教学课件：第四章-DNA的复制.ppt

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1、第四章 DNA 复制,思考：为什么子女长的像自己的父母？,研究DNA复制的目的,子代DNA为什么能够真实地获得亲代DNA的遗传信息？复制过程如何进行？复制如何控制？,有许多问题有待于进一步研究,如何为复制的DNA解螺旋提供能量？如此众多的反应如何由一种复制体来催化完成？如何防止和校正复制过程中的错误？已经解开的单链可能产生链内碱基对，怎么办？巨大的DNA分子特别是超螺旋DNA分子给复制带来许多几何学问题？如：E.coli复制速度为850bp/s（50000bp/min），DNA模板以此速度解旋，则相当于每小时开70英里的汽车引擎的转动速度。,内容提要,第一节 概述第二节 细菌DNA的复制第三节

2、 真核DNA的复制第四节 端粒复制第五节 其他DNA复制方式,第一节 DNA复制的概述,半保留复制复制的起点和方向DNA的半不连续复制RNA引物DNA复制的酶体系DNA合成的高保真性,一、半保留复制（Semi-conservative Replication）,1、半保留模型的提出：1953 Watson&Crick：DNA双螺旋模型；DNA 复制的半保留模型,2、DNA复制的三个模型：半保留模型；全保留模型；分散模型,3、半保留模型的证实：Meselson and Stahl（1958）,3、半保留模型的证实：Meselson and Stahl（1958）,14N-14N,14N-15N,

3、15N-15N,15NH4Cl,14NH4Cl,20 min,40 min,重带(下部),15N/15N,中带(中间),15N/14N,轻带(上部),14N/14N,中带(中间),15N/14N,4、半保留复制机制 复制时DNA双螺旋的两条链解开，并分别作为模板指导互补链的合成。每个子代DNA的一条链来自亲代的DNA，另一条链则是新合成的。,Semi-conservative,二、复制的起点和方向,1、复制起点（origin）：复制起始处的特定DNA序列2、复制终点（termini）：复制终止处的特定DNA序列3、复制子（replicons）：DNA复制起点到两端终点的DNA单位,origin

4、,terminus,原核生物基因组：一个复制子,origin,terminus,真核生物基因组：多个复制子,4、复制方向：双向复制：单一起点的双向和多起点的双向（腺病毒：单向）,origin,terminus,双向复制（Bidirectional replication）在同一复制起点两个复制叉以相反的方向移动单向复制（Unidirectional replication）单个复制叉从复制起点处向一个特定方向移动,复制叉 replication fork 双螺旋DNA 两条亲本链分开使复制进行的部位复制泡 replication bubbles 复制时，两个复制叉合起来像一个小泡,5、复制的速

5、度：原核生物：50000bp/min真核生物：10003000bp/min,成熟前起始（快速生长的原核细胞内）,Continuous,semidiscontinuous,and discontinuous models of DNA replication,三、DNA的半不连续复制,1968年，Okazaki，半不连续复制模型1、半不连续复制（semidiscontinuous replication）前导链的连续合成和滞后链的不连续合成的复制模式,2、前导链（leading strand）以5-3方向连续合成的DNA 链3、滞后链（lagging strand）总体上沿着3到5方向延伸，但以

6、小片段形式(5-3)不连续合成，最后共价连接起来4、冈崎片段（Okazaki fragment）在不连续复制中产生的短片段，随后被连接成完整的链 E.coli 1000-2000nt 真核生物 100-200nt,四、RNA引物（RNA primer）,1、定义 与一条DNA链配对的短核苷酸序列(通常是RNA)，提供自由3-OH末端，使DNA聚合酶开始合成DNA链。,2、功能RNA引物可以提供3-OH末端作合成新DNA链起点；提高了DNA复制的准确性。,3、引发活动前导链(leading strand):引发酶（primase）滞后链(lagging strand):引发体（primosome

