柠檬酸摇瓶发酵及提取byLeMon.ppt

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1、柠檬酸摇瓶发酵及提取,生技08-2班L3eMon小组廖维华 刘露 刘豫宁 麻佳佳,实验目的：1、学习掌握柠檬酸液体发酵工艺2、了解柠檬酸提取工艺3、增强团队协作能力,柠檬酸：C6H8O7物化性质：白色结晶粉末，无臭。熔点(),153。味极酸，在潮湿的空气中微有潮解性。它可以以无水合物或者一水合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。加热到78 时一水合物会分解得到无水合物。加热至175 C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。所以，柠檬酸提取过程中，温度控制很重要。,分子式：,实验原理,高度亲水性,实验原理,柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料

2、经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。但就柠檬酸产生菌（黑曲霉菌）而言，在实验pH下，其顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸。,柠檬酸的发酵的过程,80%的糖代谢走EMP途径,黑曲霉中存在TCA的酶系,柠檬酸发酵的条件1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖；2、合适的pH值，黑曲霉在pH为23的环境中发酵糖，产物以柠檬酸为主；当pH接近中性时则大量产生草酸，而柠檬

3、酸产量很低；3、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速200r/min）。,生产菌种：黑曲霉 Aspergillus niger半知菌亚门，丝胞纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属。真菌中的一个常见种。生长适温37，最低相对湿度为88%柠檬酸产量最高的菌种。且能利用多样化的碳源。生产方法：深层液体发酵法发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化,实验流程 斜面 发酵培养基,接种,补糖,4d,28,提取,（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）,（摇床）,（每48h补一次）,2C6H8O7H2O+3CaCO3 Ca3(C6H5O7)24H2O+3CO2+H2O 中和终点pH:6.06.8温度：507

4、0,菌液过滤中和酸解 过滤脱色去金属离子浓缩结晶,Ca3(C6H5O7)24H2O+3H2SO4+4H2O 2C6H8O7H2O+3CaSO42H2O，85在此温度下各种变体石膏的溶解度均最小），并有利于形成片状 的半水石膏，便于过滤,加热至8090加热的作用：终止发酵；使蛋白变性凝固，降低发酵液黏度；使菌体中的柠檬酸释放,活性炭，13%，85，搅拌30min,强酸型阳离子交换树脂,5060，常压浓缩易分解成乌头酸，且结晶色泽变深,提 取 工 艺 流 程,1、菌种：黑曲霉 Aspergillus niger2、培养基：PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基,发酵培养基(土豆 200g 煮汁、蔗糖20

5、g、NH4NO3 2g，KCl 0.15g，MgSO4 0.25g，水1000ml；pH=5)3、器材：三角瓶2个，棉塞2个，纱布若干，接种环，小烧杯，水浴加热锅，离心机，离心管，PH试纸，电子天平，滤纸，大试管,电炉（加石棉网）,摇床,玻璃棒，无菌tip头，移液枪，碱式滴定管，电子显微镜4、试剂：无菌水，酚酞，0.14290.1430 mol/L NaOH溶液，CaCO3，10%H2SO4，40%蔗糖溶液,实验器材,实验步骤,2、发酵培养基配制及分装（以实验室为单位）,配方：土豆 200g 煮汁、蔗糖20g、NH4NO3 2g，KCl 0.15g，MgSO4 0.25g，水1000ml；pH

6、5（总糖100 g/L；基础 20 g/L+补糖 80 g/L）,分装：每小组2瓶，每瓶100ml；棉塞或8层纱布；0.08Mpa，20min,3、制备孢子悬液及接种（以小组为单位）,向每支斜面菌种加入5ml无菌水，用接种环刮菌苔表面或用无菌tip头轻轻吹打制备孢子悬液；将悬液接入灭菌并冷却至室温的培养基。,注：勿接入过多孢子，否则菌丝过于浓密，影响产酸和后处理中的过滤,4、摇瓶发酵、补料及参数检测,摇瓶条件：200rpm，32；发酵4天补料：发酵48h补糖，每瓶（100ml）加入灭菌40%蔗糖液27ml。参数检测：接种后每24h取样测定、记录发酵液pH。,5、发酵液酸度测定,酸度 是指100

