胞趋化功能的检测吞噬和杀菌功能的检测,(1)细胞运动功能趋化功能检测,原理：,方法：,琼脂糖平板法,滤膜渗透法（Boyden 小室法）,(2)吞噬和杀菌功能测定,显微镜检查法：,NBT还原试验,硝基蓝四氮唑，又称四唑氮蓝(nitroblue

26、tetrazolium,NBT)，是一种水溶性的淡黄色活性染料，可被中性粒细胞的酶还原为非水溶性的蓝黑色甲月替(Formazan)颗粒,沉淀于胞浆内；细菌、真菌和寄生虫感染时，中性白细胞还原NBT的能力增高；病毒性感染或非感染性疾病则不增高；NBT还原试验作为诊断全身性感染的一种辅助方法，并作为判定嗜中性白细胞杀菌功能的指标，以诊断吞噬功能缺陷症。,2、巨噬细胞功能检测,炭粒廓清试验：正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。

27、,（2）吞噬功能检测,巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。,（3）巨噬细胞溶酶体酶的测定,酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法非特异性酯酶的测定 常用-萘醋酸法,（4）细胞毒作用测定,用IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。,（三）临床应用,反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。,thank you,