7、）引发酶：在DNA复制中合成RNA引物的一种RNA聚合酶引发体：指在半不连续DNA复制中，每个岗崎片段合成引发反应中涉及的蛋白质复合体。引发体能沿着DNA 移动，参与连续的引发反应。,五、DNA复制的酶体系（一）参与DNA复制的蛋白质1、DNA解旋酶（DNA helicase）作用：解开双链；ATPase Dna B(E.coli)2、单链结合蛋白（ssb）作用：防止单链退火（在原核细胞中表现出协同效应）,3、引发酶（primase）：如Dna G(E.coli)4、DNA连接酶（DNA ligase）催化DNA链的两个末端的共价连接；需要能量：NAD（E.coli）/ATP（真核）5、拓扑异

8、构酶6、DNA聚合酶,（二）DNA聚合酶催化的聚合反应1、以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物催化合成DNA2、需要模板(3 5)和引物的存在3、不能从头合成新的DNA链（必须有3-OH末端）4、催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端5、催化DNA合成的方向是5 3,（三）大肠杆菌的DNA聚合酶,5种：DNA聚合酶 I、II、III、1、DNA聚合酶 I（1）发现：Arther Kornberg 1958，分离出DNA聚合酶I 1970-1971，分离出DNA聚合酶II、III,Klenow片段：DNA聚合酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为68000，有聚合酶活性，并

9、有35外切酶活性,（2）多种酶的活性：5 3 DNA 聚合酶活性3 5 核酸外切酶活性 5 3 核酸外切酶活性,5 3 DNA 聚合酶活性,3 5 核酸外切酶活性 作用：即时的校对（Proofreading）功能,5 3 核酸外切酶活性 作用：DNA 损伤修复（切除嘧啶二聚体）；去除引物（切口平移）,切口平移（Nick translation）,DNA聚合酶I结合在切口处去除引物（5 3 核酸外切酶活性）的同时填充缺口（聚合酶活性）DNA连接酶封闭切口,DNA pol I 不是复制酶聚合反应的速度慢(20 nt/sec)持续合成的能力不高,2、DNA聚合酶 III,（1）DNA聚合酶 III的

10、活性5 3 DNA 聚合酶活性3 5 核酸外切酶活性(校对功能)（2）DNA 聚合酶III 是复制酶 持续合成的能力高 聚合反应的速度快,（3）Composition of E.coli DNA Polymerase III Holoenzyme,subunit环状的二聚体“滑动的夹板 使全酶的持续性很高,DNA聚合酶III-形成不对称的二聚体，使前导链、滞后链的合成可同步进行,回环模型:滞后链模板形成了一个回环，使环中RNA引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制,DNA聚合酶总结：DNA聚合酶 I：DNA修复的主要酶DNA聚合酶II：参与DNA的修复DNA聚合

11、酶III：DNA复制酶DNA聚合酶、：涉及DNA的错误倾向修复,六、DNA合成的高保真性DNA聚合酶对底物的选择功能复制出错时有即时的校对功能(35外切酶功能）RNA引物的作用DNA损伤的修复机制,第二节 细菌DNA复制,“”型复制 环状DNA的复制方式，即从复制起点开始，双向同时进行，形成样中间物环节：DNA复制的起始 DNA链的延伸 DNA复制的终止,一、复制的起始（一）复制起始复合体 DnaA（起始点结合蛋白)DnaB（解旋酶）SSB DnaC（装载解旋酶和引发酶）HU（识别并刺激OriC 形成开链）Gyrase（促旋酶）-拓扑异构酶,（二）复制起始区的结构特点 1、富含AT 2、3个1

12、3bp的重复序列-解链的位点 3、4个9bp的重复序列-DnaA结合位点,（三）复制起始引发的过程：1、DNA复制起点双链解开，形成复制叉,DnaA+ATP,DnaB,DnaC,OriC,（富含AT）,313bp重复序列,49bp重复序列,DnaA结合位点,HU+ATP,ATP,过程：（1）约20个DnaA结合在49bp重复序列（2）DnaA复制起始复合物使13bp重复序列变性，形成开链（3）DnaB与单链DNA结合（需要DnaC帮助），进一步解开DNA双链，形成复制叉,2、RNA引物的合成 leading strand:primase（引发酶）lagging strand:primosome