7、ml发酵液所含柠檬酸的克数。,酸度测定方法：取发酵液滤液或离心液1ml，以酚酞为指示剂，用0.14290.1430mol/L标准NaOH溶液滴定至淡粉红色，所消耗的NaOH毫升数即为发酵液酸度。,（通过对柠檬酸酸度的测定，可以推出从葡萄糖到柠檬酸的转换率。）,6、柠檬酸提取（部分）,1）2C6H8O7H2O+3CaCO3 Ca3(C6H5O7)24H2O+3CO2+H2O,2）Ca3(C6H5O7)24H2O+3H2SO4+4H2O 2C6H8O7H2O+3CaSO42H2O,3）浓缩结晶,C6H8O7H2O 分子量 210.14CaCO3 分子量100.1 Ca3(C6H5O7)24H2O

8、分子量 570.50 硫酸 分子量98，比重1.84,1g 柠檬酸0.714g 碳酸钙1.357g 柠檬酸钙0.7g 浓硫酸=0.38ml 浓硫酸=3.8ml 10%硫酸,柠檬酸的产量可以根据酸度值算出,中和,酸解,菌丝过滤,发酵液经24层纱布过滤（如需要可再用滤纸过滤一次）或经离心（菌丝球很小的过滤太慢）取滤液；测量滤液体积；将发酵液倒于小烧杯，置70水浴加热。,中 和,根据酸度测定结果计算出滤液中所含柠檬酸克数，并计算出与柠檬酸反应所需的CaCO3的量；称取CaCO3，慢慢将CaCO3加入发酵液中，轻轻摇动烧杯，反应至不再有气泡产生，pH6.06.5。用滤纸过滤，得白色柠檬酸钙；柠檬酸钙结

9、晶呈成簇的针状。如果发现所得结晶有杂色（如发黄），可将柠檬酸钙结晶从滤纸上刮至小烧杯，加适量水，洗后再次过滤。,酸解 将柠檬酸钙结晶从滤纸上刮至小烧杯，加适量水调成“糊”，将小烧杯放85水浴中加热。根据计算，向小烧杯中慢慢加入所需10%H2SO4，边加边轻轻摇动烧杯，使反应进行彻底。过滤，将滤液收集到大试管（过滤时可将试管插在试管架上），滤液即为柠檬酸溶液，用于下一步浓缩结晶。滤纸上的白色物为硫酸钙结晶，显微镜下呈片状或针状。,浓缩与结晶,将大试管中的柠檬酸液倒入小烧杯，置电炉（加石棉网）上加热，煮沸浓缩。待观察到浓缩液中有少许白色晶体出现（此时已为过饱和，浓缩液易向外喷溅），即可停止加热，令

10、浓缩液冷却；在冷却过程中，柠檬酸逐渐从浓缩液中结晶析出。滤纸过滤，得柠檬酸结晶；柠檬酸结晶显微镜下呈针状。,准备1、发酵培养基2、补料用40%蔗糖溶液 配制200ml，分装于2个250ml三角瓶3、标定用NaOH标准溶液 配制200ml，装蓝盖瓶4、酚酞指示剂 0.1g溶于250ml 70%90%酒精，装蓝盖瓶,计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸发酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。总反应式：2C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O,实验结果,1、观察孢子萌发、菌丝球的生长情况（进行拍照）2、接种后每24h取样测定、记录发酵液pH值3、发酵4天后取样测定酸度（计算后面要用的CaCO3以及H2SO4用量）4、中和后照下柠檬酸钙照片，酸解后照下硫酸钙照片5、浓缩结晶后照下柠檬酸钙照片6、通过柠檬酸酸度计算柠檬酸发酵转化率,实验分工,