13、 引发体（引发前体primase）引发前体：n蛋白、n蛋白、n”蛋白、i蛋白、dnaB蛋白和dnaC蛋白 3、DNA聚合酶将第一个dNTP加到引物的3-OH末端,二、复制的延伸,SSB,DnaGprimase,DnaBhelicase,Pol III（/）,引发体（primosome）,Pol I、ligase,复制体（replisome）in vivo,（一）DNA复制体(replisome)DNA聚合酶全酶分子、引发体和解旋酶构成的复合体（二）其他两种酶DNA 聚合酶 I：去除引物，填补缺口DNA 连接酶,（三）DNA聚合反应的特征1、DNA的聚合反应是以dNTP为底物，以3 5 DNA为

14、模板，按碱基配对原则在3-OH上加dNTP（DNA聚合酶对碱基的选择功能）2、需二价正离子如Mg，3-OH作亲核进攻形成磷酸 二酯键3、链沿5 3方向延长4、碱基互补配对，若错配则切除掉,（四）防止拓扑学问题两种机制1 DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和2 DNA拓扑异构酶(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA,AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCA,terD/terA,terC/terB,Replication fork 1,Replication f

15、ork 2,tus gene 产物,复制终止区：,200 kb,（DnaB inhibitor),复制叉相遇位点,三、细菌DNA复制的终止,（一）终止位点 一侧复制叉的终止位点位于相遇点的另一侧（二）终止机制 1、Tus蛋白的作用：可与终止序列结合，阻止复制叉继续前移 2、两个复制叉在相遇点相遇 3、两个复制叉在复制快的复制叉的终止点相遇（三）分离（segregation）Topoisomerase IV：使复制叉解体，释放子链DNA,第三节 真核生物DNA复制,一、概述（一）复制与细胞周期 S期 早：常染色质，中：异染色质，晚：着丝粒和端粒,（二）实验系统：SV40、酵母、非洲爪蟾的卵母细胞

16、（三）复制频率 每个细胞周期复制一次,成熟前起始（快速生长的原核细胞内）,（四）复制与核小体 1、复制叉形成时DNA从核小体解离，组蛋白八聚体解聚 2、复制叉通过后新、旧组蛋白与DNA重新组装成核小体,二、真核生物DNA复制的起始,（一）复制起始点（多个）酵母：自动复制序列（ARS）特点：11bp的保守序列（富含AT）（起始位点识别复合体 ORC）,（二）复制子簇（cluster of replicons）特点 1、由多个复制子组成，20-50个串联排列 2、同一复制子簇内的复制子基本同步起始,三、真核生物DNA复制的延伸（一）相关酶和蛋白质 1、解旋酶（Mcm2-7，SV40 T抗原）2、单

17、链结合蛋白（RP-A，replication protein A）3、连接酶 I（DNA ligase I）4、PCNA（proliferating cell nuclear antigen）-增殖细胞核抗原 相当于大肠杆菌DNA聚合酶III的亚基，能形成环状夹子，大大增加了聚合酶持续合成的能力 5、聚合酶,（二）真核生物DNA聚合酶1、DNA Pol（作用：复制的引发）复合体（Pol/引发酶）（1）引发酶活性 合成前导链和滞后链每个冈崎片段的RNA引物（2）53聚合酶活性 可继续延长DNA（a few hundred nt）但很快 被 Pol、pol代替,2、DNA Pol（1）53聚合酶活

18、性：前导链合成（2）3 5 核酸外切酶活性：校对功能3、DNA polymerase（1）53聚合酶活性：滞后链合成（2）3 5 核酸外切酶活性：校对功能,Probable Roles of Eukaryotic DNA Polymerase,四、真核生物DNA复制的终止 1、终止位点：不存在使复制叉终止和解聚的终止位点 2、终止机制：复制终止通过复制叉的相遇而终止,真核DNA的复制,1、组蛋白的去除：组蛋白的修饰 2、复制前复合物的形成3、复制许可 Mcm2-7是复制许可因子，CDK可使之磷酸化,4、DNA的解旋：解旋酶（Mcm2-7，SV40 T抗原）；拓扑异构酶和可在复制叉前松弛正超螺旋

19、5、前导链和滞后链的RNA引发：pol 6、聚合酶的切换,7、前导链和滞后链的延伸8、引物的去除：FEN-1（RNase H1）,9、缺口填充，冈崎片段 连接10、组蛋白沉积,第四节 端粒DNA的复制,一、线状DNA末端复制问题,5,3,5,3,5,3,5,3,5,5,5,线状DNA末端复制问题1、复制后产生粘性末端（sticky end）：滞后 链的5端引物切除后，因没有3-OH存在 DNA聚合酶无法将缺少的部分补齐2、染色体不稳定3、染色体末端隐缩：DNA每复制一次，DNA 就缩短一次讨论：环状DNA是否存在末端复制问题？,二、真核生物染色体 DNA末端复制（一）端粒（Telomere）1

20、、概念：是真核生物染色体末端的一种特殊结构 2、组成：端粒DNA/端粒蛋白（1）端粒蛋白：非组蛋白（2）端粒DNA：a、含数百个短的正向重复序列，富含GC b、形成特殊的二级结构,人的端粒DNA序列：（TTAGGG）n,3、作用（1）稳定染色体结构（2）防止染色体末端融合（3）保护染色体结构基因（4）避免遗传信息在复制过程中丢失,附：端粒长度-分子钟(molecularclock)的作用 随着细胞不断分裂，端粒的长度越来越短，当 达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性，阻止细胞进一步分裂的信号便发出。细胞将发 生凋亡（apoptosis）,（二）端粒酶 1、组成（1）蛋白质：逆转录酶（2）R

21、NA：约150nt，部分序列与端粒DNA互补，可作为合成端粒DNA的模板（端粒酶是自身携带RNA模板的逆转录酶）2、功能：负责端粒DNA的延长，维持端粒的长度,3、存在部位：在生殖细胞和肿瘤细胞，才可以检测到具有活性的端粒酶4、端粒酶和衰老、肿瘤有关,（三）端粒DNA的复制 1、已存在的端粒DNA的复制：与其它部分DNA复制一起完成 2、端粒DNA的延长 主要由端粒酶完成（1）G链（G-rich strand）的合成（2）C链（C-rich strand）的合成,RNA template,（1）G链的合成,G链的合成 1 端粒酶与端粒DNA结合，端粒中的RNA与凸出的 G链3端的TTG配对 2

22、 以端粒酶的RNA为模板，在G链3从头合成DNA 3 延伸6个核苷酸 合成一个重复单位后，端粒酶向新合成的DNA 3端移动，端粒酶中的RNA再与3端的TTG配对。进行多个循环，G链3端形成多个短的重复序列,（2）C链的合成 两个模型,a、G链末端回折，形成发夹结构；DNA聚合酶延伸b、Pol a/引发酶合成RNA引物;pol 延伸;,DNA polymerase,引物合成,延伸,引物切除,3,5,C链的合成 1 引发酶以G链3端为模板合成一段引物 2 DNA聚合酶以G链为模板，补齐C链缺口 3 去除引物，在G链3端留下一个1216个核苷 酸的overhang（突出端）,3.端粒长度的控制：PO

23、T1,TRF1 和 TRF2(1)POT1(protection of telomeres)结合 3 端单链 DNA(2)TRF(TTAGGG repeat-binding factors)TRF1 和 TRF2 结合双链 DNA,端粒长度控制模型A、端粒足够长时，结合在3的POT1多，阻碍了端粒酶的活动B、端粒短时，结合在3的POT1少或没有，端粒酶的活动不受抑制,（四）端粒的形成1、端粒DNA在与端粒蛋白共同作用下自身回折，在染色体的末端形成一个大的DNA套索结构，即T-环(telomere loop)。2、端粒G链3单链末端取代了端粒上游区域的相同序列，形成D-环,TRF1：使DNA发生

24、弯曲并回折TRF2：稳定D-环,3、端粒DNA与端粒蛋白（非组蛋白）结合,附：真核生物DNA复制的特点1、复制速度慢：50nt秒，为原核生物的1102、多个复制起始点，可同时进行复制（并非所有复制子 都同时复制）3、一个细胞周期只复制一次；而原核生物可不停复制，复制可以成熟前起始4、引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。真核长约 100-200nt，原核长约1000-2000nt,第五节 其他 DNA复制方式,一、滚环形（rolling circle）复制 噬菌体（例 X174）、真核rDNA、细菌F因子1、概念：环状DNA的一种复制模式，复制叉沿环形模板复制一定次数，每个反应中新合成的链将前一

25、反应中合成的链抛出，形成与环状模板链互补的一系列线性序列。,5,2、复制过程：1、复制起始于某一条DNA链上 2、新生DNA链延伸，不断取代母链 3、复制一圈，产生单位长度的线性DNA链 4、若复制继续进行，5不断甩出，可产生 多单元线性DNA链3、复制方向：单向复制,4、被取代链的命运：（1）按单位长度切割则产生单体，单体可继续转化为环形双链形式；（2）按多聚体长度切割则产生一系列由基本复制单位串联而成的各种形式(线形、双链环状等),二、D-环型（displacement loop）动物线粒体/植物叶绿体基因组DNA 1、特点：（1）双链复制不同步（2）起始点异位（H链、L链各一）,H,L,

26、哺乳类 D-loop：500-600bp线粒体：一个-多个D-环叶绿体：2个D-环,2、复制过程（1）L链首先合成：在H链上的复制起点处开始合成，以D-环的形式取代原来的L链（2）L链片段的继续合成：D-环扩展（3）H链合成开始：当取代环达mtDNA的2/3时，L链上 的复制起点暴露，H链开始合成（4）复制的完成：L链的合成提前完成，H链的合成随 后结束,三、末端型（strand displacement）复制 线性基因组：腺病毒/噬菌体29 1、特点：（1）末端起始，不需要合成RNA引物；（2）两条链不同步复制,2、末端蛋白（TP）的作用（1）与DNA 聚合酶结合（2）携带一个C作为引物,3

27、、复制过程,3,5,3、复制过程：（1）起始 末端蛋白(TP)与DNA 聚合酶结合,并携带一个C 作为引物（2）复制叉移动（3）复制达到末端时一条单链被置换出来（4）末端反向重复序列配对，形成双螺旋（5）以被置换的单链为模板合成DNA,Question,作业：名词解释：半保留复制、半不连续复制、冈崎片段、前导链、滞后链、复制子、复制叉、复制泡、端粒酶、型复制、滚环复制、Klenow 片段简答题1、简述原核生物DNA复制起始的过程2、简述DNA聚合酶及其功能3、保证DNA复制真实性的机制有哪些4、简述端粒、端粒酶的作用以及端粒DNA延长的机制,思考题：1.真核生物与原核生物复制有哪些不同？2.“”型复制和滚环复制有哪些不同点？3.PCR与DNA复制有哪些相同点和不同点？4.说出DNA复制起始有关的五种重要的酶或蛋白并简述它们的功能。5.DNA复制过程中，后随链的复制过程6.简述真核生物 DNA复制中，端粒复制与染色体其他部分DNA复制的异同和生物学意义7.简述染色体端粒复制的问题，人正常细胞和癌细胞的端粒复制有何不同？,